Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

Resumo

Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Resumo

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose , doença com manifestações clínicas variáveis que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A infecção por L. donovani pode resultar em doença visceral fatal. No Panamá, Colômbia e Costa Rica, L. panamensis é responsável pela maioria dos casos relatados de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Estudar um grande número de candidatos a fármacos com as metodologias disponíveis até o momento é bastante difícil, uma vez que são muito trabalhosos para avaliar a atividade de compostos contra formas intracelulares do parasita ou para realizar ensaios in vivo . Neste trabalho, descrevemos a geração de cepas de L. panamensis e L. donovani com expressão constitutiva do gene que codifica para uma proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrada ao locus que codifica para o 18S rRNA (ssu). O gene que codifica a eGFP foi obtido a partir de um vetor comercial e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para enriquecê-lo e adicionar sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. O amplicon da eGFP foi isolado por purificação em gel de agarose, digerido com as enzimas BglII e KpnI e ligado ao vetor de expressão de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido com o mesmo conjunto de enzimas. O vetor de expressão com o gene clonado foi propagado em E. coli, purificado, e a presença da inserção foi verificada por PCR de colônia. O plasmídeo purificado foi linearizado e utilizado para transfectar os parasitas L. donovani e L . panamensis. A integração do gene foi verificada por PCR. A expressão do gene eGFP foi avaliada por citometria de fluxo. Os parasitas fluorescentes foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência foram selecionados por citometria de fluxo.

Introdução

Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença com uma ampla gama de manifestações clínicas. Essa doença é prevalente em 98 países, e sua incidência anual é estimada em 0,9 a 1,6 milhão de^casos1. As espécies de Leishmania patogênicas para o homem são divididas em dois subgêneros, a saber, L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infecção por algumas espécies pertencentes à L. Subgêneros (Leishmania), como L. donovani e L. infantum, podem resultar em leishmaniose visceral (LV), que é fatal se não tratada². Espécies pertencentes ao L. Os subgêneros (Viannia) estão associados à maioria dos casos de leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose tegumentar americana (LCM) nas Américas Central e do Sul, particularmente no Panamá, Colômbia e Costa Rica, sendo a L. panamensis o principal agente etiológico dessas apresentações clínicas ^3,4.

A quimioterapia anti-leishmania existente que inclui drogas como antimoniais pentavalentes, miltefosina e anfotericina B é altamente tóxica e cara. Além disso, o aumento da resistência aos fármacos nas últimas décadas tem se somado aos fatores que interferem no tratamento efetivo dos pacientes em todo o^mundo5. Diferenças substanciais têm sido demonstradas entre as espécies do gênero Leishmania em relação à suscetibilidade a drogas, especialmente entre espécies do Novo e do Velho Mundo ^6,7. Por essas razões, é necessário direcionar esforços para a identificação e desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania, com especial atenção às abordagens espécie-específicas. Estudar grandes bibliotecas de candidatos a fármacos com metodologias tradicionais é bastante difícil, uma vez que essas metodologias são muito trabalhosas para avaliar a atividade de compostos contra amastigotas intracelulares ou para realizar experimentos in vivo8; Portanto, tem sido necessário o desenvolvimento de novas técnicas que reduzam essas desvantagens, incluindo a implementação de genes repórteres e o desenvolvimento de ensaios de triagem fenotípica de alto conteúdo⁹.

