Não aplicável
Artigo de método
14 de julho de 2023
Não aplicável
Cobrindo ~ 40% do corpo humano, o músculo esquelético é um órgão importante, apoiando funções críticas desde o movimento até a respiração e o metabolismo. É importante ressaltar que ele tem uma capacidade única de se auto-reparar após uma lesão e, com essa capacidade regenerativa, garante uma recuperação funcional e estrutural completa de danos graves em menos de um mês. Vários tipos de células têm sido implicados nesta notável capacidade de reparação, tendo as células estaminais musculares um papel central.
Pesquisadores musculares de todo o mundo desenvolveram vários ensaios para analisar o músculo esquelético nos níveis funcional, molecular e celular. Cada técnica tem seus próprios pontos fortes, com testes in vivo em modelos animais representando a opção com maior relevância para os humanos e a complexidade dos organismos vivos. As contrapartes in vitro e ex vivo estão ganhando terreno à medida que grupos de pesquisa em todo o mundo se esforçam para minimizar a pesquisa com animais em vista do princípio de Substituição-Redução-Refinamento (3R) reconhecido internacionalmente. Esta coleção de métodos teve como objetivo fornecer modelos in vivo e ex vivo para estudos moleculares, celulares e funcionais de músculos entre espécies.
Montandon et al.1 descrevem técnicas para caracterizar rapidamente fenótipos de regeneração muscular em peixes-zebra de genótipos controle e mutantes. Primeiro, os embriões são genotipados usando material que é sacudido de animais anestesiados. Esta é uma perspectiva empolgante, pois a maioria dos protocolos envolvendo a genotipagem de embriões geneticamente modificados exige um sacrifício simultâneo do embrião. Em seguida, a regeneração é induzida pela facada de uma região específica da musculatura da larva do peixe-zebra. Graças às propriedades ópticas do sarcômero, a integridade do músculo lesionado pode ser avaliada por meio de imagens pós-lesão. Este protocolo é de grande interesse para os cientistas que estudam a regeneração muscular, pois é um método rápido e potencialmente de alto rendimento para investigar diferentes mutantes em busca de defeitos regenerativos.
Hüttner et al.2 e Pegoli et al.3 apresentam um método que permite estudos celulares e moleculares de células-tronco musculares, a população celular no centro da regeneração muscular. O método é altamente interessante para pesquisadores que se concentram em estudos de ativação precoce e interações de nicho celular. O método de culturas de miofibras únicas permite cultivar e estudar células-tronco musculares por até 96 h enquanto elas ainda estão associadas às fibras musculares, recebendo sinais desse nicho próximo e endógeno. A técnica é particularmente difícil de estabelecer devido às muitas etapas delicadas que Hüttner et al.2 explicam cuidadosamente (por exemplo, dissecção e dissociação muscular suaves). Indo um passo adiante, os autores detalham o direcionamento de siRNA para análises funcionais de fatores que podem influenciar o comportamento das células-tronco e sublinham a importância de comparar células transfectadas com siRNA com células transfectadas de controle do mesmo camundongo e músculo. Paralelamente, Pegoli et al.3 descrevem como esse método pode ser ajustado para estudar células-tronco musculares no contexto da distrofia muscular de Emery-Dreifuss e no início da vida pós-natal, enfocando os desafios ligados à fragilidade muscular nesse contexto. Para aumentar a eficiência do protocolo, eles orientam os leitores com imagens de fibras com boa e má sobrevivência e destacam a necessidade de "validar empiricamente" o tempo de digestão.
Zaidan et al.4 descrevem um sistema de cultura ex vivo do músculo esquelético que favorece a produção de células de reserva do tipo quiescente, ao mesmo tempo em que mantém vários outros tipos de células, ambas apresentando desafios em sistemas de cultura alternativos. Assim, este método pode ser útil para pesquisadores orientados em estudos de quiescência ou interações de células-tronco de nicho, inclusive sob condições que modificam vias moleculares usando drogas, siRNAs ou vetores. O protocolo envolve dissecção rápida dos músculos dos membros posteriores, seguida de digestão enzimática e filtração. Em seguida, as células são colocadas em cultura, com o aparecimento de células de reserva em uma semana. O protocolo permite a amplificação em larga escala dessas células de reserva, com a possibilidade de imagens de células vivas usando camundongos geneticamente marcados, como Pax7nGFP.
