Monitoramento da Coxofagia Mediada por Stub1

Resumo

Este protocolo fornece instruções para o desencadeamento e monitoramento da pexefagia mediada por Stub1 em células vivas.

Resumo

Células de mamíferos podem transformar peroxissomas através da pexofagia mediada por Stub1. A via potencialmente permite o controle celular da quantidade e qualidade dos peroxissomos. Durante esse processo, a proteína de choque térmico 70 e a ubiquitina E3 ligase, Stub1, translocam-se em peroxissomas para serem viradas para iniciar a pexofagia. A atividade da ligase Stub1 permite o acúmulo de ubiquitina e outros módulos relacionados à autofagia em peroxissomas alvo. A elevação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da luz peroxissomal pode ativar a pexofagia mediada por Stub1. Pode-se, portanto, usar a geração de ROS assistida por corante para desencadear e monitorar essa via. Este artigo descreve os procedimentos para o uso de duas classes de corantes, proteínas fluorescentes e fluoróforos sintéticos, para iniciar a pexofagia em culturas de células de mamíferos. Esses protocolos baseados na geração de ROS assistida por corante podem não apenas ser usados para atingir todos os peroxissomas dentro de uma população celular globalmente, mas também podem permitir a manipulação de peroxissomas individuais dentro de células únicas. Também descrevemos como a pexofagia mediada por Stub1 pode ser acompanhada usando microscopia de células vivas.

Introdução

Os peroxissomas são organelas ligadas a uma única membrana presentes na maioria das células eucarióticas. Os peroxissomas são um compartimento metabólico essencial para a realização da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, catabolismo de purinas e síntese de fosfolipídios éteres e ácidos biliares¹. O acetil-CoA derivado do peroxissomo controla a homeostase lipídica regulando a sinalização central no metabolismo². Portanto, não é surpresa que o comprometimento das funções peroxissomais esteja implicado em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, envelhecimento, cânceres, obesidade e diabetes ^3,4,5. Um processo essencial na manutenção da operação peroxissomal é a pexofagia. A puxofagia é um processo catabólico para o turnover seletivo de peroxissomas por autofagia. As células usam a pexofagia para ajudar a controlar a quantidade e a qualidade dos peroxissomos, garantindo assim a função peroxissomal adequada. Um estudo recente demonstrou que a perda de peroxissomo causada por mutações nos fatores 1 e 6 da biogênese peroxissomal PEX1 resulta de pexofagia não controlada⁶. Notavelmente, 65% de todos os pacientes com transtorno da biogênese do peroxissomo (DBP) apresentam deficiências no complexo ATPase AAA peroxissomal, composto por PEX1, PEX6 e PEX26^{em células de} mamíferos7.

Vários métodos podem ser usados para iniciar e estudar a pexofagia. Em leveduras, a pexofagia é desencadeada quando os nutrientes fornecidos são trocados de fontes de carbono dependentes de peroxissomo para fontes de carbono independentes de peroxissomo (para diminuir o número de peroxissomas celulares)⁸. Por exemplo, a transferência de células de Pichia pastoris cultivadas com metanol do meio metanol para o meio glicosado e etanol induz micropexofagia e macropexofagia, respectivamente ^8,9,10. A micropexofagia sequestra peroxissomas agrupados para degradação, remodelando o vacúolo para formar membranas de sequestro vacuolar em forma de taça e uma estrutura semelhante a uma tampa denominada aparato de membrana específico para micropexofagia (MIPA). Na macropexofagia, os peroxissomas individuais são engolidos por estruturas de membrana dupla conhecidas como pexofagossomos, seguidos de fusão com o vacúolo para degradação ^8,9,10. A fosforilação de receptores de pexofagia, como Atg36p em Saccharomyces cerevisiae e Atg30p em Pichia pastoris, é crítica para recrutar maquinaria de autofagia central e facilitar o direcionamento peroxissomal para autofagossomos ^8,11.

