Method Article

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

DOI:

10.3791/64952

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na última década, a proteômica baseada em espectrometria de massa permitiu uma caracterização aprofundada de sistemas biológicos em uma ampla gama de aplicações. O proteoma da superfície celular ("surfaceoma") em doenças humanas é de interesse significativo, pois as proteínas da membrana plasmática são o alvo principal da maioria das terapias clinicamente aprovadas, bem como uma característica fundamental para distinguir diagnosticadamente células doentes de tecidos saudáveis. No entanto, a caracterização focada das proteínas de membrana e superfície da célula permaneceu desafiadora, principalmente devido à complexidade dos lisados celulares, que mascaram proteínas de interesse por outras proteínas de alta abundância. Para superar essa barreira técnica e definir com precisão o proteoma da superfície celular de vários tipos de células usando proteômica de espectrometria de massa, é necessário enriquecer o lisado celular para proteínas de superfície celular antes da análise no espectrômetro de massa. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho detalhado para rotular proteínas de superfície celular de células cancerígenas, enriquecendo essas proteínas a partir do lisado celular e subsequente preparação de amostras para análise de espectrometria de massa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As proteínas servem como as unidades fundamentais pelas quais a maioria das funções celulares são realizadas. Caracterizar a estrutura e função de proteínas relevantes é um passo essencial para entender os processos biológicos. Na última década, os avanços na tecnologia de espectrometria de massa, software de análise e bancos de dados permitiram a detecção e medição precisas de proteínas em uma escala de proteoma1. A proteômica baseada em espectrometria de massa pode ser utilizada em uma ampla gama de aplicações, desde a análise científica básica de vias bioquímicas até a identificação de novos alvos de medicamentos em um ambiente translacional, até o diagnóstico e monitoramento de doenças na clínica2. Ao rastrear novos alvos de drogas, a caracterização do proteoma da superfície celular é particularmente importante, com mais de 65% das drogas humanas atualmente aprovadas visando proteínas da superfície celular3. O campo da imunoterapia contra o câncer também depende totalmente de antígenos de superfície celular específicos do câncer para direcionar e eliminar especificamente as células tumorais4. A proteômica baseada em espectrometria de massa pode, portanto, servir como uma ferramenta promissora para identificar novas proteínas da superfície celular para intervenções terapêuticas.

No entanto, existem várias limitações ao utilizar métodos proteômicos convencionais para pesquisar células tumorais em busca de novos alvos proteicos de superfície celular. A principal preocupação é que as proteínas de superfície constituem uma fração muito pequena do total de moléculas de proteína em uma célula. Portanto, fragmentos dessas proteínas são mascarados por uma alta abundância de proteínas intracelulares ao realizar análises de espectrometria de massa do lisado de células inteiras5. Essa limitação torna difícil caracterizar com precisão o proteoma da superfície celular com um fluxo de trabalho proteômico tradicional. Para enfrentar esse desafio, é necessário desenvolver maneiras de enriquecer as proteínas da superfície celular a partir do lisado de células inteiras, antes da análise no espectrômetro de massa. Um desses métodos envolve a oxidação e a marcação de biotina de proteínas de superfície celular glicosiladas nas células intactas e o subsequente enriquecimento dessas proteínas biotiniladas do lisado com um pulldown de neutravidina, um processo que foi denominado "captura de superfície celular6. Uma vez que ~ 85% das proteínas da superfície celular de mamíferos são consideradas glicosiladas7, isso serve como um método eficaz de enriquecer o proteoma da superfície celular a partir de todo o lisado celular. Este artigo descreve um fluxo de trabalho completo, começando com células cultivadas, de marcação de biotina de superfície celular e subsequente preparação de amostras para análise de espectrometria de massa (Figura 1). Ao longo de várias réplicas, este método fornece uma cobertura robusta do proteoma da superfície celular de uma amostra específica. A utilização deste método para caracterizar o proteoma da superfície celular de células tumorais e saudáveis pode facilitar a descoberta de novos antígenos de superfície celular para identificar potenciais alvos imunoterapêuticos8.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: As células de plasmocitoma AMO1 foram usadas para este experimento de proteoma de superfície celular. O mesmo protocolo também pode ser usado para outros tipos de células, incluindo uma ampla gama de linhas celulares em suspensão e aderentes9, bem como vários tipos de amostras primárias10. No entanto, o número de células (material de partida para o experimento) normalmente precisa ser otimizado para cobertura de proteoma equivalente. Para obter detalhes relacionados a materiais e equipamentos, consulte a Tabela de Materiais. Para obter detalhes relacionados aos tampões e soluções de reagentes e sua composição, consulte a Tabela 1.