Park et al.5 demonstram como o nitrato e o nitrito podem ser medidos no músculo esquelético, um dos principais órgãos de armazenamento de nitrato. O método descrito é de particular interesse para pesquisadores que estudam fisiologia do exercício e distúrbios neuromusculares ou metabólicos relacionados ao ciclo do óxido nítrico. Embora haja um desenvolvimento tecnológico significativo para facilitar as medições de nitrato e nitrito, existem vários parâmetros que podem afetar o resultado final e são cuidadosamente descritos e comparados pelos autores (por exemplo, método de homogeneização, tamanho da biópsia, tipo de músculo).
Hessel et al.6 descrevem detalhadamente um procedimento para a realização de biópsias do músculo tibial anterior de pacientes humanos, a fim de obter fibras de comprimento suficiente para experimentos mecânicos. Os autores enfatizam que pacientes com lesão muscular recente devem ser excluídos. Uma vez obtido o consentimento informado dos pacientes elegíveis, o ultrassom é usado para avaliar o melhor local no músculo para a coleta da biópsia. Depois de discutir a via de injeção ideal, a equipe realiza a biópsia usando uma agulha especializada. Finalmente, os cuidados pós-operatórios ao paciente e os métodos de processamento de tecidos são detalhados. Este método é de particular interesse para médicos-cientistas, que desejam padronizar a coleta de tecidos de pacientes para estudos mecânicos de fibras musculares.
Nesta Coleção de Métodos, os estudos mecânicos são apresentados por Brightwell et al.7 e Corona et al.8. Esses artigos discutem métodos para medir a força em modelos animais pequenos e grandes. Doença ou lesão neuromuscular afeta negativamente a força muscular; assim, exercícios, nutrição e intervenções terapêuticas visam restaurá-lo. Brightwell et al.7 detalham um método para avaliar a função do músculo quadríceps em camundongos de forma análoga aos métodos usados em pacientes humanos. Primeiro, eles fornecem etapas para preparar o equipamento e o software necessários para o experimento. Em seguida, o camundongo é anestesiado e colocado em posição para que a função extensora seja avaliada. Os eletrodos são colocados na parte distal do quadríceps para indução da contração, uma corrente ideal é avaliada e as medições do pico de torque tetânico isométrico são registradas e analisadas. Usando um modelo animal maior, Corona et al.8 avaliaram o torque isométrico no músculo dorsiflexor do membro posterior de porco, mostrando as configurações passo a passo do equipamento e o protocolo de medição de força. É importante notar que eles mostram frentes de onda de alta e baixa qualidade para garantir a aquisição ideal de resultados. Eles reconhecem os pontos fortes dessa técnica não invasiva que permite análises longitudinais do mesmo animal, mas também discutem longamente as etapas críticas (por exemplo, estimulação nervosa, alinhamento mecânico) e limitações do método.
Ainda existem muitas questões pendentes no campo da pesquisa do músculo esquelético: quais genes são cruciais para a regeneração muscular, como as células satélites mantêm o potencial regenerativo ao longo da vida de tantos organismos diferentes e como a função muscular é afetada em diferentes condições de doença. Esta coleção apresenta uma série de técnicas modernas para investigar a função e o reparo muscular em níveis moleculares e mecânicos, usando uma ampla gama de sistemas modelo. Ao fornecer protocolos detalhados, os autores desses artigos já ajudaram a aumentar a consistência e a transparência da pesquisa básica e aplicada do músculo esquelético.
Os autores não têm nada a divulgar.
Nenhum financiamento externo apoiou este trabalho.
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