Em células de mamíferos, a pexofagia pode ser induzida por ubiquitinação. A marcação das proteínas da membrana peroxissomal PMP34 ou PEX3 com ubiquitina no lado citosólico induz a pexofagia¹². A superexpressão de PEX3 induz a ubiquitinação do peroxissomo e a eliminação do peroxissomo pelos lisossomos¹³. Além disso, a fusão de PEX5 com um EGFP C-terminal prejudica a exportação de PEX5 monoubiquitinado e resulta em pexofagia¹⁴. Por outro lado, a pexofagia também pode ser desencadeada pelo tratamento com H 2 O₂. Os peroxissomas produzem espécies reativas de oxigênio (EROs); especificamente, a enzima peroxissomal Acox1, que catalisa a etapa inicial da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa (carbono > 22), produz não apenas acetil-CoA, mas também ROS peroxissomal. Em resposta aos níveis elevados de ROS sob o tratamento comH 2 O₂, as células de mamíferos ativam a pexofagia para diminuir a produção de ROS e aliviar o estresse. Tem sido relatado que o tratamento com H 2 O₂direciona o recrutamento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) para peroxissomas. A ATM fosforila então PEX5 para promover o turnover peroxissomal pela pexofagia¹⁵.

Como os peroxissomas são centros geradores de ROS, eles também são propensos a danos de ROS. Lesões peroxissomais provocadas por ERO forçam as células a ativar a pexofagia para iniciar vias de controle de qualidade do peroxissomo (remoção do peroxissomo danificado por autofagia). Aqui, delineamos uma abordagem para o desencadeamento sob demanda de lesão peroxissomal provocada por ROS. O protocolo aproveita a produção de ERO ativadas por luz dentro de organelas 16,17,18,19,20 (Figura 1). Os peroxissomas marcados com corante são iluminados, levando à produção de ERO dentro da luz peroxissomal, o que desencadeia especificamente a lesão peroxissomal. Usando este protocolo, mostra-se que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina. Os peroxissomas estressados com ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir seu engolfamento em autofagossomos para remoção individual por pexofagia¹⁶. Pode-se usar este protocolo para comparar o destino de peroxissomas lesionados e saudáveis dentro de uma mesma célula por microscopia de lapso de tempo. O método também pode ser usado para danificar globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em uma placa de cultura, permitindo a análise bioquímica da via da pexofagia.