1. Marcação da superfície celular com biotina

  1. Contar as células cultivadas e o sedimento aproximadamente 3,5 × 107 células vivas por centrifugação (5 min a 500 × g, 24 °C).
    NOTA: As células de plasmocitoma AMO1 foram passadas com meio fresco a cada 3 dias antes da colheita.
  2. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet adicionando 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco frio (4 ° C) (D-PBS) (sem cálcio, sem magnésio) e pipetando suavemente para cima e para baixo.
  3. Pellet as células novamente (como na etapa 1.1) e repita a etapa de lavagem (etapa 1.2) mais uma vez (duas lavagens no total).
  4. Após a segunda lavagem, pelete as células (como na etapa 1.1) e ressuspenda-as em 990 μL de D-PBS frio pipetando suavemente.
  5. Preparar previamente uma solução-mãe de metaperiodato de sódio a 160 mM (NaIO4). Dividir em alíquotas de 50 μL e armazenar a -20 °C por até 6 meses. Adicionar 10 μL de solução de metaperiodato de sódio a 160 mM à suspensão celular na etapa 1.4, misturar bem e incubar em um rotor de ponta a ponta por 20 min a 4 °C.
  6. Após a conclusão da incubação, pulverize as células (como na etapa 1.1), decanta o sobrenadante e ressuspende em 1 mL de D-PBS frio. Repita esta etapa de lavagem duas vezes (três lavagens no total). Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em 989 μL de D-PBS.
  7. Preparar previamente uma solução-mãe de hidrazida de biocitina 100 mM. Divida em alíquotas de 50 μL e armazene a -20 °C por até 6 meses. Adicione 1 μL de anilina e 10 μL de hidrazida de biocitina 100 mM à suspensão celular na etapa 1.6, misture bem e incube em um rotor de ponta a ponta por 60 min a 4 ° C.
  8. Após a conclusão da incubação, pulverize as células (como na etapa 1.1), decanta o sobrenadante e ressuspende em 1 mL de D-PBS frio. Repita esta etapa de lavagem duas vezes (três lavagens no total).
  9. Após a terceira lavagem, aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e congelar o grânulo celular colocando o tubo no líquido N2. Coloque o pellet congelado a -80 °C, até que esteja pronto para prosseguir com a lise e o pulldown.

