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As interações biomoleculares são atores-chave nos processos biológicos e, portanto, um aspecto fundamentalmente importante das ciências da vida. As técnicas de fluorescência tornaram-se alguns dos métodos mais poderosos e amplamente aplicados para investigar e entender esses processos. As abordagens de fluorescência in vitro oferecem o potencial para detecção em tempo real de interações moleculares extracelulares e intracelulares, o que constitui uma grande vantagem sobre outras abordagens. Isso tem sido usado para uma variedade de interações proteína-proteína, proteína-ácido nucléico e proteína-membrana, que desempenham papéis cruciais na regulação dos processos celulares.
Esta coleção fornece uma visão geral de várias técnicas e aplicações baseadas em fluorescência para o estudo de interações biomoleculares e amplia nossa compreensão dos processos celulares.
Reiser et al.1 descrevem um método de alto rendimento para analisar a cinética celular de células individuais por meio de aquisição e processamento automatizado de imagens (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Usando essa técnica, os repórteres fluorescentes fornecem uma leitura resolvida no tempo de vários processos biológicos independentes, como expressão gênica de célula única após a transfecção, resposta celular em cascatas de sinalização, eventos apoptóticos ou diferenciação de células-tronco. Os autores realizam imagens em matrizes de células isoladas usando microscopia de lapso de tempo de varredura, levando a centenas de trajetórias de células únicas e dados suficientes para análise estatística. Os traços de tempo de fluorescência de célula única ajudarão os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de entrega de genes e resolver a heterogeneidade celular - uma marca registrada de sistemas biológicos complexos normalmente ditados por flutuações intrínsecas.
Konate et al.2 relatam um método biofísico para caracterizar a interação, perturbação e/ou permeabilização de peptídeos de interação de membrana. Em seu protocolo, eles descrevem com precisão as diferentes etapas para formular e purificar lipossomas e caracterizar o vazamento de fluorescência. O método é aplicado com um peptídeo penetrante celular (CPP) chamado WRAP em associação com um pequeno RNA interferente (siRNA) ou combinado com um potente peptídeo terapêutico (iCAL36) e é comparado ao conhecido CPP, penetratina. Esta técnica apresenta múltiplas vantagens. É rápido e simples de implementar. Permite um controle rígido da composição da membrana lipídica para imitar diferentes tipos de membranas celulares. Os fluoróforos podem ser adaptados dependendo do peptídeo de interesse e de suas propriedades de vazamento de membrana. Finalmente, a amostra é extremamente estável após a preparação. A versatilidade da técnica a torna uma abordagem útil para investigar várias questões biológicas relacionadas a danos celulares ou administração de medicamentos.
A presença de fosfatidilserina (PS) nas membranas celulares de mamíferos é importante em diferentes processos de sinalização, como a apoptose celular ou no recrutamento de proteínas para reparo de membranas. A transferência e as mudanças na distribuição do PS na superfície das membranas plasmáticas são uma questão-chave que Ikhlef et al.3 abordam com seu artigo. Eles descrevem um protocolo para medir em tempo real o transporte e a troca de lipídios PS e PI-4-P pela proteína de levedura recombinante Osh6p. O método utiliza sensores fluorescentes para detectar se uma proteína de transferência de lipídios (LTP) extrai ou transfere lipídios em membranas artificiais ao longo de um gradiente entre vesículas lipídicas. Este protocolo permite trabalhar com lipídios não marcados para permitir a ligação correta dos lipídios à LTP. Além disso, uma melhor resolução de tempo é alcançada em comparação com os métodos convencionais, como ensaios baseados em radioatividade ou espectrometria de massa. Este método ajudará os pesquisadores a entender melhor a extração e troca de lipídios entre diferentes organelas e membranas.
A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é um método poderoso para estudar sistemas biomoleculares. Esta técnica pode ser aplicada a moléculas únicas (por exemplo, smFRET) e permite a medição de distâncias absolutas dentro de biomoléculas. Abdelhamid et al.4 apresentam um protocolo passo a passo sobre como realizar o smfBox, uma configuração confocal recentemente desenvolvida capaz de medir a eficiência do FRET entre dois corantes em moléculas únicas de difusão livre. Eles mostram como implementar e usar a técnica smFRET desde a preparação da amostra até a configuração, alinhamento, aquisição de dados e análise do instrumento. Além disso, eles descrevem como determinar os fatores de correção necessários para medições precisas de distância derivadas do FRET. Aqui, o método é aplicado a duplexes de DNA de difusão livre e pode ser estendido a uma ampla gama de aplicações, como o estudo de mudanças conformacionais de proteínas ou interações proteína-DNA.
Os processos biológicos envolvem interações biomoleculares muito diversas e numerosas que deixam amplo espaço para o desenvolvimento de novos ensaios ou sensores baseados em fluorescência. Esta coleção oferece aos pesquisadores uma visão geral das inovações e desenvolvimentos em métodos baseados em fluorescência. Cada artigo lança luz sobre um método diferente baseado em fluorescência, destacando o quão importantes e versáteis os ensaios fluorescentes se tornaram. A coleção descreve esses métodos e, portanto, incentiva o uso generalizado deles entre diferentes grupos e áreas de pesquisa.