O uso de genes repórteres mostrou o potencial de aumentar a eficiência do processo de triagem de drogas, pois facilita o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento e in vivo. Parasitas recombinantes de Leishmania expressando vários genes repórteres têm sido gerados por vários grupos de pesquisa. Genes repórteres, como β-galactosidase, β-lactamase e luciferase, têm sido introduzidos em várias espécies de Leishmania utilizando vetores epissomais, mostrando utilidade limitada para triagem de drogas nas formas extra- e intracelulares do parasita10,11,12,13,14,15. Essas abordagens têm a limitação de exigir uma forte pressão seletiva em cultura para evitar a eliminação do construto epissomal, bem como o uso de reagentes adicionais para revelar a atividade do gene repórter. Por outro lado, a proteína fluorescente verde (GFP) e sua variante, a proteína fluorescente verde reforçada (eGFP), têm sido utilizadas na geração de um grande número de cepas transgênicas de Leishmania para ensaios de triagem in vitro de fármacos devido à sua flexibilidade e sensibilidade, bem como à possibilidade de automatizar o processo de triagem por citometria de fluxo ou fluorometria^{15, 16,17,18,19}. Apesar dos resultados promissores, as culturas dessas cepas transgênicas foram altamente heterogêneas em seus níveis de fluorescência, uma vez que o número de cópias do gene GFP não foi o mesmo em todos os parasitas. Além disso, a manutenção da fluorescência exigiu pressão seletiva constante sobre os parasitas em cultura, uma vez que o gene GFP foi introduzido em uma construção epissomal.

Pelas razões expostas anteriormente, muitos esforços têm se concentrado no desenvolvimento de novas metodologias para a produção de cepas recombinantes estáveis. Esses esforços têm se baseado principalmente na integração de genes repórteres em locos ribossomais, aproveitando as maiores taxas de transcrição de genes ribossomais²⁰. Cepas de L. infantum e L. amazonensis foram geradas integrando os genes que codificam para β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² e tdTomato²³, e foram avaliadas quanto à sua utilidade em ensaios de triagem de fármacos. Vários grupos desenvolveram cepas de L. donovani que expressam a GFP constitutivamente, integrando seu gene codificador ao locus do RNA ribossomal 18S (locus ssu) através de recombinação homóloga^24,25; apresentaram expressão estável e homogênea de GFP na população transfectada, incluindo amastigotas intracelulares 24,25, e foram implementadas com sucesso em ensaios de triagem de drogas^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 desenvolveram cepas de L. major e L. infantum expressando GFP como um transgene integrado. Eles utilizaram o vetor de integração pLEXSY, originalmente projetado para a expressão transgênica de proteínas em um sistema usando L. tarentolae como hospedeiro²⁸. O vetor pLEXSY-GFP tem se mostrado muito eficiente para a geração de diferentes cepas de Leishmania expressando constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. Nesses parasitas, a fluorescência é homogênea e mantida nas formas intracelulares, podendo ser detectada em lesões de coxins plantares de camundongos^infectados27.

Neste trabalho, descrevemos a metodologia utilizada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene que codifica para eGFP como um transgene integrado usando o sistema pLEXSY. As cepas geradas por esse processo são utilizadas em nosso laboratório para a realização de ensaios de triagem de fármacos que avaliam a potencial atividade anti-leishmania de moléculas de origem natural e sintética.

Protocolo

Para manter as amostras estéreis, todas as etapas que envolvem a cultura do parasito devem ser realizadas dentro de um capô de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou de acordo com as normas locais de saúde e segurança. Um resumo gráfico desse protocolo pode ser encontrado na Figura 1.

Figura 1: Esquema resumo do protocolo para geração de parasitas L. panamensis e L. donovani que expressam eGFP usando a família de vetores pLEXSY-2.1. Todas as seis seções principais descritas no artigo são descritas aqui. 1) Amplificação e inserção do gene eGFP no vetor pLEXSY-2.1: o gene alvo é amplificado, adicionando-se os sítios de reconhecimento das enzimas KpnI e BglII, e tanto o amplicon eGFP quanto o plasmídeo pLEXSY são sequencialmente digeridos com ambas as enzimas para posterior ligadura com T4 ligase. 2) Linearização do plasmídeo de expressão pLEXSY: a construção pLEXSY + eGFP é digerida com SwaI para linearização e purificação do de expressão de 7-8 kbp. 3) Transfecção e 4) seleção policlonal: Promastigotas de Leishmania são transfectados com de expressão por eletroporação e recolocados em cultura para seleção antibiótica de parasitas recombinantes. A fluorescência do parasita é confirmada por citometria de fluxo. 5) Confirmação da integração genômica e 6) clonagem por diluição limitante: a integração do de expressão pLEXSY-eGFP é confirmada por PCR diagnóstico, usando um primer forward hibridizando para o de expressão e um primer reverso hibridizando para uma sequência cromossômica ausente no de expressão. Culturas transfectadas podem ser enriquecidas para parasitas fluorescentes por clonagem limitando a diluição, e clones com as maiores intensidades fluorescentes médias podem ser selecionados para aplicações posteriores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Amplificação e inserção do gene eGFP no vetor pLEXSY-2.1