Protocolo

1. Preparação de células expressando diKillerRed ou proteínas auto-marcadas (SLPs) no lúmen do peroxissomo

1. Seme as células desejadas em placas de cultura celular com fundo de vidro. Para o experimento, foram utilizadas 2 x^{10 5} células SHSY5Y humanas em 840 μL de meio de cultura (DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina) ou 6 x 10⁴ células NIH3T3 de camundongo em 840 μL de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de soro bovino e 1% de penicilina/estreptomicina) em uma placa de cultura de 35 mm com micropoço de vidro de 20 mm de diâmetro.
   NOTA: O número de células semeadas deve ser ajustado proporcionalmente de acordo com a área do micropoço de vidro ao usar placas de fundo de vidro de outras especificações.
2. Cultivar as células a 5% de CO₂/37 °C durante 24 horas.
3. Transfectar as células com plasmídeos desejados usando um reagente de transfecção.
   1. Use PMP34-TagBFP para marcar os peroxissomas em células vivas. Use diKillerRed-VKSKL ou SLP-VKSKL (+ ligantes SLP marcados com corante) para geração de ROS no lúmen do peroxissomo (através da produção de ROS ativadas por luz). Neste protocolo, utilizamos a proteína de automarcação HaloTag-VKSKL²¹. Para monitorar a translocação de Stub1/Hsp70, o acúmulo de proteínas ubiquitinadas e a formação de autofagossomos em peroxissomas estressados por ROS, transfect EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub ou EGFP-LC3B, respectivamente. Para verificar a geração de ROS no lúmen peroxissomal, co-transfecte diKillerRed-VKSKL com a sonda redox fluorescente localizada em peroxissomo roGFP2-VKSKL²².
   2. Para a transfecção de células SHSY5Y, diluir plasmídeos em 55 μL de DMEM/F-12 livre de soro e diluir 1 μL de reagente de transfecção em 55 μL de DMEM/F12 livre de soro. Combinar o ADN diluído com o reagente diluído. Misture delicadamente e incube por 30 min à temperatura ambiente.
   3. Adicionar o complexo ao micropoço de 20 mm previamente plaqueado com 100 μL de meio de cultura para SHSY5Y sem antibióticos (DMEM/F-12 com 10% de soro fetal bovino). Agite suavemente o prato para frente e para trás.
   4. Para a transfecção celular NIH3T3, substituir o meio de soro reduzido pelo DMEM/F-12 livre de soro para diluir os plasmídeos e o reagente de transfecção. Substituir o meio de cultura de plaqueamento por SHSY5Y por meio de cultura para células NIH3T3 sem antibióticos (DMEM com 10% de soro bovino).
4. Após 2 h da transfecção, retirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicionar 1 mL de meio de cultura fresco. Incubar as células NIH3T3 ou SHSY5Y a 37°C e 5% CO₂ por 24 h.
   NOTA: Outras linhagens celulares também podem ser usadas para estudar a pexofagia mediada por Stub1 (por exemplo, células HeLa).

2. Coloração de peroxissomas com ligantes SLP marcados com corante (para produção de ROS ativadas por luz)

1. Em 24 h após a transfecção, remova o meio de cultura e adicione 100 μL do ligante HaloTag TMR 200 nM ou o ligante HaloTag Janelia Fluor 646 HaloTag 200 nM no micropoço de vidro de 20 mm.
   NOTA: Os ligantes SLP marcados com corante devem ser diluídos com o respectivo meio de cultura para cada linhagem celular. A escolha dos ligantes marcados com Janelia Fluor 646 liberará os canais azul, verde e vermelho para imagens de fluorescência a jusante.
2. Transfira o prato para uma incubadora a 37°C, 5% CO₂ . Manchar por 1 h. Após 1 h, retirar bem o meio de coloração e adicionar 1 mL de meio de cultura fresco.

3. EROsstress de peroxissomas em microscópio confocal de varredura a laser

1. Coloque um prato com fundo de vidro contendo as células desejadas em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma incubadora de palco.
2. Clique em Tool Window, escolha Ocular e clique no botão DIA (Figura 2A) para acender a luz transmitida. Visualize o prato através da ocular do microscópio e coloque as células em foco girando o botão de foco.
3. Escolha LSM e clique no botão Dye & Detector Select (Figura 2B). Clique duas vezes nos corantes desejados na janela pop-up para selecionar as configurações apropriadas de laser e filtro para obter imagens das células (Figura 2C). Clique em Livex4 no painel Live para iniciar a varredura rápida a laser para iniciar a triagem dos sinais de fluorescência das células (Figura 2D).
4. Mova o palco usando o controlador de joystick e localize as células médias que expressam diKillerRed-VKSKL- ou SLP-VKSKL para aplicar estresse ROS (nos peroxissomos). Adquira uma imagem da célula desejada.
5. Clique em Tool Window e escolha LSM Stimulation (Estimulação LSM ) (Figura 2E). Clique no botão de elipse e, na janela de imagem ao vivo, use o mouse para desenhar uma ROI circular de 15 μm de diâmetro (Figura 2F) contendo os peroxissomas desejados adquiridos na etapa 3.4 à qual a tensão ROS será aplicada (veja a Figura 3 para um exemplo).
6. Para aplicar o estresse ROS, use 561 nm para células com o ligante SLP marcado com diKillerRed-PTS1- ou TMR, e use 640 nm para células coradas com o ligante SLP marcado com Janelia Fluor 646.
7. Selecione o comprimento de onda do laser para aplicar a tensão ROS. Insira a porcentagem de laser desejada e a duração (Figura 2G).
8. Clique em Adquirir e clique no botão Estimulação (Figura 2H) para iniciar a varredura com luz de 561/640 nm através das ROIs de 30 s cada. Isso corresponde a uma configuração de ~5% de potência do laser para 561 nm e 640 nm no microscópio confocal usado aqui. Esta operação levará à produção de ROS nos peroxissomos.
   NOTA: Pode-se selecionar ROIs de diferentes tamanhos. Deve-se ajustar proporcionalmente o tempo de iluminação para cada ROI de acordo com sua área.
9. Após 30 s de iluminação a laser, os peroxissomas dentro das ROIs terão perdido seus sinais diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Essa perda de sinal permite distinguir os peroxissomas iluminados dos não iluminados (danificados vs. saudáveis) dentro de uma célula.

