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Abordagens baseadas em espectrometria de massa para a análise da estrutura de ordem superior da proteína

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DOI:

10.3791/64979

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3 de março de 2023

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1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

Neste artigo

Resumo

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Espino, J. A., Jones, L. M. Pegada de proteína do radical hidroxila in vivo para o estudo das interações proteicas em Caenorhabditis elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (158), e60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Caracterizando proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas na célula. Jornal de Experimentos Visualizados. (157), e60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Abordagens espectrométricas de massa para estudar a estrutura e as interações de proteínas em pós liofilizados. Jornal de Experimentos Visualizados. (98), e52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Uma plataforma de espectrometria de massa de troca hidrogênio-deutério (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas peptídicas. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), e61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Marcação covalente com dietilpirocarbonato para estudar a estrutura de ordem superior de proteínas por espectrometria de massa. Jornal de Experimentos Visualizados. (172), e61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Incubadora de plataforma com estágio XY móvel: Uma nova plataforma para implementar a oxidação fotoquímica rápida de proteínas na célula. Jornal de Experimentos Visualizados. (171), e62153 (2021).

Haupt, C. et al. Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de conjuntos de proteínas de múltiplas subunidades. Jornal de Experimentos Visualizados. (129), e56747 (2017).

Lento, C. et al. Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério de ionização por eletrospray resolvida no tempo para estudar a estrutura e a dinâmica de proteínas. Jornal de Experimentos Visualizados. (122), e55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Pegada de proteína radical hidroxila livre de laser para realizar análise estrutural de ordem superior de proteínas. Jornal de Experimentos Visualizados. (172), e61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Permitindo a compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças na topografia de proteínas. Jornal de Experimentos Visualizados. (163), e61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Troca de hidrogênio/deutério baseada em eletroforese capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo. Jornal de Experimentos Visualizados. (172), e62672 (2021).

Editorial

A estrutura de ordem superior (HOS) é um aspecto importante da caracterização de proteínas, pois está intimamente relacionada à função da proteína. A espectrometria de massa (MS) é um dos principais métodos para avaliar a proteína HOS1. Embora as abordagens baseadas em MS sejam incapazes de resolver a estrutura da proteína com resolução atômica, elas têm as vantagens de resolução espacial média a alta, alta especificidade, baixos requisitos de quantidade de amostra, alto rendimento e recursos proteômicos.

As abordagens de pegada de proteína baseadas em MS avaliam a HOS da proteína analisando a superfície acessível ao solvente da proteína e geralmente são acopladas a diferentes abordagens de rotulagem química. A marcação reversível, como por troca hidrogênio-deutério (HDX), tem como alvo os hidrogênios amida da espinha dorsal na proteína 1,2. A rotulagem irreversível utiliza produtos químicos que visam resíduos específicos de aminoácidos3 ou radicais que rotulam uma variedade de resíduos diferentes com maior velocidade de reação1. A reticulação química também faz parte da categoria de marcação irreversível, mas sua característica bivalente permite a determinação de restrições espaciais entre dois locais reticulados, o que oferece insights topológicos únicos 4,5. Todas essas abordagens podem ser combinadas para formar uma "caixa de ferramentas", tornando a EM uma ferramenta valiosa para elucidar a proteína HOS.

Organizamos esta coleção de métodos para apresentar os avanços recentes no campo da análise de HOS de proteínas baseadas em MS. O primeiro conjunto de artigos apresenta abordagens baseadas em HDX. Habibi e Thibodeaux6 descrevem uma abordagem HDX-MS contínua e ascendente relativamente clássica. Com a troca de hidrogênio-deutério (H/D) em solução em vários tempos de troca, seguida pela digestão de pepsina na coluna, o nível de absorção de deutério pode ser determinado no nível do peptídeo. Ao realizar experimentos diferenciais (ou seja, estados ligados versus não ligados), os peptídeos que mostram níveis aumentados ou diminuídos de captação de deutério representam áreas que experimentam mudanças na HOS. Os autores usam sintetases de lantipeptídeos para demonstrar bem o fluxo de trabalho HDX-MS.

Além da abordagem de baixo para cima, o HDX-MS também pode ser realizado de cima para baixo, permitindo que os analistas apliquem diferentes estratégias de separação no nível da proteína intacta. Chaihu et al.7 utilizam eletroforese capilar para separar diferentes estados proteicos ou proteoformas que coexistem na solução. As proteínas sofrem a troca H / D durante a eletroforese enquanto migram no capilar na solução eletrolítica de fundo deuterada, e isso é seguido por análise de MS de cima para baixo e fragmentações em fase gasosa para avaliar os níveis de captação de deutério nos níveis global e de fragmento. Por fim, existem também dois outros métodos nesta coleção que destacam diferentes métodos de troca H/D, a saber, troca por potência liofilizada8 e troca após ionização por eletrospray9.

