Method Article

Explorando as funções do tecido adiposo

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Cho, D. S., Doles, J. D. Preparação de células progenitoras adiposas a partir de tecidos adiposos epididimais de camundongos. Jornal de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. Isolamento de subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos adiposos intra-abdominais murinos. Jornal de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. Isolamento de adipócitos viáveis e fração vascular estromal do tecido adiposo visceral humano adequado para análise de RNA e fenotipagem de macrófagos. Jornal de Experimentos Visualizados. (164), doi: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Explorando a estrutura do tecido adiposo por limpeza de metilsalicilato e imagens 3D. Jornal de Experimentos Visualizados. (162), doi: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. Análise linfática e da rede sanguínea durante a obesidade. Jornal de Experimentos Visualizados. (165), doi: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Um modelo de cultura de células de adipócitos para estudar o impacto da modulação de proteínas e micro-RNAs na função dos adipócitos. Jornal de Experimentos Visualizados. (171), doi: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolamento, proliferação e diferenciação de células-tronco derivadas do tecido adiposo de macaco rhesus. Jornal de Experimentos Visualizados. (171), doi: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Cultura de adipócitos tridimensionais como modelo para estudar a remodelação do tecido adiposo branco induzida por caquexia. Jornal de Experimentos Visualizados. (167), doi: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos humanos usando filtração e ultracentrifugação. Jornal de Experimentos Visualizados. (170), doi: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

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Caracterizada por um aumento na massa de tecido adiposo (TA) e remodelação pró-inflamatória das células imunes AT, a obesidade surgiu como um grande problema de saúde pública mundial, pois aumenta drasticamente o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. Portanto, explorar a estrutura e a função do TA tornou-se um importante desafio clínico. Nesta coleção de métodos, apresentamos vários métodos de última geração desenvolvidos para investigar a estrutura e função do TA em condições fisiológicas e patológicas.

AT é um tecido heterogêneo composto por várias populações de células, incluindo adipócitos maduros, células progenitoras adiposas (APCs), progenitores fibroinflamatórios (FIPs), células endoteliais e células imunes. Portanto, para caracterizar esse tecido, a fenotipagem de células únicas pode ser realizada. Em seus artigos, Cho et al. e Peics et al. fornecem protocolos para isolar e caracterizar APCs residentes em AT brancos de camundongos por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) 1 , 2 . Esta etapa é fundamental não apenas na contagem do número de APCs residentes, que é um fator importante na determinação da capacidade de expansão do AT, mas também na exploração da função dessas células no nível de uma única célula. Peics et al. também fornecem um método para isolar FIPs2 residentes em AT brancos de camundongos, células produtoras de colágeno não adipogênicas que podem contribuir para o desenvolvimento de um fenótipo pró-inflamatório conhecido por desempenhar um papel na disfunção AT. Da mesma forma, Estrada-Gutierrez et al. descrevem um protocolo para isolar simultaneamente adipócitos maduros viáveis e células da fração vascular estromal de biópsias de TA visceral humana3. Ao todo, esses protocolos são o padrão-ouro para gerar uma única suspensão celular de AT humano e de camundongo, que é o primeiro passo crítico para contar e fenotipar funcionalmente as diferentes subpopulações de células AT.

A relação entre a estrutura e a função é altamente relevante em TA. Uma característica da disfunção do TA durante a obesidade está relacionada ao aumento do tamanho dos adipócitos e a uma profunda remodelação do LA. Essa remodelação afeta não apenas as populações de adipócitos e células imunológicas, mas também a rede linfática e de vasos sanguíneos. Para apreciar essas alterações em todo o TA, Gilleron et al. desenvolvem um protocolo de compensação de TA muito simples, barato e rápido4. Este protocolo simples visualiza tridimensionalmente a morfologia de AT de camundongo inteiro e grandes biópsias de AT humanas. Isso inclui as redes neuronais e vasculares, os adipócitos e a distribuição de células imunes inatas e adaptativas, que são parâmetros importantes para estudar a obesidade e suas patologias associadas. Para caracterizar o impacto da obesidade nos vasos linfáticos e sanguíneos do TA, Czepielewski et al. fornecem um método in vivo para corar simultaneamente a arborização linfática e os vasos sanguíneos injetando lectinas conjugadas com fluorocromo5. Este protocolo fornece uma maneira de analisar a morfologia in vivo de ambas as redes, incluindo sua densidade, volume e ramificação. Curiosamente, a combinação dessa estratégia de rotulagem com um procedimento de limpeza de AT4 permite o mapeamento de alta resolução de todo o AT do mouse em três dimensões (3D) 5. Em conjunto, essas abordagens podem caracterizar a estrutura do TA em condições fisiológicas e fisiopatológicas, obtendo informações sobre a correlação entre a estrutura e a função do TA.