1. Amplificação do gene eGFP
   NOTA: Como este protocolo utiliza a família de vetores pLEXSY-2.1 (ver Tabela de Materiais) para a expressão constitutiva de proteínas-alvo após a integração do de expressão no locus cromossômico 18S rRNA (ssu) de espécies de Leishmania , o primeiro passo é introduzir no gene eGFP as sequências contendo os sítios de restrição que permitem sua inserção nos vetores pLEXSY-2.1. Neste caso, como a eGFP só precisa ser expressa citosolicamente, os sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI foram adicionados nas extremidades 5' e 3' do gene eGFP, respectivamente. A clonagem com KpnI resulta na fusão da proteína-alvo a um tag de poli-histidina C-terminal de seis resíduos, seguido por um códon stop codificado no plasmídeo pLEXSY-2.1 para posterior purificação da proteína de interesse. Por esta razão, a sequência de primers reversos não contém um códon de parada.
   1. Dependendo da fonte plasmidial para eGFP, analise a sequência alvo usando uma ferramenta de análise de restrição como NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ para certificar-se de que ela não contém sítios internos para as enzimas de restrição usadas para clonagem (BglII e KpnI) ou para SwaI, que é a enzima usada para linearização vetorial antes da transfecção.
   2. Projetar primers forward e reverse para amplificação de eGFP contendo as sequências de restrição BglII e KpnI. Como exemplo, a fonte de eGFP para esse protocolo foi o plasmídeo pEGFP-N1-1X³², e as sequências de primers foram as relatadas por Bolhassani et ^al.27:
      Primer para a frente (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (local de restrição BglII em negrito).
      Primer reverso (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (site de restrição KpnI em negrito).
   3. Amplificar o gene alvo usando uma polimerase de alta fidelidade para garantir a preservação da sequência codificante. Como exemplo, para os primers EGFP1 e EGFP2, execute o protocolo de ciclagem de PCR como relatado por Bolhassani et ^al.27. Executar uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 57 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Adicionar os primers a uma concentração final de 0,2 μM.
   4. Purificar o fragmento utilizando um kit de purificação convencional do produto PCR ou precipitação padrão de acetato de sódio e etanol, conforme descrito em outra parte³³.
2. Inserção da eGFP no vetor de expressão pLEXSY-2.1
   1. Corte as extremidades do produto eGFP-PCR usando BglII e KpnI, seguindo as instruções do fabricante.
      1. Primeiro, configurar a reação para a enzima que requer a menor concentração de sal (neste caso, KpnI), de acordo com as instruções do fabricante, e incubar a 37 °C por 1 h.
      2. Em seguida, adicione 100 mM de NaCl e 10 unidades de BglII e incube por 15 min. Purificar a reacção, tal como descrito no passo 1.1.4.
   2. Digerir o vetor de expressão pLEXSY com BglII e KpnI, seguindo o protocolo de digestão sequencial descrito na etapa 1.2.1.
   3. Ligate o vetor pLEXSY e o gene eGFP com a ligase T4 usando uma razão molar de 1:3 (vetor:inserção). Adicionar brevemente 100 ng de pLEXSY digerido e 28 ng de produto eGFP digerido a uma reação de 20 μL contendo tampão ligase em uma concentração final de 1x e 3 unidades de T4 DNA ligase. Incubar durante a noite a 4 °C.
   4. Transformar células competentes de E. coli , como XL-10, DH5α ou DH10B, com o produto de ligadura obtido na etapa 1.2.3 usando protocolos de transformação padrão³³. Plaquear as células transformadas em ágar Luira-Bertani (LB)-ampicilina e incubar por 24 h a 30 °C para selecionar clones recombinantes (plasmídeos pLEXSY são mais estáveis em E. coli a 30 °C do que a 37 °C).
   5. Rastrear a presença da inserção nos plasmídeos por PCR de colônia.
      1. Colher colônias individuais, ressuspender em 20 μL de água livre de nucleases, aquecer a 95 °C por 15 min e tomar 1 μL do lisado como molde de DNA para PCR de colônia. Use o primer forward para amplificação eGFP, descrito na etapa 1.1.2 (neste exemplo, EGFP1), e o primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') como um primer reverso²⁹.
      2. O primer A264 é projetado para recozer 80 pb após o códon de parada da inserção em vetores de expressão pLEXSY-2.1. Como exemplo, para o par de primers EGFP1 + A264, use um protocolo de ciclagem de PCR que consiste em uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Os primers são adicionados a uma concentração final de 0,2 μM.
         NOTA: O produto esperado usando este conjunto de primers é de 859 pb de comprimento. Os locais de recozimento dos primers EGFP1 e A264 estão representados na Figura 2.
   6. Preparar o DNA plasmidial purificado de um clone positivo para posterior transfecção usando um kit comercial de isolamento de plasmídeos ou precipitação alcalina padrão³³. Utilizar 50 mL de cultura noturna a 30 °C para isolamento de um mínimo de 10 μg de plasmídeo/clone positivo.

