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Artigo de método

Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

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DOI:

10.3791/64989

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17 de março de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais contendo neurônios de kisspeptina, o principal modulador das células do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Ao agregar conhecimento sobre a atividade neuronal da kisspeptina, essa ferramenta eletrofisiológica tem servido de base para avanços significativos no campo da neuroendocrinologia nos últimos 20 anos.

Resumo

As kisspeptinas são essenciais para a maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) e fertilidade. Os neurônios kisspeptina hipotalâmicos, localizados no núcleo periventricular anteroventral e no núcleo periventricular rostral, bem como o núcleo arqueado do hipotálamo, projetam-se para neurônios do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), entre outras células. Estudos anteriores demonstraram que a sinalização da kisspeptina ocorre através do receptor Kiss1 (Kiss1r), excitando a atividade do neurônio de GnRH. Em humanos e modelos animais experimentais, as kisspeptinas são suficientes para induzir a secreção de GnRH e, consequentemente, a liberação de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH). Uma vez que as kisspeptinas desempenham um papel essencial nas funções reprodutivas, os pesquisadores estão trabalhando para avaliar como a atividade intrínseca dos neurônios hipotalâmicos da kisspeptina contribui para ações relacionadas à reprodução e identificar os neurotransmissores/neuromoduladores primários capazes de alterar essas propriedades. A técnica de patch-clamp de células inteiras tornou-se uma ferramenta valiosa para investigar a atividade de neurônios de kisspeptina em células de roedores. Esta técnica experimental permite aos pesquisadores registrar e medir correntes iônicas excitatórias e inibitórias espontâneas, potencial de membrana de repouso, disparo de potencial de ação e outras propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares. No presente estudo, aspectos cruciais da técnica de patch-clamp de células inteiras, conhecida como medidas eletrofisiológicas que definem os neurônios hipotalâmicos da kisspeptina, e uma discussão de questões relevantes sobre a técnica são revistos.

Introdução

Hodgkin e Huxley fizeram o primeiro registro intracelular de um potencial de ação descrito em vários estudos científicos. Este registro foi realizado no axônio da lula, que tem um grande diâmetro (~500 μm), permitindo que um microeletrodo seja colocado dentro do axônio. Este trabalho proporcionou grandes possibilidades para a pesquisa científica, culminando posteriormente com a criação do modo tensão-pinça, que foi utilizado para estudar a base iônica da geração do potencial de ação 1,2,3,4,5,6,7,8. Com o passar dos anos, a técnica foi se aprimorando, tornando-se amplamente aplicada em pesquisascientíficas6,9. A invenção da técnica patch-clamp, ocorrida no final da década de 1970 por meio de estudos iniciados por Erwin Neher e Bert Sakmann, permitiu aos pesquisadores registrar canais iônicos únicos e potenciais ou correntes de membrana intracelular em praticamente todos os tipos celulares utilizando apenas um eletrodo 9,10,11,12. Os registos de patch-clamp podem ser feitos numa variedade de preparações de tecidos, tais como células cultivadas ou cortes de tecido, quer em modo voltage-clamp (mantendo a membrana celular a uma tensão definida que permite o registo, por exemplo, de correntes dependentes de voltagem e correntes sinápticas) quer em modo corrente-clamp (permitindo o registo de, por exemplo, alterações no potencial de membrana de repouso induzidas por correntes iónicas, potenciais de ação e frequência potencial pós-sináptico).

