O olho contém meios transparentes que não possuem vasos sanguíneos, incluindo a córnea, a lente do olho e o vítreo. A luz deve passar por esses meios antes de atingir os fotorreceptores na parte posterior da retina. Especificamente, a córnea, o cristalino e o vítreo carecem de vasos sanguíneos para evitar a absorção da luz e a distorção das imagens1. Os vasos sanguíneos da retina são organizados em três camadas: a camada superficial, que se estende do disco óptico até a periferia dentro da camada de fibras nervosas; a camada intermediária, localizada dentro da camada plexiforme interna; e a camada profunda, que é distribuída através da camada plexiforme externa. Essa rede vascular fornece sangue para a retina interna, enquanto os fotorreceptores são fornecidos por difusão dos vasos sanguíneos da coroide. A nutrição das retinas interna e externa é estritamente controlada pelas barreiras hematorretinianas internas e externas (BRBs). As células endoteliais da retina, pericitos e células gliais constituem o BRB interno. Por outro lado, as células epiteliais pigmentares da retina (EPR), as células endoteliais da coroide e a membrana de Bruch formam o BRB externo. Alterações patológicas nos vasos sanguíneos da retina são as características de várias doenças da retina, como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade e retinopatia da prematuridade. Essas alterações patológicas incluem, entre outras, inflamação vascular, quebra do BRB, degeneração capilar, alterações no fluxo sanguíneo retiniano e neovascularização patológica da retina (RNV)2,3,4. Portanto, é importante desenvolver métodos eficazes para estudar essas mudanças tanto in vivo usando animais experimentais quanto in vitro, cultivando várias células da retina em condições semelhantes ao ambiente biológico e bioquímico em doenças humanas. Os pesquisadores podem usar várias abordagens experimentais para dissecar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes das doenças vasculares da retina. O objetivo desta coleção de métodos é compartilhar com outros pesquisadores a experiência de cientistas da visão e oftalmologistas em termos de métodos para estudar o desenvolvimento vascular normal e anormalidades vasculares em várias doenças da retina.
O artigo de Damsgaard et al. apresenta um método de ultrassom com fluxo aprimorado que permite aos investigadores obter imagens das vasculaturas oculares em três dimensões sem o uso de agentes de contraste5. Este método supera as limitações de outros métodos devido à sua estabilidade na imagem do olho atrás da retina pigmentada. Embora o método tenha sido demonstrado em peixes dourados, ele pode ser aplicado a todas as outras espécies experimentais com glóbulos vermelhos nucleados. Este método é valioso para visualizar os vasos sanguíneos oculares em condições normais e patológicas e pode ser útil no estudo do fluxo sanguíneo ocular. No entanto, este método é limitado pela falta de glóbulos vermelhos nucleados em mamíferos. Assim, em comparação com espécies com glóbulos vermelhos nucleados, o ultrassom com fluxo aprimorado produz apenas contraste do fluxo sanguíneo em mamíferos. Além disso, esse método é sensível a ruídos de movimento, como movimentos respiratórios, que podem criar imagens e artefatos borrados. Este ruído de movimento pode ser ajustado por gating prospectivo ou retrospectivo. Para aquisições 2D e 3D, é crucial limitar os artefatos de movimento causados pelo movimento do animal devido à anestesia inadequada ou por uma configuração instável do transdutor. O desenvolvimento desta técnica abre caminho para o exame in vivo não invasivo das redes vasculares profundas do olho na grande maioria dos vertebrados que possuem eritrócitos nucleados.
O método apresentado por Macouzet-Romero et al. avalia a contribuição relativa dos vasos retinianos para a densidade de perfusão macular por meio da angiotomografia por coerência óptica (OCT)6. Este método caracteriza a proporção de uma área com circulação de vasos dilatados. É importante observar que a dilatação vascular pode ser uma resposta a condições patológicas. Essa abordagem pode delinear indiretamente a vasodilatação e identificar indiretamente a baixa oxigenação em doenças vasculares da retina, como retinopatia diabética (RD), oclusão da veia central ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Usando esse método, os principais achados de Macouzet-Romero et al.6 foram que a contribuição de vasos maiores que os capilares retinianos para a circulação retiniana foi de 18,2% em indivíduos saudáveis. Assim, esse percentual poderia ser usado como referência para identificar alterações precoces na densidade de perfusão devido a doenças vasculares da retina. Por exemplo, a contribuição percentual foi de 2,6% em pacientes com hipertensão arterial e 16,4% em pacientes com diabetes, sugerindo que esse método poderia ser usado para avaliar a progressão de doenças retinianas associadas a anormalidades vasculares.