2. Lise celular e pulldown de biotina

  1. Descongele o pellet de célula congelada no gelo.
  2. Adicione 500 μL de tampão de lise 2x ao pellet, misture bem e vortex por 30 s.
    NOTA: Pipetagem e vórtice vigorosos podem ser necessários para lisar totalmente o pellet. Alguns detritos insolúveis (ou seja, DNA) são aceitáveis, pois são removidos na etapa de sonicação subsequente.
  3. Sonicar o lisado celular em gelo (três rajadas, 20 s cada, 60% do ciclo de trabalho).
  4. Centrifugue o lisado para pulverizar quaisquer detritos restantes (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
  5. Enquanto o lisado está centrifugando, adicione 100 μL de esferas de resina de neutravidina agarose a uma coluna de filtração. Prenda a coluna a um coletor de vácuo, aplique um vácuo suave e lave as contas fluindo 3 mL de tampão de lavagem 1 sobre elas.
  6. Remova a coluna de filtração do coletor de vácuo, tampe a parte inferior e adicione o lisado de células clarificado à coluna com os grânulos. Tampe o topo da coluna e incube o lisado com os grânulos em um rotor de ponta a ponta por 120 min a 4 °C.
    NOTA: Ao tampar a parte superior da coluna, segure firmemente a tampa inferior no lugar, caso contrário, ela pode se soltar e o lisado celular pode vazar durante a incubação.
  7. Prepare os tampões de lavagem 1, 2 e 3 (aproximadamente 5 mL de cada tampão de lavagem por amostra, consulte a Tabela 1) e coloque-os em banho-maria a 42 °C
  8. Depois que o lisado terminar a incubação, coloque a coluna de filtração de volta no coletor de vácuo, aplique um vácuo suave e lave os grânulos fluindo 5 mL de tampão de lavagem 1 sobre eles.
    NOTA: Mais de 5 mL dos tampões de lavagem podem ser usados para lavar; A lavagem extra pode reduzir a ligação de fundo e não específica nas contas.
  9. Repita a etapa de lavagem com 5 mL de tampão de lavagem 2.
  10. Repita a etapa de lavagem com 5 mL de tampão de lavagem 3.
  11. Uma vez que o tampão de lavagem final tenha fluído inteiramente através dos grânulos, remova a coluna do coletor. Adicione 100 μL de solução "Lyse" aos grânulos e transfira-os para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL com uma pipeta. Gire brevemente o tubo para assentar as esferas e remova 50 μL da solução sem perturbar as esferas assentadas.
    NOTA: Os reagentes nesta etapa e em todas as etapas subsequentes usam um kit de preparação de amostras proteômicas disponível comercialmente. O kit fornece um fluxo de trabalho de preparação de amostras otimizado e simplificado. No entanto, essas etapas também podem ser executadas independentemente do kit, usando um fluxo de trabalho proteômico tradicional, conforme descrito em Verma et al.9. Se os grânulos permanecerem presos na lateral ou na parte inferior da coluna, deixe os grânulos que foram transferidos para o tubo assentarem e use uma solução extra de "Lyse" no tubo para transferir os grânulos restantes.
  12. Coloque o tubo em um bloco de calor / agitador a 65 ° C e agite a 1.000 rpm por 10 min.
    NOTA: Esta etapa é necessária para a redução e alquilação dos resíduos de cisteína antes da digestão.

3. Digestão de proteínas

  1. Ressuspender a tripsina seca (tubo "Digest" no kit, conservado a -20 °C) adicionando 210 μl da solução "Ressuspender". Pipetar a solução para cima e para baixo várias vezes para garantir que toda a tripsina seca seja ressuspensa.
  2. Após a incubação estar completa, adicione 50 μL da solução de tripsina ressuspensa aos grânulos. Incubar o tubo a 37 °C, agitando a 500 rpm durante pelo menos 90 min para digerir a proteína.
  3. Quando a digestão estiver completa, transfira a solução contendo as esferas para uma coluna de centrifugação e insira a coluna em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL. Gire o tubo (500 × g por 5 min à temperatura ambiente [RT]) para separar a solução peptídica digerida das contas.
    NOTA: Nesta fase, o tratamento com PNGase pode ser realizado nos grânulos, uma vez que eles são separados da solução peptídica, para eluir fragmentos de peptídeos biotinilados dos grânulos de estreptavidina. Esta amostra de peptídeo pode então ser transportada pelo restante do fluxo de trabalho como uma amostra de peptídeo secundária separada que pode ser analisada e comparada com a amostra primária de tripsinização no grânulo. É provável que a abordagem PNGase forneça dados complementares à tripsinização no grânulo, dada a especificidade adicional para asparaginas N-glicosiladas capturadas com base na modificação da cadeia lateral detectável por MS12. No entanto, a desvantagem dessa abordagem de eluição sequencial é a exigência de duas vezes o tempo do instrumento do espectrômetro de massa por análise de amostra.
  4. Adicione 100 μL da solução "Stop" para interromper a reação de digestão e acidificar a solução peptídica.