O uso da técnica patch-clamp possibilitou várias descobertas notáveis. De fato, os achados seminais sobre as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina hipotalâmico localizados nos núcleos periventricular anteroventral e periventricular rostral (VPVV/PeN Kisspeptina), também conhecidos como área periventricular rostral do terceiro ventrículo (RP3V), e núcleo arqueado do hipotálamo (ARHkisspeptina)13,14,15 são de particular interesse. Em 2010, Ducret e colaboradores realizaram os primeiros registros de neurônios deKisspeptinAVPV/PeN em camundongos usando outra ferramenta eletrofisiológica, a técnica de patch-clamp de células soltas. Esses estudos forneceram uma descrição elétrica dos neurôniosKisspeptin AVPV/PeN e demonstraram que seus padrões de disparo são dependentes do ciclo estral16. Em 2011, Qiu e col. utilizaram a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar que os neurônios dakisspeptina ARH expressam correntes endógenas de marcapasso17. Posteriormente, Gottsch e col. mostraram que os neurônios kisspeptin exibem atividade espontânea e expressam correntes de cálcio do tipo h (marca-passo) e do tipo T, sugerindo que os neurônios dakisspeptina ARH compartilham propriedades eletrofisiológicas com outros neurônios marca-passo do sistema nervosocentral18. Além disso, foi demonstrado que os neurônios da kisspeptina ARH exibem taxas de disparo sexualmente dimórficas e que os neurônios daKisspeptina AVPV/PeN exibem um potencial de membrana de repouso (RMP) bimodal influenciado por canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP)19,20. Além disso, foi estabelecido que os esteroides gonadais afetam positivamente a atividade elétrica espontânea dos neurônios kisspeptin em camundongos 19,20,21. São citados os primeiros trabalhos que estudam as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina 16,17,18,19,20. Desde então, muitos estudos têm utilizado a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar quais fatores/neuromoduladores são suficientes para modular a atividade elétrica dos neurônios kisspeptin (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Dada a importância dessa técnica para o estudo dos neurônios necessários para a reprodução, entre outros tipos celulares não abordados aqui, este artigo descreve os passos básicos para o desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras, como preparar as soluções, dissecar e fatiar o cérebro e realizar o selamento da membrana celular para registros. Além disso, questões relevantes sobre a técnica são discutidas, como suas vantagens, limitações técnicas e variáveis importantes que devem ser controladas para um ótimo desempenho experimental.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo e foram realizados de acordo com as diretrizes éticas adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

1. Preparação das soluções

  1. Preparação da solução interna
    NOTA: A solução interna preenche a micropipeta patch-clamp e entrará em contato com o interior da célula (veja um exemplo na Figura 2). As soluções internas podem variar dependendo do tipo de atividade a ser medida33.
    1. Escolha a solução interna considerando sua finalidade experimental e o tipo de registro apropriado. Para registrar o potencial de membrana no modo de fixação de corrente, use a solução interna composta por 120 mM K-gluconato, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl e 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme indicado na Tabela 1.
    2. Utilizar água deionizada suficiente para atingir 90% do volume final da solução. Esse volume garantirá espaço suficiente para ajustar o pH e a osmolaridade.
    3. Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes completamente, ajuste o pH para 7,2-7,3 com 5 M KOH usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve estar em torno de 275-280 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo).
    4. Preparar a solução interna com antecedência e conservar a 8 °C. Adicione o ATP no dia do experimento. Conservar a solução interna contendo ATP a -20 °C (alíquotas de 1 ml) durante 3-4 meses.
  2. Preparação da solução de fatiamento
    1. Preparar solução de fatiamento contendo 238 mM de sacarose, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de glicose, 1,0 mM de CaCl 2 e 5,0 mM de MgCl2. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme mostra a Tabela 2. O volume exato desta solução a ser preparada dependerá do tamanho da câmara de corte.
    2. Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO2). Conecte tubos de polietileno (1,57 mm de diâmetro externo [OD] x 1,14 mm de diâmetro interno [ID]) a um cilindro de carbogênio para fornecer carbogênio à solução de fatiamento. Segure a extremidade aberta do tubo dentro do copo que contém a solução de fatiamento.
    3. Depois de misturar bem todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 com 10% de ácido nítrico usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-295 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo). Depois, arrefecer a solução a 0-2 °C.
  3. Preparar solução aCSF para gravações
    1. Preparar solução artificial de líquido cefalorraquidiano (aCSF) para gravações contendo NaCl 124 mM, KCl 2,8 mM, NaHCO3 26 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, MgSO4 mM, glicose 5 mM e CaCl 22,5mM. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, indicado na Tabela 3.
    2. Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO 2), conforme descrito na etapa 1.2.2.
    3. Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 (10% de ácido nítrico pode ser usado) usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-300 mOsm. Depois, despeje o aCSF em um copo e mantenha em banho-maria a 30 °C.

2. Dissecção e fatiamento cerebral

NOTA: Como diferentes estruturas cerebrais podem exigir cortes em diferentes planos (cortes coronais, sagitais ou horizontais), a abordagem exata para a obtenção dos cortes depende da região cerebral de interesse. Tipicamente, estudar as células que expressam Kiss1 no AVPV/PeN e ARH (aqui denominados como neurônios AVPV/PeNKisspeptin e neurônios ARHkisspeptin; Figura 2A,B), cortes cerebrais coronais (200-300 μm) são usualmente confeccionados 17,19,20,21,34. Os neurôniosKisspeptin AVPV/PeN estão localizados a aproximadamente 0,5 a -0,22 mm do bregma, enquanto os neurônios ARHkisspeptin estão em -1,22 a -2,70 mm. A localização dos núcleos pode ser determinada usando um atlas estereotáxico do cérebro de camundongo35 ou o Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos36 foram utilizados neste estudo.

