Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

Resumo

Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Resumo

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose , doença com manifestações clínicas variáveis que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A infecção por L. donovani pode resultar em doença visceral fatal. No Panamá, Colômbia e Costa Rica, L. panamensis é responsável pela maioria dos casos relatados de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Estudar um grande número de candidatos a fármacos com as metodologias disponíveis até o momento é bastante difícil, uma vez que são muito trabalhosos para avaliar a atividade de compostos contra formas intracelulares do parasita ou para realizar ensaios in vivo . Neste trabalho, descrevemos a geração de cepas de L. panamensis e L. donovani com expressão constitutiva do gene que codifica para uma proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrada ao locus que codifica para o 18S rRNA (ssu). O gene que codifica a eGFP foi obtido a partir de um vetor comercial e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para enriquecê-lo e adicionar sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. O amplicon da eGFP foi isolado por purificação em gel de agarose, digerido com as enzimas BglII e KpnI e ligado ao vetor de expressão de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido com o mesmo conjunto de enzimas. O vetor de expressão com o gene clonado foi propagado em E. coli, purificado, e a presença da inserção foi verificada por PCR de colônia. O plasmídeo purificado foi linearizado e utilizado para transfectar os parasitas L. donovani e L . panamensis. A integração do gene foi verificada por PCR. A expressão do gene eGFP foi avaliada por citometria de fluxo. Os parasitas fluorescentes foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência foram selecionados por citometria de fluxo.

Introdução

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença com uma ampla gama de manifestações clínicas. Essa doença é prevalente em 98 países, e sua incidência anual é estimada em 0,9 a 1,6 milhão de^casos1. As espécies de Leishmania patogênicas para o homem são divididas em dois subgêneros, a saber, L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infecção por algumas espécies pertencentes à L. Subgêneros (Leishmania), como L. donovani e L. infantum, podem resultar em leishmaniose visceral (LV), que é fatal se não tratada². Espécie....

Protocolo

Para manter as amostras estéreis, todas as etapas que envolvem a cultura do parasito devem ser realizadas dentro de um capô de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou de acordo com as normas locais de saúde e segurança. Um resumo gráfico desse protocolo pode ser encontrado na Figura 1.

Figura 1: Esquema resumo do protocolo para geração de parasitas L. panamensis e L. donovani que expressam eGFP usando a família de vetores pLEXSY-....

Resultados

Depois de construir a construção pLEXSY-eGFP e transformar células de E. coli competentes, as colônias contendo a construção com a inserção de eGFP gerarão um produto de aproximadamente 859 pb após a execução da PCR de colônia descrita na seção 1.2 (Figura 3A). A digestão total do plasmídeo purificado das colônias positivas usando SwaI deve dar dois fragmentos característicos em eletroforese em gel, um fragmento de 2,9 kbp que é a porção do vetor PLEXSY contendo todos os el.......

Discussão

As vantagens e desvantagens de vários genes repórteres têm sido estudadas em vários protozoários parasitas. Dentre elas, a GFP e a eGFP são intrinsecamente fluorescentes e permitem fácil quantificação e obtenção de imagens. A atividade fluorescente dessas proteínas pode ser detectada com manipulação mínima usando microscopia de fluorescência, fluorimetria ou citometria de fluxo. Poucos estudos foram realizados para gerar L expressando GFP. (Viannia), apesar da robustez demonstrada da GFP e seus derivado.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplacas de 96 poços	Corning	CLS3340	Fundo plano transparente, poliestireno preto, estéril, tampa
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Sal de ampicilina sódica	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, adequado para cultura de células
BglII enzima de restrição	New England BioLabs	R0144S	2.000 unidades. 10.000 unidades/mL
Frascos de cultura de células	Corning	CLS430168	Área de superfície 25 cm2, gargalo inclinado, tampa (vedação de encaixe)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Não disponível
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	pó, BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, ≥ 99,5%
Soro Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F7524
Buffer de Carregamento de Gel	Sigma-Aldrich	G2526	A taxa de migração varia com a composição do gel. Diluir 1:3 a 1:6 com amostra antes de carregar.
Sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	O sistema é composto por uma unidade principal, dois módulos acessórios, o extensor de capacitância (módulo CE) e o controlador de pulso (módulo PC) e uma câmara de cubeta ShockPod.
Cuvetes de Eletroporação Gene Pulser/MicroPulser	Bio-Rad	1652086	Pkg de 50, 0.2 cm– cubeta de eletroporação estéril gap, para uso com os sistemas Gene Pulser e MicroPulser, para células de mamíferos e outras células eucarióticas
Solução de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL em água deionizada, líquido, 0,1 μ m filtrado, BioReagent, adequado para cultura de células
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
Solução HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células
Microscópio invertido	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF enzima de restrição	New England BioLabs	R3142S	4.000 unidades. 20.000 unidades/mL
LB Caldo com ágar	Sigma-Aldrich	L3147	Meio de crescimento microbiano rico em nutrientes altamente referenciado com ágar, adequado para ágar regular  E.coli cultura.
LB Caldo	Sigma-Aldrich	L2542	Meio de crescimento microbiano líquido
Mini-Sub Cell GT Sistema de Eletroforese Horizontal	Bio-Rad	1640300	Mini sistema de eletroforese horizontal, inclui pentes de 8 e 15 poços, bandeja transparente UV de 7 cm x 10 cm
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressando mRNA eGFP fundido com 1 repetição em tandem de uma sequência de 50 bases
pLEXSYcon2.1 kit de expressão	Jena Biociência	EGE-1310sat	Contém vetor de expressão constitutiva integrativa pLEXSY-sat2.1. Seleção antibiótica de transfectantes com Nourseotricina (NTC, clonNAT). Contém todos os primers para PCRs de diagnóstico e sequenciamento.
Cloreto	Potássio Millipore	529552	Grau de Biologia Molecular - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
Sistema Miniprep de Plasmídeo PureYield	Promega	A1222	Até 15 μ g de plasmídeo pronto para transfecção de culturas de 3 mL.
Schneider′ s Inseto Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Meio utilizado em nosso laboratório para cultura de Leishmania.
SOC Médio	Sigma-Aldrich	S1797
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S3014	para biologia molecular, DNase, RNase e protease, nenhum detectado, ≥ 99% (titulação)
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, ≥ 99,0%, de fluxo livre, enzima de restrição Redi-Dri
SwaI	New England BioLabs	R0604S	2.000 unidades. 10.000 unidades/mL
Filtros de seringa	Corning	CLS431212	membrana de celulose regenerada, diam. 4  mm, tamanho do poro 0,2  μ m
T100 Termociclador	Bio-Rad	1861096	Sistema de termociclador, inclui termociclador de 96 poços, cabo de alimentação, anel de suporte de tubo
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Une duas fitas de DNA com extremidades coesivas ou rombas
Tris-Borato-EDTA tampão	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, adequado para eletroforese, concentrado 10&vezes;
Wizard Genomic DNA Kit de Purificação	Promega	A1120
Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza PCR	Promega	A9285
XL10-Gold Células Ultracompetentes	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Células Ultracompetentes, 10 x 0,1 mL. Apresenta o gene de resistência à canamicina no epissomo F', para clonagem extremamente exigente em vetores resistentes ao cloranfenicol. Eficiência: > 5 x 10 9 transformantes/µ g DNA pUC18.