4. Dessalinização de peptídeos

  1. Usando um adaptador de tubo, coloque uma coluna de dessalinização em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL. Adicione toda a solução de peptídeo acidificado à coluna. Girar a coluna (3.800 × g durante 3 min) de modo a que a solução flua através da coluna. Os peptídeos agora estão ligados à coluna; descarte o fluxo.
  2. Adicione 200 μL de solução "Wash 1" à coluna e centrifugue (3.800 × g durante 3 min, RT). Descarte o fluxo.
  3. Adicionar 200 μL de solução "Wash 2" à coluna e centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Descarte o fluxo.
  4. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mL rotulado. Adicionar 100 μL de solução de "Elute" à coluna e centrifugar (3.800 × g durante 3 min, RT). Adicione mais 100 μL de solução de "Elute" à coluna e gire (3.800 × g por 3 min, RT). Os peptídeos são agora eluídos da coluna para o tubo.
  5. Coloque a solução peptídica em uma centrífuga a vácuo e deixe secar durante a noite. Colocar os péptidos secos a -80 °C até estarem prontos a quantificar e analisar no espectrómetro de massas.

5. Ressuspensão e quantificação de peptídeos

  1. Ressuspenda os peptídeos secos em 20 μL de solvente A (0,1% de ácido fórmico, 2% de acetonitrila).
  2. Centrifugue os peptídeos ressuspensos (17.200 × g por 10 min) para pellet quaisquer detritos insolúveis.
  3. Prepare padrões de peptídeos para o ensaio de quantificação de peptídeos colorimétricos.
    1. Coloque 5 μL de solução estoque de peptídeo de 1.000 mg / mL em um poço de uma placa de 96 poços.
    2. Realizar uma diluição seriada de sete etapas na placa com água deionizada (DI), da seguinte forma, com 5 μL de cada padrão por poço: 1.000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL e 15,625 mg/mL. Coloque 5 μL de água DI em um oitavo poço para o branco.
  4. Coloque 4 μL de água DI em três poços separados da placa de 96 poços. Adicionar 1 μL da solução peptídica ressuspensa a cada poço, para um volume total de 5 μL.
    NOTA: Ao pipetar a solução peptídica para quantificação, pipete cuidadosamente a partir do topo da solução para evitar perturbar quaisquer detritos depositados.
  5. Calcule quanto reagente de trabalho é necessário (45 μL necessários por poço). Preparar o volume necessário do reagente de trabalho do ensaio colorimétrico; vórtice o reagente de trabalho para garantir a mistura adequada dos componentes.
  6. Adicione 45 μL do reagente de trabalho a cada um dos poços padrão e de amostra.
    NOTA: Faça os padrões em duplicata e use uma pipeta multicanal para garantir uma diferença mínima no tempo de quando o reagente é adicionado aos poços.
  7. Cubra a placa com papel alumínio e incube a 37 °C por 15 min.
  8. Analise a placa em um leitor de placas automatizado. Use os valores de absorbância registrados para as amostras padrão para gerar uma curva padrão linear. Determine a equação da curva padrão e o valor R2. Se o valor de R2 for razoável (≥0,95), utilizar a curva-padrão para determinar a concentração de péptidos ressuspensos, tendo em conta a diluição quíntupla na placa de ensaio colorimétrico.

6. Análise por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) dos peptídeos digeridos

  1. Ajuste a concentração das amostras de peptídeos para 0,2 μg/μL adicionando o solvente A e transfira 10 μL para um tubo de 0,6 mL de baixa ligação a proteínas.
  2. Coloque o tubo no amostrador automático LC.
  3. Defina os parâmetros LC e MS/MS, de acordo com Figura 2 e Figura 3.
  4. Injete 5 μL (1 μg) da amostra de peptídeo na configuração LC-MS/MS para análise.
    NOTA: As configurações de LC-MS/MS mostradas aqui são representativas apenas para as ilustrações. Dependendo da disponibilidade do instrumento LC e MS, os usuários podem modificar as configurações do gradiente LC e dos parâmetros MS/MS para obter uma cobertura profunda do proteoma. Para este artigo, a análise de dados do MS foi realizada usando o https://www.maxquant.org/ MaxQuant, a análise de dados secundários foi realizada usando o https://maxquant.net/perseus/ Perseus e a análise de vias usando https://reactome.org/.