  1. Remoção do cérebro
    1. Prepare o local da dissecção e as ferramentas necessárias para extrair o cérebro: tesoura de decapitação, tesoura de íris, tesoura curva de Castroviejo, osteótomo, pinça, espátula, papel de filtro, placa de Petri, lâmina de barbear e cola de cianoacrilato.
    2. Antes de fazer os cortes, prepare a bancada na qual será realizada a dissecção, pois todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados rapidamente. Certifique-se de ter acesso a um dispositivo de fatiamento, como um vibratome.
    3. Prepare uma câmara de gravação para manter as fatias cerebrais antes de cortar o tecido. Adquira uma câmara de gravação, dimensões de banho de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de uma marca comercial (Tabela de Materiais) ou faça uma in-house.
      NOTA: Uma câmara de recuperação interna pode ser fabricada da seguinte forma: corte uma placa de 24 poços para que nove poços estejam disponíveis. Cole uma tela de nylon na base dos nove poços. Com o restante da placa do poço, faça uma base para que a parte inferior do nylon fique livre. Essa base adaptada pode ser colocada dentro de um copo de 500 mL contendo o aCSF (Figura 1 Suplementar).
    4. Após o preparo tudo, anestesiar o animal com anestésico inalatório com isoflurano a 4%-5%. A anestesia deve estar de acordo com um protocolo aprovado pelo comitê de ética. Logo após o animal ficar imóvel, realize testes de pinça da cauda e da pata para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado.
    5. Decapite rapidamente os ratos enquanto o coração ainda está ativo para aumentar a viabilidade celular. Colha o cérebro rapidamente após a decapitação.
    6. Com a tesoura cirúrgica, faça uma incisão na pele na parte superior do crânio do animal, de caudal a rostral, e retire o couro cabeludo da cabeça do animal. Em seguida, cortar a placa interparietal ao longo da sutura sagital com a tesoura da íris e remover o osso occipital. Deslize o osteótomo sob o osso parietal e retire-o suavemente até que o cérebro fique exposto.
    7. Depois de expor o cérebro, vire a cabeça de cabeça para baixo, abaixe suavemente o cérebro para visualizar o nervo trigêmeo de cada lado e, em seguida, corte o nervo trigêmeo usando uma tesoura curva de Castroviejo. Depois de visualizar o hipotálamo, identifique o nervo óptico e corte-o suavemente.
      NOTA: Tenha cuidado ao cortar o nervo óptico, pois puxá-lo rasgará a área hipotalâmica adjacente que contém o núcleo da VPV/PeN.
    8. Corte a porção mais anterior do lobo frontal e remova o cérebro completamente. Mergulhe imediatamente o cérebro na solução de fatiamento até adquirir as fatias.
  2. Fatiamento de amostras cerebrais
    1. Coloque o cérebro em papel filtro (apoiado em uma placa de Petri) para secar o excesso de solução. Em seguida, com uma lâmina de barbear cortante afiada, execute um corte coronal separando o tronco cerebral com o cerebelo do resto do tecido.
    2. Em seguida, cole a porção caudal do cérebro na base do vibratomo e preencha a câmara do dispositivo de fatiamento com a solução de fatiamento/aCSF resfriada a 0-2 °C. Durante o procedimento, coloque gelo seco ao redor da câmara vibratória para manter a solução de fatiamento fria.
    3. Insira a lâmina de barbear no vibratomo e defina os parâmetros de corte apropriados do dispositivo: velocidade = 3, frequência = 9 e alimentação = 250 μm. Utilizar uma pipeta de transferência acrílica (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir os cortes para a câmara de recuperação (descrita no passo 2.1.3) durante o procedimento de fatiamento do tecido. Aguarde 60 min para recuperação do tecido após a aquisição do corte.