O segundo grupo de artigos cobre o método de rotulagem irreversível. Entre eles, a oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) utiliza radicais como espécies rotuladoras para marcar a superfície da proteína10,11. Na prática, o peróxido de hidrogênio é fotoativado por meio de um laser para produzir radicais hidroxila, que servem como espécies de marcação ativa. Misra eSharp12 apresentam uma estratégia para dosimetria radical na qual a adenina é usada como repórter para a concentração radical e um sistema de dosimetria radical em linha é usado para monitorar a resposta da adenina. Isso permite a compensação em tempo real das concentrações de radicais hidroxila e, assim, a normalização das condições de reação para fornecer uma leitura precisa. Posteriormente, Weinberger e Chea colaboraram com o grupo Sharp para desenvolver uma plataforma FPOP sem laser13. Ao substituir o laser perigoso por uma fonte de luz de plasma e combiná-lo com a dosimetria radical em linha e um sistema automatizado de coleta de amostras, eles desenvolvem e fornecem uma solução integrada para pesquisadores que precisam caracterizar a proteína HOS.

Os três artigos do grupo de Jones 14,15,16 exploram a possibilidade de trazer FPOP e pegada proteica para estudos in vivo. A vantagem dessa abordagem é inédita, pois permite que a proteína HOS seja analisada no ambiente nativo. A aplicação bem-sucedida da pegada nas células14 e em Caenorhabditis elegans15 abre novas possibilidades para rastrear o HOS de todo o proteoma em seu estado nativo, permitindo assim uma compreensão profunda da proteína HOS que não pode ser alcançada por meio de outras ferramentas.

Outro método importante de rotulagem irreversível utiliza reagentes químicos que visam resíduos de aminoácidos específicos3. Kirsch et al.17 relatam um fluxo de trabalho bem utilizado de pegada de proteína por meio de marcação covalente. Usando dietilpirocarbonato como reagente de marcação, os autores investigam as mudanças na proteína HOS rotulando alguns tipos de resíduos de aminoácidos na superfície da proteína. Por meio de experimentos diferenciais seguidos de digestão proteolítica e análise de MS de baixo para cima, juntos o fluxo de trabalho permite a identificação de mudanças nas acessibilidades dos solventes, que se relacionam diretamente com as mudanças no HOS.

Por fim, a reticulação química é outra abordagem importante que utiliza reagentes químicos bivalentes para marcar proteínas 4,5. Os reticuladores químicos são usados para reticular duas proteínas que estão espacialmente próximas uma da outra e, muitas vezes, formam um complexo estrutural. Haupt et al.18 relatam um protocolo no qual demonstram o uso de reticuladores químicos para entender a arquitetura de complexos proteicos. O complexo de proteínas reticuladas pode ser analisado em dois níveis diferentes. Por meio da digestão proteolítica seguida pela identificação da EM, os dipeptídeos reticulados revelam os locais de interação do complexo proteico. Ao analisar a amostra reticulada através da massa intacta, as informações estequiométricas sobre as subunidades de proteína dentro do complexo estão prontamente disponíveis.

Para resumir, testemunhamos um desenvolvimento substancial em ferramentas baseadas em MS para análise de HOS de proteínas nas últimas três décadas. A pegada irreversível e reversível, juntamente com a análise de MS, complementam-se e, juntas, contribuem significativamente para a caracterização da proteína HOS. Os trabalhos incluídos nesta coleção de métodos representam métodos de última geração no campo de análise de HOS de proteínas baseadas em MS; esses estudos são um recurso valioso para pesquisadores que estão tentando utilizar abordagens baseadas em EM para responder a perguntas críticas. De uma perspectiva mais ampla, incorporar dados de pegada em previsões estruturais é fundamental para quebrar o limite de resolução espacial em métodos baseados em MS. Existem trabalhos pioneiros que demonstram a viabilidade de tal abordagem 19,20. Além disso, a integração de plataformas também é crucial, pois essas abordagens são complementares entre si e fornecem insights de diferentes perspectivas21,22. Os métodos relatados nesta coleção demonstram o poder dessa integração, e haverá um desenvolvimento contínuo nessa direção. Com todos esses avanços, a abordagem baseada em EM cresceu além da determinação do peso molecular, e o crescimento contínuo será visto neste campo nas próximas décadas.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores não têm agradecimentos.

Referências

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

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Protein InteractionsHydroxyl Radical FootprintingPhotochemical OxidationHydrogen-deuterium ExchangeCovalent LabelingProtein AnalysisElectrospray IonizationChemical Cross-linkingMulti-subunit AssembliesConformational Characterization
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