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Results

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Para este experimento, caracterizamos o proteoma da superfície celular de uma linhagem de células tumorais marcando proteínas de membrana N-glicosiladas de células intactas com biotina e enriquecendo essas proteínas marcadas do lisado de células inteiras com um pulldown de neutravidina (Figura 1). Além disso, realizamos análise de proteoma usando LC-MS/MS para caracterizar proteínas de superfície celular enriquecidas. Ao contrário da análise do proteoma de células inteiras, aqui, o ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A proteômica baseada em espectrometria de massa é uma ferramenta poderosa que permitiu a caracterização imparcial de milhares de proteínas desconhecidas em uma escala anteriormente impossível. Essa abordagem nos permite identificar e quantificar as proteínas, bem como obter uma série de insights para as capacidades estruturais e de sinalização de células e tecidos, caracterizando a variedade de proteínas presentes em uma amostra específica. Indo além do perfil global de proteínas em uma amostra, a espectrometria de massa...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Kamal Mandal (Departamento de Medicina Laboratorial, UCSF) pela ajuda na configuração da execução LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombaim) pela ajuda na análise de dados e à Dra. Audrey Reeves (Departamento de Medicina Laboratorial, UCSF) pela ajuda na análise de dados. O trabalho relacionado no laboratório APW é apoiado pelo NIH R01 CA226851 e pelo Chan Zuckerberg Biohub. A Figura 1 e a Figura 2B foram feitas com BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
96X Kit de preparação de amostras iSTPreOmicsPO00027Kit de preparação de amostras proteômicas. Inclui reagentes para redução, alquilação e digestão. Também inclui colunas de dessalinização e reagentes. 
Ensaio Colorimétrico Quantitativo de PeptídeosPierce Thermo23275Kit de quantificação de peptídeos. Inclui padrões peptídicos e componentes de reagentes funcionais. 
Reagentes
AcetonitrilaFisherA955-1
Bicarbonato de amônioMillipore Sigma09830-1KG
Biocitina hidrazidaBiotium90060
D-PBS (sem sais de cálcio e magnésio)Instalação de cultura de células UCSFCCFAL003-225B01
Ácido fórmicoHoneywell94318
Halt Protease e Inibidor de Fosfatase Uso Único CoquetelThermo1861280
Alta Capacidade Neutravidina Resina de AgaroseThermo29204
Tampão de FosfatoCultura de Células UCSFCCFAL001-22J01
Tampão de Lise RIPA, 10xMillipore Sigma20-188
Cloreto de sódioFisherBP358-212
Metaperiodato de sódioAlfa Aesar13798
Mancha azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
Ureia (grau proteómico)VWRM123-1KG
strong>Equipamento
TC20 Contador de Células AutomatizadoBio-Rad1450102
PrismR MicrocentrífugaLabnet InternationalC2500-R-230V
SonicatorVWRBranson Sonifier 240
Coletor de VácuoPromegaPromega Vac-Man
Shakeking HeatblockEppendorfEppendorf Thermomixer C
Rotador de ponta a pontaRevólver Labnet Rotador
LCThermoUltimate 3000 HPLC e UHPLC
Q Exactive Plus Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrapolo OrbitrapThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
Leitor de MicroplacasBiotek BiotekSynergy 2 
Concentrador de VácuoLabconco7810010
Supplies
1.5 mL Protein LoBind TubesEppendorf22431081
1.7 mL Microcentrifuge Tubos
Colunas de FiltraçãoBio-Rad7326008
Spin ColunasThermoNº 69725
Instalação de <Ajustável

References

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