Devido à sua alta heterogeneidade e tremenda capacidade de remodelamento, analisar a função dos adipócitos dentro do TA in vivo não é simples, e por isso vários sistemas de cultura foram desenvolvidos. A principal vantagem de todos esses sistemas de cultura de células é o alto nível de controle sobre a população de células e o microambiente. Jager et al. desenvolvem um protocolo simples para manipular a expressão de RNA em adipócitos maduros diferenciados 3T3-L16. Embora esse sistema de cultura esteja longe das condições fisiológicas ideais, os adipócitos 3T3-L1 permanecem funcionais em relação à sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise. Portanto, este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para manipular a expressão de proteínas e RNAs não codificantes e estudar seu papel nas funções dos adipócitos. Para se aproximar das condições fisiológicas ideais, Poret et al. descrevem um método para gerar adipócitos maduros funcionais usando células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) obtidas de macaco rhesus AT7. Este protocolo explica como isolar ADSCs primárias e como induzir sua proliferação e diferenciação. Os autores sugerem ainda que esse procedimento pode ser adaptado a outras espécies. Embora este sistema de cultura esteja mais próximo das condições fisiológicas ideais em comparação com a linhagem celular 3T3-L1, os adipócitos maduros derivados de ADSCs primários são cultivados em 2D, o que é diferente do in vivo. Para lidar com essa questão, Batista Jr. et al. fornecem um protocolo eficiente para um sistema de cultura de tecidos de impressão tridimensional8. Neste trabalho, os autores geram adiposferóides a partir de células da fração vascular estromal de camundongos e diferenciam precursores de adipócitos diretamente dentro desse sistema de cultura 3D. Essa abordagem está irrevogavelmente mais próxima das condições fisiológicas ideais do que o método de cultura 2D, mas a falta de vasos que possam trazer nutrientes aos adipócitos no centro dos esferoides deve ser levada em consideração. A modulação da expressão de proteínas e RNAs não codificantes, conforme descrito6, dentro desses sistemas de cultura pode levar a uma visão mais aprofundada sobre o papel funcional desses alvos em adipócitos fisiologicamente mais relevantes. No entanto, um sistema tão complexo ainda precisa ser estabelecido. O maior interesse desses sistemas de cultivo ex vivo/in vitro é o alto nível de controle sobre o microambiente, que também inclui os fatores secretados pelas células. A esse respeito, o protocolo de Akbar et al. isola e caracteriza as vesículas extracelulares (EVs) secretadas pelos adipócitos humanos9. Recentemente, descobriu-se que os EVs são importantes reguladores metabólicos; este método é obrigatório para analisar o impacto metabólico dessas EVs derivadas de adipócitos em diferentes situações metabólicas.

Na presente coleção de métodos, damos uma visão geral dos protocolos de última geração que cobrem vários aspectos da análise de TA, incluindo sistemas de cultura ex vivo e in vitro , exploração de tecido total 3D e análise de célula única. Embora nenhum sistema de cultura seja perfeito, é importante escolher o sistema de cultura que se adapta à questão biológica. Portanto, esta coleção de métodos fornece uma grande caixa de ferramentas de procedimentos para isolar, diferenciar e manipular adipócitos in vitro. A combinação de todos os diferentes métodos descritos aqui levará a uma visão da morfologia e da função do TA.

Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar

Acknowledgements

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Os autores agradecem a Jean-François Tanti e Mireille Cormont por seu apoio científico e contribuições. Este trabalho foi apoiado pelo INSERM, Université Côte d'Azur e por bolsas da Agência Nacional de Pesquisa da França (ANR) por meio do Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), do programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) e do Young Investigator Program para J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) e para J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

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  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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