4. Monitoramento da pexofagia em células vivas por meio de imagens por lapso de tempo

1. Siga a translocação de Stub1, Hsp70, Ub, p62 ou LC3B marcados com EGFP para os peroxissomas iluminados/estressados por ROS, usando imagens de lapso de tempo usando intervalos de 10 min entre quadros (por exemplo, veja as Figuras 3-7).
   NOTA: Os sinais EGFP-Stub1 ou EGFP-Hsp70 começam a aparecer 10-20 min após a iluminação e permanecem em todos os peroxissomas danificados até ~40 min após a iluminação. Os sinais EGFP-Ub aparecem 30 min após a iluminação e duram 2-3 h. A translocação EGFP-p62 aparece 60 min após a iluminação, e os sinais EGFP-LC3B tornam-se visíveis ~3 h após a iluminação.
2. Quantifique os sinais EGFP nos peroxissomas danificados (de Stub1, Ub, p62 ou LC3B) usando ImageJ. Execute as etapas a seguir para usar o ImageJ para quantificar uma imagem de três canais (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
   1. Abra a imagem e aplique seleções elípticas ou seleções à mão livre para delimitar a região que contém todos os peroxissomas iluminados (sinal PMP34-TagBFP positivo e sinal ligante HaloTag branqueado; Figura 8A).
   2. Clique em Duplicar para selecionar o canal PMP34-TagBFP (Figura 8A). Defina um limite usando o menu suspenso Image > Adjust > Threshold para marcar os peroxissomas (Figura 8B).
   3. Selecione Analisar > Analisar partículas para determinar as regiões exatas dos peroxissomas iluminados. O ImageJ registra essas regiões de interesse (ROIs) no gerenciador de ROI (Figura 8C).
   4. Clique em Duplicar para escolher o canal EGFP para analisar o sinal de fluorescência de Ub, p62 ou LC3B conjugado com EGFP (Figura 8D). Selecione todos os ROIs no ROI Manager (Figura 8E).
   5. Aplique Measure no ROI Manager para medir os sinais EGFP nos peroxissomas (Figura 8E). Encontre o valor da área e da densidade integrada (a soma de todas as intensidades de pixel) para cada ROI na tabela Resultados (Figura 8E).
   6. Para obter as intensidades médias de fluorescência do EGFP em diferentes momentos após a iluminação, divida a intensidade integrada do EGFP pela área total dos peroxissomas iluminados (áreas positivas do sinal PMP34-TagBFP e negativo do sinal do ligante HaloTag). Para obter o sinal acumulado nos peroxissomos, subtraia a intensidade média em um ponto de tempo pela intensidade média no tempo = 0 e, em seguida, normalize pela intensidade média no tempo = 0.