3. Vedação de células para gravação

  1. Certifique-se de que todos os equipamentos (microscópio, amplificador, digitalizador, micromanipulador e outros) estejam ligados antes de iniciar a gravação.
  2. Preencher a câmara de gravação, de marca comercial (Tabela de Materiais), acoplada ao microscópio com a solução de aCSF para gravações. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a uma taxa de 2 mL/min.
  3. Transfira uma fatia cerebral de interesse (uma de cada vez) para a câmara de gravação. Use uma pipeta de transferência de acrílico (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir as fatias hipotalâmicas para a câmara. Use uma âncora de corte (Tabela de Materiais) para segurar a fatia para que ela não se mova durante a perfusão do aCSF.
  4. Coloque uma fatia no centro da câmara de gravação conectada ao microscópio. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um perfeito alcance da micropipeta de registro.
  5. Use a lente objetiva de baixa potência de um microscópio de imersão (10x ou 20x) para auxiliar no posicionamento do corte e na localização da região de interesse.
  6. Após localizar a região de interesse, alternar a lente objetiva para a lente de alta potência (63x) e focalizar o nível tecidual, observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células kisspeptina na superfície do corte cerebral20.
  7. Quando uma possível célula de destino estiver localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato, como um quadrado, sobre a área de interesse. A marca de tela do computador ajuda a guiar a posição da micropipeta de gravação para a célula.
  8. Depois de determinar a localização exata da célula alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de gravação preenchida com a solução interna. Ao colocar a micropipeta no suporte do eletrodo, verifique se a solução interna está em contato com o eletrodo de prata.
    NOTA: Para a preparação, colocação e posicionamento da micropipeta no suporte do eletrodo, consulteo item 33.
  9. Aplicar pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF, para evitar a entrada de detritos na micropipeta, utilizando uma seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta através de uma tubulação de polietileno (≈130 cm mais longa); aplicar cerca de 100-200 μL de ar.
  10. Usando o micromanipulador, guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar a micropipeta no eixo X-Y-Z em direção à célula de interesse.
  11. Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto, da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta para o plano de foco. Certifique-se de que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desca lentamente até tocar a superfície da célula/região alvo.
  12. Aplicar pressão positiva leve (≈100 μL) com a seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta para remover quaisquer detritos do caminho de aproximação.
  13. Concentre-se na célula alvo e mova lentamente o micromanipulador no eixo X-Y-Z para aproximar a micropipeta da célula alvo. Ao tocar a micropipeta na célula, observa-se uma covinha causada pela pressão aplicada através da ponta da micropipeta (Figura 2C).
  14. Após a formação da fossa, devido à proximidade da micropipeta com a célula, aplicar sucção fraca e breve pela boca (1-2 s) através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta e a célula (selo gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Para formar o selo, use o modo de fixação de tensão no software. Para detalhes sobre a formação do selo, consulte33.
  15. Se a vedação permanecer estável (a vedação gigaohm deve ser mecanicamente estável e sem interferência de ruído, determinada pela observação por cerca de 1 min), ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse. Para neurônios hipotalâmicos kisspeptin, -50 mV é recomendado.
  16. Aplicar breve sucção por via oral (pressão negativa) com a micropipeta selada à célula para romper a membrana plasmática (Figura 2E). A configuração adequada de célula inteira é alcançada quando a sucção é realizada com força suficiente para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta e não atraia uma porção considerável da membrana ou mesmo da célula.
  17. Verifique o manual de configurações do sistema usado. Use o software (consulte Tabela de Materiais) para verificar e calcular digitalmente a resistência em série (SR) e a capacitância de célula inteira (wcc).
  18. No modo de fixação de tensão, depois de quebrar a membrana celular, ative a opção de célula inteira e clique no comando Auto referente à guia de célula inteira. O SR e o wcc da célula serão calculados automaticamente e exibidos instantaneamente pelo software. Esses parâmetros também podem ser verificados através da realização do teste de membrana com o amplificador mencionado na Tabela de Materiais33.
  19. Certifique-se de verificar os parâmetros de viabilidade celular. Para os neurônios da kisspeptina, verificar se as medidas eletrofisiológicas são: SR < 25 mΩ, resistência de entrada > 0,3 GΩ e mantendo o valor absoluto da corrente < 30 pA (observações pessoais e referência21). O valor médio do wcc dos neurônios AVPV/PeN kisspeptin ou ARHkisspeptin é ≈ 10-12 pF em camundongos gônadas intactos20.
  20. Monitorar o SR e a capacitância em estado estacionário da célula durante os experimentos. Certifique-se de que o SR não mude mais de 20% durante uma gravação e que a capacitância da membrana seja estável.
  21. Verifique as configurações do software. Criar protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Para registrar o potencial de membrana no modo corrente-pinça, com os equipamentos mencionados na Tabela de Materiais, filtre passa-baixa os sinais eletrofisiológicos em 2-4 kHz e analise os resultados off-line em um software (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o software).
  22. Uma vez que a configuração de célula inteira esteja adequadamente alcançada, meça as correntes sinápticas no modo de pinça de tensão (Figura 2G). Registrar alterações no potencial de membrana de repouso (RMP) e variações induzidas de RMP no modo de pinça de corrente (Figura 2H). Alterações no PGR, como a despolarização da membrana celular, podem ser induzidas pela administração de um medicamento/neurotransmissor conhecido ao banho (descrito no passo 3.2), conforme ilustrado na Figura 1.
    NOTA: No modo de fixação de corrente, a corrente positiva ou negativa pode ser injetada para manter a tensão da membrana em uma tensão desejada. Para os neurônios de kisspeptina, geralmente definimos a injeção de corrente zero (I = 0) para registrar a variação espontânea do potencial de membrana.

