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Historicamente, os cientistas confiaram fortemente em estudos em animais para determinar se um produto médico (ou seja, medicamento ou dispositivo médico) é seguro antes de testá-lo em humanos. Embora os testes em animais ainda se justifiquem em muitas situações, encontrar alternativas é altamente desejável. Com os recentes avanços na ciência e na engenharia, o desenvolvimento de alternativas aos testes em animais é mais viável do que nunca. Um foco renovado no desenvolvimento de métodos alternativos in vitro humanos para avaliação da segurança cardíaca é pelo menos parcialmente atribuível aos avanços na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As células cardíacas humanas podem ser geradas em laboratório usando uma simples amostra de sangue ou pele de um paciente, produzindo cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC-CMs) adequados para testes robustos de alto rendimento. O progresso na bioengenharia de tecidos 3D, tecnologias de arranjo de microeletrodos, imagens de células vivas e outras tecnologias também foram fundamentais para o desenvolvimento dos protocolos incluídos nesta coleção.
O protocolo de Gerges et al.1 aplica um método óptico não invasivo (MyoBLAZER) para avaliar alterações na contratilidade em cardiomiócitos ventriculares primários humanos adultos. As células são estimuladas eletricamente e a análise de imagem mede o encurtamento do sarcômero em várias células em paralelo. Este método pode coletar curvas de concentração-resposta a cada 30 minutos por composto por dispositivo e fornece dados de relação estrutura-atividade. Este método óptico não invasivo ajuda a preservar a fisiologia e a farmacologia dos cardiomiócitos humanos adultos durante a triagem de alto rendimento. Além disso, o uso de cardiomiócitos humanos adultos pode fornecer uma peça translacional crítica para prever a contratilidade.
A metodologia de Lickiss et al.2 apresenta uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de pró-maturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria usando um substrato de cultura de células macio e flexível à base de silício. A abordagem foi bem-sucedida ao restabelecer a resposta inotrópica positiva fisiológica ao isoproterenol em hiPSC-CMs saudáveis disponíveis comercialmente, que está sabidamente ausente na cultura padrão (substrato rígido) sem a necessidade de um sistema 3D. O sistema híbrido permite a medição direta da força de contração (mN/mm2), taxa de batimento, bem como densidade e integridade da monocamada celular. Ele também aborda os desafios de um sistema 3D tradicional (ou seja, baixo rendimento, necessidades consideráveis de treinamento), reduzindo o tempo e os custos necessários para concluir o ensaio.
A coleção também inclui o trabalho de Feaster et al.3, que demonstram um método in vitro, de alto rendimento e não invasivo para avaliar a terapia de modulação da contratilidade cardíaca (CCM) em cardiomiócitos de células-tronco humanas 2D plaqueados em um colchão Matrigel flexível, usando microscopia baseada em vídeo sem sonda. Os autores destacam os efeitos agudos da CCM nas propriedades contráteis de hiPSC-CMs saudáveis e doentes. Essa ferramenta oferece um método de baixo custo para entender a segurança ou eficácia dos CCMs e pode reduzir a dependência de estudos em animais e auxiliar na tomada de decisões regulatórias de dispositivos médicos de eletrofisiologia cardíaca.
O protocolo refinado de Schaefer et al.4 descreve uma nova extensão do sistema padrão de matriz de microeletrodos (MEA) que normalmente registra o potencial de campo extracelular em hiPSC-CMs, permitindo registros de potencial de ação intracelular abrindo membranas celulares com pulsos de feixe de laser de nanossegundos. Este dispositivo não apenas inclui vantagens padrão de MEA (ou seja, monitoramento de propagação de sinal, experimentos agudos e crônicos), mas também permite uma visão da forma do potencial de ação intracelular sem o uso de fortes pulsos de campo elétrico para eletroporação celular.
O protocolo de Berry et al.5 descreve uma nova plataforma que permite a fabricação reprodutível de tecidos musculares (EMTs) projetados em 3D para medições diretas da força de contratilidade. O instrumento pode detectar mudanças de micronewton na força de contratilidade, tornando-o uma ferramenta poderosa para triagem de compostos dependentes da dose. A contratilidade no tecido cardíaco baseado em hiPSC, bem como nos tecidos musculares esqueléticos, pode ser registrada em até 24 tecidos simultaneamente, e os dados podem ser analisados longitudinalmente ao longo de semanas ou meses. Portanto, habilidades ou treinamento adicionais mínimos são necessários para os pesquisadores.
Finalmente, a publicação de Zhao et al.6 descreve uma série de ensaios funcionais (potencial de campo extracelular, potencial de ação, contratilidade e cálcio) otimizados para uso com cardiomiócitos que podem ser gerados internamente por laboratórios de usuários. Isso pode ser feito usando protocolos de diferenciação publicados anteriormente e iPSCs disponíveis no Biobank do Instituto Cardiovascular da Universidade de Stanford (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), fornecendo uma ampla gama de células "doentes" e de controle. Este é um conjunto completo de métodos para os principais registros de contratilidade cardíaca e eletrofisiologia, incluindo abordagens padrão (patch clamp, matrizes de microeletrodos, sondas de fluorescência sensíveis ao cálcio e medições de contratilidade baseadas em vídeo).
Em conclusão, embora a coleção de métodos atuais não pretenda estar completa (e continue a crescer), já é um conjunto relativamente abrangente de métodos que ilustram muitos desafios atuais na contratilidade e registros eletrofisiológicos em cardiomiócitos humanos. Inclui protocolos para cardiomiócitos humanos primários1, hiPSC-CMs disponíveis comercialmente derivados de doadores saudáveis 2,3,4, bem como protocolos otimizados para células portadoras de assinatura de cardiopatia congênita 3,6. Esses métodos abrangem várias condições de cultura de células, desde células únicas para experimentos de patch clamp6, até monocamadas hiPSC-CM 2D convencionais em substratos rígidos 1,4, monocamadas de cardiomiócitos 2D em substratos macios e flexíveis 2,3 e, finalmente, tecidos cardíacos projetados em 3D5. Os métodos incluídos utilizam diferentes abordagens para o registro dos parâmetros mais relevantes da fisiologia cardíaca, como contratilidade (medida indiretamente com ensaios baseados em vídeo 1,3,6 ou diretamente com força contrátil 2,5), potencial de ação (em uma única célula usando patch clamp6, potenciais de campo extracelular substitutos com um MEA 4,6, ou usando uma nova abordagem para porar as células para registrar registros semelhantes a potenciais de ação com o sistema MEA padrão4) e transientes de cálcio (usando sondas sensíveis ao cálcio6). Juntos, esses métodos fornecem não apenas protocolos detalhados que podem ser reproduzidos em outros laboratórios, mas também ilustram alguns dos desafios dos métodos cardíacos humanos in vitro, como: imaturidade hiPSC-CM, especialmente ao usar uma cultura 2D padrão em substrato rígido; efeitos indesejados de sondas fluorescentes sensíveis à tensão ou ao cálcio; baixo rendimento dos registros de potencial de ação convencional; dificuldades na interpretação dos registros de duração potencial de campo padrão; e falta de ensaios para a avaliação de dispositivos médicos (por exemplo, vs. medicamentos). É inspirador ver quantos laboratórios estão trabalhando para melhorar esses métodos, o que inevitavelmente levará a uma ampla adaptação desses métodos no futuro.