5. Danificando globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em um prato de cultura

1. Realizar a etapa 1 (preparação das células que expressam diKillerRed direcionado ao peroxissomo [diKillerRed-VKSKL] ou SLP [SLP-VKSKL]) e a etapa 2 (coloração dos peroxissomas com o ligante SLP [para produção de ROS ativadas pela luz]).
2. Após 1 h de coloração com ligante marcado com TMR, remover o meio de coloração e adicionar 1 mL de meio de cultura contendo 3-AT 30 mM (3-amino-1,2,4-triazol; um inibidor da catalase).
   NOTA: A catalase é um sequestrador de ROS expresso no lúmen do peroxissomo, de modo que o tratamento com 3-AT ajuda a aumentar o dano oxidativo provocado pela luz nos peroxissomos.
3. Coloque o prato de cultura acima de um LED (555-570 nm). Ilumine todas as células com uma densidade de potência de 1,8 W/^cm2 por 9 h em uma incubadora.
   NOTA: Para executar esta etapa fora de uma incubadora, coloque o prato de cultura em uma placa de aquecimento de 37°C. Adicione 20 mM HEPES ao meio contendo 3-AT e cubra a placa de cultura com um filme transparente para minimizar as trocas gasosas. O HEPES é um agente tampão que mantém o pH fisiológico em cultura celular fora de uma incubadora de CO₂ durante a iluminação por LED.
4. Valide o sucesso do dano provocado por LED por imagem dos sinais EGFP-Ub, EGFP-p62 ou EGFP-LC3B nos peroxissomas. Usando a condição de iluminação descrita acima, 82% das células SHSY5Y expressando estavelmente HaloTag-VKSKL exibiram pexofagia mediada por Stub1.
5. Colheita das células para análise bioquímica a jusante.

Resultados

O esquema de indução de pelofagia mediado por Stub1 mostrado aqui aproveita a geração de ROS assistida por corante dentro do lúmen do peroxissomo. Esta operação requer intensidades luminosas mínimas. Peroxissomas contendo proteínas fluorescentes ou corantes podem, portanto, ser iluminados usando microscópios confocais de varredura a laser padrão. A iluminação focal leva à produção instantânea e localizada de ERO dentro de peroxissomas individuais, como indicado pelo repórter fluorescente roGFP2-VKSKL (

Discussão

Este protocolo detalha como desencadear a pexofagia mediada por Stub1 em culturas de células elevando os níveis de ROS peroxissomais com luz. Como o protocolo depende da geração de ROS assistida por corante, é necessário garantir a expressão suficiente de diKillerRed-VKSKL ou coloração de ligante SLP marcada com corante dentro das células de interesse. Dado que diferentes tipos celulares ou células de diferentes origens genéticas podem abrigar peroxissomas com propriedades ligeiramente diferentes, pode-se precisar ajusta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de 35 mm com micropoço de vidro de 20 mm de diâmetro	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm com fundo de vidro
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
soro bovino	ThermoFisher Scientific	16170060
Incubadora de cultura de células	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		feita anexando o dímero tandem KillerRed com PTS1(VKSKL)
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Meio de Águia Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	A espinha dorsal do EGFP-C1 foi usada para clonagem EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Gene Hsp70 (HSPA1A) PCR amplificado a partir do cDNA HeLa e clonado em EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		gerado pela inserção do gene SQSTM1 humano (através da amplificação por PCR do cDNA da célula HeLa) em EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		gerado pela inserção do gene Stub1 de camundongo (por meio de amplificação por PCR do cDNA total do rim de camundongo) em EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
soro fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligante	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 anexado e clonado no backbone EGFP-C1
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Microscópio Confocal Invertido	Microscópio Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  com uma incubadora de câmara TOKAI HIT e o acessório de prato UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamina 2000	ThermoFisher Scientific	11668	reagente de transfecção
NIH3T3 célula	ATCC	CRL-1658	aderente
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	redução do meio sérico
penicilina / estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplificado a partir de HeLa cDNA e clonado intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		gerada pela adição de eroGFP (retirado do plasmídeo Addgene 20131) com a sequência de aminoácidos VKSKL e clonada na célula EGFP-C1
SHSY5Y	ATCC	CRL-2266	aderente