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Todos os organismos multicelulares na Terra, incluindo animais e plantas, evoluíram de eucariotos unicelulares ~ 1,7 bilhão de anos atrás1. Distintas dos procariontes primitivos, as células eucarióticas têm um núcleo ligado à membrana e muitas organelas fechadas por membrana dentro de seu citoplasma, incluindo mitocôndrias, o aparelho de Golgi, o retículo endoplasmático (RE), lisossomos e vesículas. Essas organelas formam compartimentos nos quais funções biológicas especializadas e atividades metabólicas altamente eficientes são localizadas. Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a maioria das organelas intracelulares contém estruturas funcionais que se enquadram no limite de difração de luz, tornando sua visualização desafiadora2. Técnicas inovadoras de marcação microscópica e biológica estão começando a permitir a visualização de alta resolução de arquiteturas ultrafinas e a dinâmica in vivo de organelas. Esta coleção reúne métodos recentes que rotularam e visualizaram com sucesso diferentes organelas intracelulares em diferentes espécies e, assim, aprofundaram nossa compreensão da regulação espaço-temporal da biologia das organelas.
Nas últimas décadas, o desenvolvimento de sensores fluorescentes e a marcação de proteínas em células vivas facilitaram muito nossa compreensão da dinâmica das redes intracelulares, transdução de sinal e interações célula-célula. Usando métodos sintéticos inorgânicos avançados, nanocristais semicondutores fluorescentes com tamanho em escala nanométrica, também conhecidos como pontos quânticos ou QD, foram inventados como uma nova classe de repórteres ópticos. Normalmente, as partículas QD têm entre 2 e 10 nm de tamanho e têm alta fotossensibilidade, estabilidade e baixa citotoxicidade para as células. As partículas QD surgiram como alternativas aos corantes orgânicos e proteínas fluorescentes para a aquisição de imagens de processos intracelulares em alta resolução. No protocolo de Aishwarya et al., os autores descrevem a imunomarcação mediada por QD seguida de imagem com microscopia eletrônica de transmissão (MET)3. Ao realizar a marcação e a imagem QD direcionada a anticorpos sob TEM em super-resolução, os autores visualizaram com sucesso a localização do Sigmar1 em várias organelas celulares em células cardíacas de camundongos adultos e destacaram seu enriquecimento nos lisossomos e nas membranas mitocondriais. Além de enfatizar a alta resolução e alta sensibilidade do QD-TEM, os autores também mencionam várias desvantagens dos métodos. Por exemplo, o tetróxido de ósmio usado na imunomarcação mediada por QD destrói irreversivelmente as propriedades da amostra, e a otimização das etapas de fixação e desmascaramento do antígeno é um elemento chave, mas desafiador, para garantir imagens de alta qualidade.
Além do QD, muitos outros corantes diferentes foram aplicados com sucesso para rotular organelas em células vivas. Esses métodos facilitaram a imagem ao vivo do processo de transformação ou translocação de organelas celulares in vivo. Às vezes, vários corantes específicos de organelas são usados para visualizar diferentes tipos de organelas simultaneamente. No protocolo de Liu, Li et al.4, os autores fornecem um protocolo detalhado para a coloração e imagem ao vivo de mitocôndrias e lisossomos em células de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) usando dois corantes diferentes: MitoTracker Green e LysoTracker Red4. Neste estudo, ambos os corantes apresentaram alta sensibilidade fluorescente e estabilidade específica para mitocôndrias e lisossomos, respectivamente. Além disso, os autores observaram e registraram com sucesso o processo celular crítico in vivo da mitofagia induzida por carbonilcianeto-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) em células MEF usando o protocolo. Na discussão, os autores mencionam que o protocolo pode ser aplicado com diferentes linhagens celulares ou células de tecidos, otimizando a concentração do corante e o tempo de coloração.
Ao fazer uso de construtos repórter compostos de proteínas específicas de organelas fundidas a marcadores fluorescentes, pode-se observar in vivo a dinâmica de organelas e padrões de expressão sem imunomarcação. No protocolo de Liu, Zhu et al.5, os autores fornecem um protocolo detalhado para imagens da maioria dos tipos de organelas subcelulares na levedura viva em brotamento, Saccharomyces cerevisiae5. Para iniciantes que trabalham com levedura em brotamento, este protocolo é útil para aprender como identificar a localização subcelular de proteínas e rastrear organelas de interesse usando imagens de lapso de tempo. Uma limitação do protocolo é que a maioria das construções usadas no protocolo não pode ser usada para rotular organelas em outras espécies. Para diferentes tipos de células eucarióticas, os padrões específicos de organelas de proteínas fluorescentes ainda precisariam ser validados por imunocoloração de anticorpos.
Um ensaio de captação de anticorpos foi desenvolvido pela primeira vez para a marcação viva específica da sinalização endossômica Notch / Delta nos precursores de órgãos sensoriais da Drosophila notum6. Devido à natureza sensível à dosagem da sinalização Notch / Delta, expressar uma construção repórter dentro das células não é adequado para visualizar a sinalização Notch / Delta in vivo, uma vez que uma cópia extra do gene fundido repórter interromperia a sinalização normal e, por sua vez, o destino da célula. No protocolo de Zhao e Guo7, os autores aplicam o ensaio de captação de anticorpos para imagens do tráfego endossômico de Notch / Delta nos progenitores da glia radial do cérebro do peixe-zebraem desenvolvimento 7. No protocolo, após a microinjeção do anticorpo conjugado anti-DeltaD-Atto647N precisamente no ventrículo embrionário do rombencéfalo de 24 hpf (horas após a fertilização), todo o processo de tráfego endossômico é registrado usando o anticorpo anti-DeltaD-Atto647N internalizado em toda a mitose dos progenitores da glia radial. No estudo, verificou-se que o ensaio de captação de anticorpos não interferiu na sinalização Notch/Delta. Este protocolo pode ser usado para visualizar outra sinalização ligante-receptor de membrana, dado que um anticorpo para o domínio extracelular da proteína de interesse está disponível.
Desenvolvimentos recentes em microscopia de expansão (ExM), envolvendo a expansão física da amostra dentro de um hidrogel expansível, permitiram que microscópios confocais convencionais fossem usados para imagens de super-resolução. Desde a sua invenção, o ExM foi testado com muitos tipos diferentes de amostras biológicas8. Um dos principais desafios do ExM é a perda de sinal fluorescente durante as etapas de polimerização e digestão. O ExM de retenção de rótulos recentemente desenvolvido resolveu o problema com âncoras trifuncionais9. No protocolo de Park et al.10, os autores descrevem como realizar o ExM de retenção de rótulos (LR-ExM) com um conjunto de âncorastrifuncionais10. O protocolo melhora a imagem de microscopia de expansão não apenas evitando a perda de sinal, mas também promovendo a rotulagem de alta eficiência com etiquetas SNAP ou CLIP. Em seu estudo, os autores demonstraram com sucesso o LR-ExM multicolorido para uma variedade de estruturas subcelulares e alcançaram resolução molecular única ao combinar LR-ExM com microscopia de reconstrução óptica estocástica de super-resolução (STORM).
Com o rápido desenvolvimento da microscopia de super-resolução e o advento de novas técnicas de marcação fluorescente, podemos antecipar novas melhorias nos métodos e protocolos para visualizar organelas intracelulares em uma resolução sem precedentes. Esses esforços estão prontos para trazer novos avanços na compreensão da dinâmica e funções das organelas intracelulares.