Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.
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Artigo de método
Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e
Neste artigo
Resumo
Resumo
A tecnologia CRISPR/Cas9 aumentou o valor do peixe-zebra para modelar doenças genéticas humanas, estudar a patogênese de doenças e triagem de drogas, mas as limitações do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) são um grande obstáculo para a criação de modelos animais precisos de doenças genéticas humanas causadas por variantes de nucleotídeo único (SNVs). Até agora, algumas variantes SpCas9 com ampla compatibilidade PAM mostraram eficiência em peixes-zebra. A aplicação do editor de base de adenina (ABE) otimizado mediado por SpRY, zSpRY-ABE8e, e gRNA modificado sinteticamente em zebrafish permitiu uma conversão eficiente da base adenina-guanina sem restrição de PAM. Descrito aqui é um protocolo para edição eficiente de base de adenina sem limitação de PAM em zebrafish usando zSpRY-ABE8e. Injetando uma mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificado em embriões de zebrafish, um modelo de doença do peixe-zebra foi construído com uma mutação precisa que simulou um sítio patogênico do fator de maturação do ribossomo TSR2 (tsr2). Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estabelecimento de modelos de doença precisos para o estudo de mecanismos e tratamentos de doenças.
Introdução
Variantes de nucleotídeo único (SNVs) que causam mutações missense ou nonsense são a fonte mais comum de mutações no genoma humano1. Para determinar se um determinado SNV é patogênico e esclarecer sua patogênese, modelos animais precisos são necessários2. Os peixes-zebra são bons modelos de doenças humanas, exibindo um alto grau de homologia fisiológica e genética com humanos, um ciclo de desenvolvimento curto e forte capacidade reprodutiva, o que é vantajoso para pesquisas de características e mecanismos patogênicos, bem como triagem de drogas3.
O sistema CRISPR/Cas9 t....
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Protocolo
Este estudo foi conduzido em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Normal do Sul da China.
1. Preparação de gRNA sinteticamente modificado e mRNA zSpRY-ABE8e
- Projetar o gRNA de acordo com publicações anteriores37,38.
- Selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM (onde R é A ou G, e Y é C ou T)18. Certifique-se de que o nucleotídeo de adenina alvo esteja na janela de edição altamente ativa (terceiro ao ....
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Resultados
A mutação do TSR2 tem sido relatada como causadora da anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aqui, um modelo de zebrafish DBA foi construído com uma mutação tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A adenina do códon inicial do zebrafish tsr2 foi convertida com sucesso em guanina usando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
A análise EditR dos resultados do sequenciamento de Sanger mostrou que havia uma sobreposição A/G na base d.......
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Discussão
Este protocolo descreve a construção de um modelo de doença do zebrafish usando o editor base zSpRY-ABE8e. Em comparação com o caminho HDR tradicional para substituição de base, este protocolo pode alcançar uma edição de base mais eficiente e reduzir a ocorrência de indels. Ao mesmo tempo, este protocolo envolve a implementação da estratégia recentemente proposta de nocaute genético i-Silence em peixes-zebra. Em conjunto, o zSpRY-ABE8e aumentará a aplicação de modelos de peixe-zebra na pesquisa de doenças.
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) pela edição do texto em inglês de um rascunho deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Área-Chave da Província de Guangdong (2019B030335001), pelo Programa Nacional de P&&D da China (2019YFE0106700), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070819, 31970782) e pelo Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave Provincial de Biologia Patogênica e Epidemiologia para Animais Aquáticos (PBEA2020YB05).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose usado para fazer uma placa de injeção |
| Capilares de vidro borosilicato | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Kit | Falcon 351029 | ||
| ClonExpress | Kit Vazyme | C115 | para clone de infusão |
| Serviço de otimização de códons | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Comprimento:32 mm, capacidade:0,5 μ L |
| EasyEdit serviço de gRNA | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Usado para quebrar meedle |
| Flaming/Brown Micropipeta Extracter | Instrumento de gagueira | P-97 | Usado para puxar os capilares de vidro |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Usado para reação de PCR |
| Caixa de clima artificial inteligente | TENLIN | PRX-1000A | Usado para cultivar embriões de peixe-zebra |
| Metilcelulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Usado para fixar peixe-zebra ao fotografar |
| pontas de pipeta Microloader& nbsp; | Kit Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE | |||
| Kit de Mutagênese Rápida Mut Express II V2 | Vazyme | C214-01 | Kit para microinjetor pneumático de mutagênese dirigida ao local |
| ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | ||
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Kit Qiagen | 73504 | para purificação de RNA |
| Serviço de sequenciamento Sanger | Sangon Biotech | ||
| Hidróxido de sódio, granulado | Sangon | A100173-0500 | NaOH usado para extração de genoma |
| Microscópio Estéreo | Olympus | SZX10 | Usado para fotografia do fenótipo |
| Microscópio Estéreo Zoom da Série SZ | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Kit Ambion | AM1348 | para transcrição in vitro |
| Kit de Plasmídeo TIANprep Mini | TIANGEN | DP103-03 | Kit para kit de extração de plasmídeo |
| Kit de Purificação Mini TIANquick Kit de Purificação TIANGEN | DP203-02 | para purificação de plasmídeo linearizado | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Usado para anestesiar peixe-zebra |
| Tris (hidroximetil) aminometano | Sangon | A600194-0500 | Componente de Tris· HCl usado para extração do genoma |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Endonuclease de restrição usada para linearização de plasmídeo |
Referências
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017....
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Reimpressões e permissões
