Artigo de método

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

DOI:

10.3791/65005

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28 de abril de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.

Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta "3D Objects Counter".

A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.

Introdução

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A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas 1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular3. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação 1,4.

Os autofagossomos são decorados pela proteína autofágica associada à proteína microtubular de cadeia leve 3 (CL3)5. Quando a autofagia não é induzida, a CL3 é difundida no citoplasma e no núcleo na conformação da LC3-I. Por outro lado, quando a autofagia é induzida, a CL3 é conjugada com uma fosfatidiletanolamina na membrana das estruturas autofágicas6. Essa nova conformação da LC3 é conhecida como LC3-II1. O desvio de conformação da CL3 provoca alterações em sua localização celular e sua migração por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), que pode ser detectada por técnicas como imunofluorescência e western blot 5,7. Dessa forma, a conjugação da CL3 é um evento chave no processo autofágico que pode ser usado para medir a atividade autofágica.

A célula acinar pancreática é uma célula altamente diferenciada que, em condições saudáveis, apresenta baixa taxa de autofagia. Entretanto, em diferentes condições fisiológicas ou sob estimulação farmacológica, podem ativar a autofagia. Portanto, a determinação dos níveis autofágicos nessa linhagem celular é útil para estudar os potenciais efeitos diretos ou indiretos de diferentes agentes farmacológicos ou biológicos sobre aautofagia8,9.

O adenocarcinoma ductal de pâncreas é um dos tipos de câncer mais letais, dado seu diagnóstico tardio e sua alta resistência àquimioterapia10. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional de proteínas relacionadas à autofagia11. As células do câncer de pâncreas podem ajustar seus níveis de autofagia em resposta a condições desfavoráveis como hipóxia, privação de nutrientes ou dano induzido por quimioterapia11. Assim, analisar os níveis de autofagia em células de câncer de pâncreas pode ajudar a entender como elas se adaptam a diferentes ambientes e avaliar a eficácia de tratamentos moduladores da autofagia.

Este estudo mostra um método para realizar a imunofluorescência CL3 em dois modelos celulares pancreáticos distintos. O primeiro modelo, células PANC-1, serviu de modelo para adenocarcinoma ductal pancreático. Essas células foram tratadas com gemcitabina, um agente quimioterápico que já demonstrou induzir autofagia, especificamente em células de câncer de pâncreas portadoras do gene oncogênico Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. O segundo modelo, células AR42J, serviu como um modelo mais fisiológico de células pancreáticas exócrinas. Essas células foram diferenciadas com dexametasona para se tornarem mais semelhantes às células pancreáticas acinares14. Nessas células, a autofagia foi induzida farmacologicamente pelo uso da PP242, que é um potente inibidor da mTOR15. Neste estudo, demonstramos a aplicabilidade do protocolo descrito com dois modelos pancreáticos diferentes e sua capacidade de discriminar estados de baixa e alta autofagia.

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Protocolo

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1. Preparação celular

  1. Mergulhe as tampas redondas de 12 mm em etanol absoluto e coloque-as verticalmente nos poços de uma placa de 24 poços.
  2. Retire a tampa e exponha a placa de poço múltiplo à radiação ultravioleta por 15 min.
  3. Posicione as tampas horizontalmente e lave-as com o DMEM (Modified Eagle Medium) da Dulbecco.
  4. Semear um baixo número de passagem de células pancreáticas. O valor deve ser ajustado para se obter 50%-75% de confluência no dia da fixação16.
    NOTA: Recomenda-se semear 2,5 × 10 4 células PANC-1 ou 4 ×10 4 células AR42J por poço para fixar as células após 3 dias.
  5. Cultivar as células em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina em estufa a 37 °C sob atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono (CO2).
    NOTA: Para células PANC-1, recomenda-se incubar as células por 2 dias entre a semeadura celular e as etapas seguintes. Após esse tempo, as células podem ser transfectadas, tratadas ou fixadas. Este protocolo exemplifica o tratamento com gemcitabina em células PANC-1 não transfectadas e a diferenciação e tratamento com PP242 para células AR42J não transfectadas.

2. Tratamento das células

  1. Tratamento com gencitabina para células PANC-1
    1. Preparar uma solução de 1 μg/μL de gemcitabina em DMEM 2 dias após a semeadura. Tratar cada poço com 2,6 μL da solução de gemcitabina de 1 μg/μL para obter uma diluição final de 20 μM.
    2. Incubar as células por 24 h na incubadora.
  2. Diferenciação AR42J e tratamento PP242
    1. Preparar uma solução de 4 μg/ml de dexametasona em DMEM.
    2. Tratar cada poço com 4,9 μL de 4 μg/mL de solução de dexametasona para obter uma diluição final de 100 nM.
    3. Incubar as células por 48 h na incubadora.
    4. Retirar o meio e tratar cada poço com 0,5 μL de 1 mM PP242 para obter uma diluição final de 1 μM.
    5. Incubar as células por 2 h na incubadora.

3. Fixação e permeabilização das células

  1. Preparar uma placa de 24 poços com metanol frio e uma placa de 6 poços com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO4, 2 mM KH2PO4). Mantenha-os no gelo.
  2. Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a duas vezes em PBS e incube por 6 min em metanol.

4. Bloqueio das células

  1. Lave cada lamínula duas vezes em PBS e incube por 1 h em soro fetal bovino a 10% em PBS (solução de bloqueio).
    Observação : nesta etapa, o protocolo pode ser pausado. As tampas podem ser armazenadas durante a noite na geladeira na solução de bloqueio, e o protocolo pode ser continuado no dia seguinte.