O método apresentado por Subirada et al. avalia diferentes parâmetros de alterações vasculares (extensão da degeneração capilar [áreas avasculares], neovascularização patológica da retina [áreas neovasculares], dilatação e tortuosidade das arteríolas retinianas) em modelos experimentais de retinopatias isquêmicas, como retinopatia induzida por oxigênio (OIR) e diabetesexperimental7. É importante notar que o OIR reproduz a retinopatia da prematuridade e alguns aspectos da retinopatia diabética proliferativa. A capacidade de quantificar a extensão da neovascularização da retina (RNV) ou degeneração capilar em modelos experimentais é fundamental para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes, bem como para testar os possíveis efeitos terapêuticos de intervenções farmacológicas ou moleculares. Em resumo, este artigo apresenta técnicas clássicas, bem estabelecidas e reprodutíveis para quantificar alguns dos parâmetros vasculares mais relevantes considerados na prática clínica.
O artigo de Vaglienti et al. apresenta métodos para medir os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células gliais de Müller8. O papel do estresse oxidativo na disfunção microvascular da retina nas retinopatias isquêmicas foi estabelecido e encorajou os pesquisadores a investigar até que ponto as espécies reativas de oxigênio (ROS) contribuem para a quebra do BRB e RNV tanto in vivo quanto in vitro 9,10,11,12. Vaglienti et al. usam diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFD) para avaliar os níveis de geração intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROS). Este método é baseado na difusão de DCFD na célula e, em seguida, na oxidação de DCFD por ROS em 2 ', 7' -diclorofluoresceína (DCF). O DCF é altamente fluorescente e pode ser detectado por citometria de fluxo ou microscopia confocal. Este método pode visualizar e medir os níveis de geração de ROS em células e tecidos da retina.
O artigo de Tomaszewski et al. demonstra o isolamento e o crescimento de células epiteliais pigmentares da retina (EPR) de camundongos13. As células RPE contribuem para o BRB externo e desempenham um papel essencial na hemostasia e integridade dos fotorreceptores. A disfunção das células EPR é uma característica registrada de várias doenças da retina, incluindo, entre outras, DMRI e DR. Assim, estudos in vitro da função das células RPE na saúde e na doença são críticos para a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares de várias doenças vasculares da retina. Para isso, o isolamento primário de células RPE pode ser uma ferramenta importante para estudar os mecanismos subjacentes e a patogênese de diferentes doenças oculares, bem como para propor novas aplicações terapêuticas para essas doenças. Esta técnica permite o estudo de mudanças na estrutura e função celular do EPR e seu impacto no BRB externo em DMRI e DR. Além disso, a técnica pode ser aplicada para estudar alterações em células RPE isoladas de camundongos C57BL6 do tipo selvagem e diferentes camundongos geneticamente modificados e para testar diferentes compostos farmacológicos como alvos terapêuticos para DMRI14.
O artigo de Elmasry et al. apresenta um modelo experimental ex vivo que pode ser usado para estudar doenças neurovasculares da retina por meio da cultura de explantes retinianos por um período prolongado15. Neste sistema ex vivo, os explantes retinianos apresentam redes vasculares e gliais intactas e neurônios retinianos por até 2 semanas em cultura. Os explantes organotípicos da retina surgiram como uma ferramenta confiável para o estudo de doenças da retina, como RD e doenças degenerativas da retina 16,17. Em comparação com outras técnicas existentes, o uso de explantes retinianos suporta culturas de células retinianas in vitro e modelos animais in vivo, adicionando um recurso exclusivo que permite o exame da diafonia entre várias células da retina (por exemplo, células vasculares, gliais e neuronais) sob os mesmos parâmetros bioquímicos e independentes de variáveis sistêmicas. As culturas de explantes mantêm várias células da retina juntas no mesmo ambiente e retêm as interações físicas e moleculares intercelulares. Além disso, estudos mostraram que os explantes retinianos podem preservar a estrutura morfológica e a funcionalidade das células retinianas cultivadas. Em resumo, os explantes retinianos podem fornecer uma plataforma adequada para investigar a interferência entre várias células da retina em resposta a alterações bioquímicas, como hiperglicemia e hipóxia, semelhantes às observadas na retinopatia diabética (RD) ou retinopatia da prematuridade (ROP). Essa abordagem também permite o teste de intervenções terapêuticas em um ambiente bioquímico restrito. A cultura de explantes de retina representa uma técnica controlável e um modelo experimental muito flexível que permite inúmeras manipulações farmacológicas e pode descobrir vários mecanismos moleculares de doenças retinianas.