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Resultados

Para estudar os possíveis efeitos do hormônio de crescimento recombinante humano (hGH) sobre a atividade dos neurônios hipotalâmicos kisspeptina, realizamos registros de patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais e avaliamos se esse hormônio causa alterações agudas na atividade dos neurônios dekisspeptina AVPV/PeN e ARHkisspeptina. Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos36 foram utilizados neste estudo. Animais gônadas intactos foram selec...

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Discussão

O desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras teve um impacto significativo na comunidade científica, sendo considerada de suma importância para o desenvolvimento de pesquisas científicas e possibilitando diversas descobertas. Seu impacto na ciência foi suficiente para culminar com o Prêmio Nobel de Medicina em 1991, pois essa descoberta abriu as portas para uma melhor compreensão do funcionamento dos canais iônicos em condições fisiológicas e patológicas, bem como a identificação de potenciais

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Divulgações

Não há conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP número: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF) e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001" (HRV).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Compostos para aCSF, soluções internas e de corte
ATPSigma Aldrich/váriosA9187
CaCl2Sigma Aldrich/váriosC7902
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich/váriosG7021
EGTASigma Aldrich/váriosO3777
HEPESSigma Aldrich/várioH3375
KCLSigma Aldrich/várioP5405
K-gluconatoSigma Aldrich/várioG4500
KOHSigma Aldrich/várioP5958
MgCl2Sigma Aldrich/várioM9272
MgSO4 Sigma Aldrich/vários230391
NaClSigma Aldrich/váriosS5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/várioS5011
NaHCO3Sigma Aldrich/várioS5761
ácido nítricoSigma Aldrich/vário225711
CUIDADO SacaroseSigma Aldrich/várioS1888<
strong>Equipments
Tabela TMC63-534 do ar
AmplificadorMolecular DevicesMulticlamp 700B
Computadorvários-DIGIDATA
1440 SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS DE BAIXO RUÍDOMolecular DevicesDD1440
IsmatecISM833C 
Gaiola de FaradayTMC81-333-03
Câmera de imagemLeicaDFC 365 FX
MicromanipuladorSutter InstrumentsRoe-200
Extrator de micropipetaNarishigePC-10
MicroscópioLeicaDM6000 FS
OsteótomoBonther equipamentos & 128
Câmara de recuperaçãoWarner Instruments/Harvardapparatus-podeser feita internamente
Câmara de gravaçãoWarner Instruments640277
EspátulaFisher Scientific /variousFISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome LeicaVT1000 S
Banho-maria Fisher Scientific /variousIsotemp
Software e sistemas
AxoScope 10Software MolecularDevices-CommanderLAS
X wide field systemLeica-Imageaquisição e análise
MultiClamp 700BMolecular DevicesMULTICLAMP 700BCommander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE PARA WINDOWSMolecular DevicesPclamp 10 Padrão
Ferramentas
/AgCl eletrodo, pellet, 1.0 mmWarner Instruments64-1309
Pinça hemostática curva
colaLOCTITE/vários-
Tesoura de decapitaçãovários-Papel
de filtrovários-Capilares
de vidro (micropipeta)World Precision Instruments, IncTW150F-4
Tesoura de írisBonther equipamentos & Tecnologia/various65-66
Pipeta de vidro PasteurSigma Aldrich/váriosCLS7095B9-1000EA
Placa de Petrivários-Tubulação
de Polietileno Warner Instruments64-0756
Lâmina de barbear para dissecção cerebralTED PELLATEDP-121-1
Lâmina de barbear para vibratomoTED PELLATEDP-121-9
TesouraBonther equipamentos & Tecnologia/vários71-72, 48,49;  
tetina de siliconevários-Âncora
de Fatias Warner Instruments64-0246
Filtros de seringaMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 μ m
PinçasBonther equipamentos & Tecnologia/various131, 1518
Bomba peristáltica digital Ag vários-cianoacrilato

Referências

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