5. Incubar as lamínulas com o anticorpo primário

  1. Prepare uma solução 1:1.000 de anti-LC3 na solução de bloqueio e mantenha-a no gelo.
  2. Coloque um pedaço de filme de vedação de laboratório sobre a tampa de vários poços.
  3. Coloque uma gota (25 μL) por lamínula de solução anti-LC3 sobre a película de vedação.
  4. Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.
  5. Prepare uma câmara úmida colocando um pedaço de papel úmido em uma caixa de plástico de fundo plano.
  6. Coloque a placa de vários poços na câmara de umidade, cubra-a com papel alumínio e incube durante a noite na geladeira.

6. Incubar as lamínulas com o anticorpo secundário

  1. Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.
  2. Realizar três lavagens com PBS.
  3. Preparar uma solução de anticoelho fluorescentemente marcado com uma diluição de 1:800 na solução de bloqueio e mantê-la no gelo protegido da luz.
  4. Coloque uma peça de película de vedação sobre a tampa de vários poços.
  5. Colocar uma gota (25 μL) por lamínula de solução anticoelho sobre a película de vedação.
  6. Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.
  7. Incubar a placa de poço múltiplo na câmara de umidade por 2 h à temperatura ambiente (TR) protegida da luz.

7. Coloração das células com 4′ ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)

  1. Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.
  2. Realizar três lavagens com PBS.
  3. Preparar uma solução de 300 nM de DAPI em PBS (protegido da luz).
  4. Incubar cada lamínula com a solução DAPI durante 10 min.
  5. Realizar três lavagens com PBS. Mantenha a placa de vários poços protegida da luz.

8. Montagem

  1. Prepare dois copos com água e um pedaço de papel.
  2. Colocar uma gota (10 μL) por lamínula de uma solução de aduto de poliálcool vinílico-bis(trimetilalumínio)-1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (PVA-DABCO) numa lâmina.
    NOTA: PVA-DABCO é preparado combinando 0,25 M DABCO, 10% P/V PVA, 20% glicerol e 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) em água ultrapura.
  3. Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a em cada copo de água, seque-a no papel e coloque-a sobre a gota de PVA-DABCO (com as células em contato com a solução).
  4. Deixe secar durante a noite, protegido da luz.

9. Visualização em microscopia confocal e captura de imagens

  1. Visualize as lamínulas em um microscópio confocal invertido usando uma objetiva de cerca de 63x17.
  2. Capture imagens representativas das células marcadas.

10. Quantificação dos pontos da CL3

  1. Arraste e solte cada arquivo de imagem contendo os canais capturados, como ".czi", na tela do ImageJ (FIJI) para abrir. Clique em Ok na caixa de diálogo e feche a janela Console .
  2. Na guia Imagem , selecione Cor > Canais divididos.
  3. Feche as imagens correspondentes aos canais diferentes da imagem LC3.
  4. Na guia Imagem , selecione Ajustar > Equilíbrio de Cores
  5. Mova o controle deslizante Máximo para a esquerda até que a imagem esteja saturada para visualizar os contornos da célula.
  6. Desenhe o contorno da célula com a ferramenta Seleção à mão livre .
  7. Clique no botão Redefinir para redefinir o ajuste de cor.
  8. Na guia Editar , selecione Recortar para cortar o item selecionado.
  9. Feche a imagem sem salvá-la.
  10. Na guia Editar , selecione Colar.
  11. No menu Analisar , escolha a ferramenta Contador de objetos 3D.
  12. Defina o limite. No exemplo fornecido neste estudo, o limite é definido em 2.000.
  13. Defina o filtro de tamanho. Neste estudo, situa-se entre 50 e 500.
  14. Certifique-se de que as caixas Objetos e Resumo estejam marcadas.
  15. Clique em Ok. O número de pontos será descrito como Objetos Detectados no Resumo.

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama esquemático do protocolo de imunofluorescência da CL3. Diagrama esquemático que representa o protocolo geral fornecido para a imunofluorescência da CL3. Figura criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

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Este protocolo realiza a imunofluorescência da CL3 em linhagens celulares pancreáticas para determinar os níveis de autofagia em diferentes condições. O resultado deste experimento foi a obtenção de imagens celulares dos canais vermelho e azul, correspondentes a CL3 e DAPI. As imagens de CL3 indicam a distribuição celular dessa proteína, enquanto o DAPI mostra a localização nuclear. A Figura 2A mostra uma imagem representativa da imunofluorescência da CL3 e sua fusão com a coloração DAPI em ...

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Discussão

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O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)19. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de célulasvivas20), ser...

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Divulgações

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Não foram declarados conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), do Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (PICT 2019-01664).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Corning46-013-CM
12 mm lamínulas redondasHDACBR_OBJ_6467
24 Well- Placa de cultura de célulasSorfa220300
Etanol absolutoBiopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 IgG anti-coelho de burro (H + L)InvitrogenR37119
Microscópio Confocal de Varredura a LaserZeissLSM 800
DexametasonaSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
Soro FetalBovino NATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Tecnologiade Sinalização de Células3868S
MetanolAnedra6197
Parafilme "M" (Filme de Vedação de Laboratório)Bemis/CurwoodPM-996
Solução Pen-StrepSartorius03-031-1B
PP242Santa Cruz BiotecnologiaSC-301606
Tripsina EDTAGibco11570626
mAb de Coelho

Referências

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