2. Linearização do plasmídeo de expressão de pLEXSY

1. Use pelo menos 10 μg do plasmídeo purificado pLEXSY-eGFP para digestão com SwaI (local de reconhecimento: 5'-ATTTAAAT-3'). Digerir durante 3-4 h a 25 °C e inactivar o calor a 65 °C durante 20 min.
2. Execute o produto da digestão em eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos resultantes. Esta digestão gerará dois fragmentos, um fragmento de 2,9 kbp representando os elementos necessários para replicação e seleção em E. coli, e um fragmento de 7-8 kbp representando o de expressão linearizada.
3. Purificar o de expressão usando um kit comercial de extração em gel de agarose.

3. Transfecção de L. panamensis e L. donovani por eletroporação

OBS: A cultura de Leishmania é realizada conforme descrito anteriormente³⁴. Neste exemplo, promastigotas de L. panamensis e L . donovani foram cultivadas em meio de insetos Schneider, suplementadas com 20% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 50 μg/mL de gentamicina, e incubadas a 26 °C.

1. Cultivar as culturas do parasita até que haja promastigotas suficientes em fase logarítmica ou fase estacionária inicial para usar aproximadamente 4 x 10⁷ parasitas por transfecção. A densidade celular máxima por frasco de cultura antes de atingir a fase estacionária pode variar dependendo da espécie de Leishmania e da adaptação das cepas às condições de laboratório. Agrupe o conteúdo de vários frascos de cultura, se necessário.
2. Centrifugar a cultura do parasito a 2.000 x g por 3 min à temperatura ambiente (TR).
3. Ressuspender o pellet em tampão de eletroporação a 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄ e 6 mM glicose; pH 7,5)²⁷ para obter uma concentração de 1 x 10⁸ parasitas/mL. Coloque no gelo por 10 min.
   NOTA: O tampão de eletroporação deve ser esterilizado por filtragem antes do uso.
4. Em paralelo, tubos de pré-resfriamento com 2-10 μg de pLEXSY-eGFP linearizado são construídos em um volume máximo de 50 μL de água ou 10 mM de tampão tris (pH 8,0) e cubetas de eletroporação de d = 2 mm.
5. Adicionar 350 μL de parasitas pré-resfriados ao tubo com o plasmídeo linearizado e transferir todos os 400 μL para a cubeta de eletroporação sobre gelo. Em paralelo, eletroporar as células do parasita sem DNA plasmidial como controle negativo.
6. Eletroporato usando um destes dois protocolos:
   Decaimento exponencial: 450 V, 450 μF, um pulso.
   Constante de tempo: 450 V, T = 3,5 ms, um pulso.
   NOTA: Estes protocolos foram executados usando um pulverizador genético comercial (Tabela de Materiais) com módulos PC e CE.
7. Colocar a cubeta novamente no gelo por 10 min e transferir os parasitas eletroporados para 5 mL do meio de cultura apropriado. Este exemplo usou o meio de inseto de Schneider suplementado com 20% (v/v) de FBS. Incubar a 26 °C durante 20 h.

