Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Summary

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Abstract

Na última década, a proteômica baseada em espectrometria de massa permitiu uma caracterização aprofundada de sistemas biológicos em uma ampla gama de aplicações. O proteoma da superfície celular ("surfaceoma") em doenças humanas é de interesse significativo, pois as proteínas da membrana plasmática são o alvo principal da maioria das terapias clinicamente aprovadas, bem como uma característica fundamental para distinguir diagnosticadamente células doentes de tecidos saudáveis. No entanto, a caracterização focada das proteínas de membrana e superfície da célula permaneceu desafiadora, principalmente devido à complexidade dos lisados celulares, que mascaram proteínas de interesse por outras proteínas de alta abundância. Para superar essa barreira técnica e definir com precisão o proteoma da superfície celular de vários tipos de células usando proteômica de espectrometria de massa, é necessário enriquecer o lisado celular para proteínas de superfície celular antes da análise no espectrômetro de massa. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho detalhado para rotular proteínas de superfície celular de células cancerígenas, enriquecendo essas proteínas a partir do lisado celular e subsequente preparação de amostras para análise de espectrometria de massa.

Introduction

As proteínas servem como as unidades fundamentais pelas quais a maioria das funções celulares são realizadas. Caracterizar a estrutura e função de proteínas relevantes é um passo essencial para entender os processos biológicos. Na última década, os avanços na tecnologia de espectrometria de massa, software de análise e bancos de dados permitiram a detecção e medição precisas de proteínas em uma escala de proteoma¹. A proteômica baseada em espectrometria de massa pode ser utilizada em uma ampla gama de aplicações, desde a análise científica básica de vias bioquímicas até a identificação de novos alvos de medicamentos em um ambiente translacional....

Protocol

NOTA: As células de plasmocitoma AMO1 foram usadas para este experimento de proteoma de superfície celular. O mesmo protocolo também pode ser usado para outros tipos de células, incluindo uma ampla gama de linhas celulares em suspensão e aderentes⁹, bem como vários tipos de amostras primárias¹⁰. No entanto, o número de células (material de partida para o experimento) normalmente precisa ser otimizado para cobertura de proteoma equivalente. Para obter detalhes relacionados a materiais e equipamentos, consulte a Tabela de Materiais. Para obter detalhes relacionados aos tampões e soluções de reagentes e sua....

Results

Para este experimento, caracterizamos o proteoma da superfície celular de uma linhagem de células tumorais marcando proteínas de membrana N-glicosiladas de células intactas com biotina e enriquecendo essas proteínas marcadas do lisado de células inteiras com um pulldown de neutravidina (Figura 1). Além disso, realizamos análise de proteoma usando LC-MS/MS para caracterizar proteínas de superfície celular enriquecidas. Ao contrário da análise do proteoma de células inteiras, aqui, o .......

Discussion

A proteômica baseada em espectrometria de massa é uma ferramenta poderosa que permitiu a caracterização imparcial de milhares de proteínas desconhecidas em uma escala anteriormente impossível. Essa abordagem nos permite identificar e quantificar as proteínas, bem como obter uma série de insights para as capacidades estruturais e de sinalização de células e tecidos, caracterizando a variedade de proteínas presentes em uma amostra específica. Indo além do perfil global de proteínas em uma amostra, a espectrometria de massa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
96X Kit de preparação de amostras iST	PreOmics	PO00027	Kit de preparação de amostras proteômicas. Inclui reagentes para redução, alquilação e digestão. Também inclui colunas de dessalinização e reagentes.
Ensaio Colorimétrico Quantitativo de Peptídeos	Pierce Thermo	23275	Kit de quantificação de peptídeos. Inclui padrões peptídicos e componentes de reagentes funcionais.
Reagentes
Acetonitrila	Fisher	A955-1
Bicarbonato de amônio	Millipore Sigma	09830-1KG
Biocitina hidrazida	Biotium	90060
D-PBS (sem sais de cálcio e magnésio)	Instalação de cultura de células UCSF	CCFAL003-225B01
Ácido fórmico	Honeywell	94318
Halt Protease e Inibidor de Fosfatase Uso Único Coquetel	Thermo	1861280
Alta Capacidade Neutravidina Resina de Agarose	Thermo	29204
Tampão de Fosfato	Cultura de Células UCSF	CCFAL001-22J01
Tampão de Lise RIPA, 10x	Millipore Sigma	20-188
Cloreto de sódio	Fisher	BP358-212
Metaperiodato de sódio	Alfa Aesar	13798
Mancha azul de tripano (0,4%)	Gibco	15250-061
Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-038
Ureia (grau proteómico)	VWR	M123-1KG
strong>Equipamento
TC20 Contador de Células Automatizado	Bio-Rad	1450102
PrismR Microcentrífuga	Labnet International	C2500-R-230V
Sonicator	VWR	Branson Sonifier 240
Coletor de Vácuo	Promega	Promega Vac-Man
Shakeking Heatblock	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
Rotador de ponta a ponta		Revólver Labnet Rotador
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC e UHPLC
Q Exactive Plus Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrapolo Orbitrap	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Leitor de Microplacas	Biotek Biotek	Synergy 2
Concentrador de Vácuo	Labconco	7810010
Supplies
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Eppendorf	22431081
1.7 mL Microcentrifuge Tubos
Colunas de Filtração	Bio-Rad	7326008
Spin Colunas	Thermo	Nº 69725