4. Seleção policlonal em cultura

1. Aproximadamente 20 h após a eletroporação, observar as culturas ao microscópio. Pelo menos metade da população parasitária deve apresentar boa morfologia e motilidade (promastigotas em forma de gota com flagelo oscilante movendo-se através da mídia e/ou formando agregados parasitários ativos). Adicionar o antibiótico seletivo apropriado dependendo do plasmídeo pLEXSY usado. Neste exemplo, é usado o pLEXSY-sat2.1, que contém estreptoligocracina acetiltransferase como marcador de seleção. Portanto, use nourseotricina como antibiótico seletivo na concentração de 0,1 mg/mL.
2. Seguir microscopicamente as culturas até que uma clara diferença entre os parasitas eletroporados com e sem DNA plasmidial seja observada.
3. Verificar a fluorescência do parasita através de citometria de fluxo.
   1. Centrifugar 1 mL da cultura de fase estacionária a 2.000 x g por 3 min em RT. Lavar duas vezes em PBS e ressuspender o pellet final em 1 mL de PBS.
      NOTA: A fluorescência da eGFP pode ser detectada no canal FL1 da maioria dos citômetros comerciais. Configurações de ganho para dispersão frontal e lateral, e o canal FL1 pode variar entre os citômetros. Para este exemplo, um citômetro de espaço CyFlow (Sysmex) foi usado.
   2. Execute as amostras, coletando 20.000 eventos a uma velocidade de 0,5 μL/s, e defina os valores de ganho para os canais de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e fluorescência 1 (FL-1) como 225,0, 200,0 e 520,0, respectivamente. Executar uma amostra controle com parasitas não fluorescentes para determinar a população de parasitas em um dot-plot FSC versus SSC.
   3. Criar uma porta (G1) contendo a população de parasitos e filtrar o canal FL-1 através dessa porta para determinar a autofluorescência de promastigotas e definir uma porta de alcance (G2) para o canal FL-1.
   4. Execute os parasitas transfectados para verificar se há fluorescência. Registrar a porcentagem de parasitos fluorescentes no G1 e a média da intensidade da fluorescência no G2.

5. Confirmação da integração genômica

NOTA: A integração do de expressão pLEXSY-eGFP pode ser confirmada por PCR diagnóstica, usando um primer forward hibridizando para o de expressão (varia dependendo do vetor pLEXSY-2.1 usado) e o primer reverso F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hibridizando-se para uma sequência cromossômica ssu-flanqueando ausente no de expressão. Neste exemplo, o primer F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') é usado como ele hibridiza no de expressão pLEXSY-sat2.1. Uma representação esquemática dos sítios de de expressão integrada e recozimento de primers para PCR diagnóstica é mostrada na Figura 2.

1. Purificar o DNA genômico de 2-5 mL de uma cultura de parasita em fase estacionária por extração convencional de fenol/clorofórmio³⁵ ou com um kit comercial.
2. Realizar a PCR diagnóstica para pLEXSY-sat2.1 usando um protocolo de ciclagem que consiste em uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Os primers são adicionados a uma concentração final de 0,2 μM.

Figura 2: Representação esquemática do de expressão integrada. Caixas rotuladas como Chr-S (cinza) representam as sequências cromossômicas adjacentes do locus 18S rRNA (ssu) no qual o de expressão está integrado. O de expressão integrada consiste de sequências 5' e 3' (azul) para recombinação homóloga no locus ssu, um promotor ribossomal adicional de Leishmania (vermelho) para aumentar a produção de proteínas, o gene eGFP (verde), um gene marcador de seleção (amarelo) e três regiões não traduzidas (cinza claro), a saber, utr1, 2 e 3, que fornecem os sinais de splicing para processamento pós-transcricional de RNAm para expressão otimizada de eGFP e marcador de seleção em parasitas de Leishmania. Os locais de recozimento dos primers para a frente e para a inversão utilizados para a verificação da presença da inserção por PCR de colónia (passo 1.2.5) são marcados pelas setas pretas rotuladas como cpcr-fwd (primer EGFP1) e cpcr-rev (primer A264), respectivamente, que delimitam um produto de 859 pb. Os sítios de anelamento dos primers forward e reverse utilizados para a verificação da integração genômica por PCR diagnóstica (etapa 5) são marcados pelas setas pretas marcadas como sat-fwd (primer F2999) e ssu-rev (primer F3002), respectivamente, que delimitam um produto de 2.271 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Clonagem limitando a diluição (opcional)

1. Após a confirmação da fluorescência por citometria de fluxo, preparar uma diluição de parasitas recombinantes na concentração de cinco promastigotas/mL³⁶.
2. Adicionar 100 μL desta diluição em cada poço de uma placa de 96 poços. Dessa forma, as placas são semeadas a uma densidade média de 0,5 promastigotas/poço, o que garante que alguns poços recebam um único parasita, minimizando a probabilidade de haver mais de um parasita por poço³⁶.
3. Deixe a placa intacta por pelo menos 12 h. Seguir a placa microscopicamente em um aumento mínimo de 100x até que poços com crescimento parasitário sejam detectados.
4. Quando um poço de placa estiver cheio de parasitas, use o conteúdo para inocular uma cultura de 5 mL. Isso leva 1-2 semanas.
5. Quando as culturas de clones atingirem a fase estacionária, verificar a fluorescência por citometria de fluxo, conforme descrito na etapa 4.3. Selecionar os clones a serem utilizados para ensaios posteriores in vitro e in vivo com base na porcentagem de parasitos fluorescentes e na intensidade média de fluorescência medida no canal FL-1. Apontar para clones com 98%-99% de parasitas fluorescentes e selecionar aqueles com maior intensidade média de fluorescência.

Resultados

Depois de construir a construção pLEXSY-eGFP e transformar células de E. coli competentes, as colônias contendo a construção com a inserção de eGFP gerarão um produto de aproximadamente 859 pb após a execução da PCR de colônia descrita na seção 1.2 (Figura 3A). A digestão total do plasmídeo purificado das colônias positivas usando SwaI deve dar dois fragmentos característicos em eletroforese em gel, um fragmento de 2,9 kbp que é a porção do vetor PLEXSY contendo todos os el...

Discussão

As vantagens e desvantagens de vários genes repórteres têm sido estudadas em vários protozoários parasitas. Dentre elas, a GFP e a eGFP são intrinsecamente fluorescentes e permitem fácil quantificação e obtenção de imagens. A atividade fluorescente dessas proteínas pode ser detectada com manipulação mínima usando microscopia de fluorescência, fluorimetria ou citometria de fluxo. Poucos estudos foram realizados para gerar L expressando GFP. (Viannia), apesar da robustez demonstrada da GFP e seus derivado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplacas de 96 poços	Corning	CLS3340	Fundo plano transparente, poliestireno preto, estéril, tampa
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Sal de ampicilina sódica	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, adequado para cultura de células
BglII enzima de restrição	New England BioLabs	R0144S	2.000 unidades. 10.000 unidades/mL
Frascos de cultura de células	Corning	CLS430168	Área de superfície 25 cm2, gargalo inclinado, tampa (vedação de encaixe)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Não disponível
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	pó, BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, ≥ 99,5%
Soro Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F7524
Buffer de Carregamento de Gel	Sigma-Aldrich	G2526	A taxa de migração varia com a composição do gel. Diluir 1:3 a 1:6 com amostra antes de carregar.
Sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	O sistema é composto por uma unidade principal, dois módulos acessórios, o extensor de capacitância (módulo CE) e o controlador de pulso (módulo PC) e uma câmara de cubeta ShockPod.
Cuvetes de Eletroporação Gene Pulser/MicroPulser	Bio-Rad	1652086	Pkg de 50, 0.2 cm– cubeta de eletroporação estéril gap, para uso com os sistemas Gene Pulser e MicroPulser, para células de mamíferos e outras células eucarióticas
Solução de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL em água deionizada, líquido, 0,1 μ m filtrado, BioReagent, adequado para cultura de células
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
Solução HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células
Microscópio invertido	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF enzima de restrição	New England BioLabs	R3142S	4.000 unidades. 20.000 unidades/mL
LB Caldo com ágar	Sigma-Aldrich	L3147	Meio de crescimento microbiano rico em nutrientes altamente referenciado com ágar, adequado para ágar regular  E.coli cultura.
LB Caldo	Sigma-Aldrich	L2542	Meio de crescimento microbiano líquido
Mini-Sub Cell GT Sistema de Eletroforese Horizontal	Bio-Rad	1640300	Mini sistema de eletroforese horizontal, inclui pentes de 8 e 15 poços, bandeja transparente UV de 7 cm x 10 cm
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressando mRNA eGFP fundido com 1 repetição em tandem de uma sequência de 50 bases
pLEXSYcon2.1 kit de expressão	Jena Biociência	EGE-1310sat	Contém vetor de expressão constitutiva integrativa pLEXSY-sat2.1. Seleção antibiótica de transfectantes com Nourseotricina (NTC, clonNAT). Contém todos os primers para PCRs de diagnóstico e sequenciamento.
Cloreto	Potássio Millipore	529552	Grau de Biologia Molecular - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
Sistema Miniprep de Plasmídeo PureYield	Promega	A1222	Até 15 μ g de plasmídeo pronto para transfecção de culturas de 3 mL.
Schneider′ s Inseto Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Meio utilizado em nosso laboratório para cultura de Leishmania.
SOC Médio	Sigma-Aldrich	S1797
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S3014	para biologia molecular, DNase, RNase e protease, nenhum detectado, ≥ 99% (titulação)
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, ≥ 99,0%, de fluxo livre, enzima de restrição Redi-Dri
SwaI	New England BioLabs	R0604S	2.000 unidades. 10.000 unidades/mL
Filtros de seringa	Corning	CLS431212	membrana de celulose regenerada, diam. 4  mm, tamanho do poro 0,2  μ m
T100 Termociclador	Bio-Rad	1861096	Sistema de termociclador, inclui termociclador de 96 poços, cabo de alimentação, anel de suporte de tubo
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Une duas fitas de DNA com extremidades coesivas ou rombas
Tris-Borato-EDTA tampão	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, adequado para eletroforese, concentrado 10&vezes;
Wizard Genomic DNA Kit de Purificação	Promega	A1120
Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza PCR	Promega	A9285
XL10-Gold Células Ultracompetentes	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Células Ultracompetentes, 10 x 0,1 mL. Apresenta o gene de resistência à canamicina no epissomo F', para clonagem extremamente exigente em vetores resistentes ao cloranfenicol. Eficiência: > 5 x 10 9 transformantes/µ g DNA pUC18.