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Os animais são sistemas altamente complexos compostos por centenas de tipos de células diferentes organizados em dezenas de tecidos e órgãos distintos. Estudar como grupos de células interagem uns com os outros e seu ambiente durante o desenvolvimento embrionário não apenas nos dá uma melhor compreensão de como os corpos adultos são construídos, mas também pode revelar os fundamentos moleculares e celulares de doenças e defeitos congênitos. Certos sistemas modelo são mais adequados para abordar questões biológicas específicas do que outros, e os cientistas empregam uma ampla variedade de espécies e técnicas experimentais para investigar toda a diversidade da biologia do organismo. Por exemplo, um determinado experimento de biologia do desenvolvimento pode envolver engenharia genética, dissecações de animais, biologia molecular, bioquímica e microscopia de alta resolução. Tais métodos podem ser difíceis de reproduzir com base apenas em descrições escritas e figuras e, portanto, é importante documentá-los em forma de vídeo para promover a disseminação da técnica e dos métodos de análise adequados.
A relação entre os mecanismos de desenvolvimento e regeneração, particularmente no sistema nervoso, é uma área de intenso interesse, e o peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um modelo chave neste campo devido ao seu crescimento ao longo da vida e capacidades regenerativas. Notavelmente, existe uma interação complexa entre as células da retina e do tecto óptico, e essa interação é necessária para estabelecer conexões adequadas à medida que novos neurônios são adicionados aos olhos e ao cérebro1. Hagen et al. descrevem uma técnica para caracterizar como o crescimento e o desenvolvimento neural são afetados pela desnervação após a remoção do olho em embriões vivos de peixe-zebra2. Eles descrevem em detalhes como 1) realizar a cirurgia de remoção dos olhos, 2) cultivar larvas após a cirurgia, 3) corrigir, dissecar e armazenar as amostras cerebrais, 4) realizar imunofluorescência e 5) montar e visualizar adequadamente as amostras. Essa técnica pode ser usada para estudar uma ampla variedade de processos de neurodesenvolvimento em tecidos fixos e também pode ser modificada para experimentos em embriões vivos.
As células da crista neural (NCCs) representam uma importante linhagem de desenvolvimento que dá origem a células de pigmento, cartilagem, osso, músculo liso, neurônios e glia, e essas células estão implicadas em muitos tipos de defeitos congênitos3. Além de sua impressionante pluripotência, os NCCs também passam por uma transição epitelial para mesenquimal seguida de extensa migração durante o desenvolvimento, tornando-os um paradigma fascinante para entender a interação entre o destino celular e a morfologia4. Os embriões de pintinhos são um sistema poderoso para estudar a biologia do NCC, porque os NCCs podem ser visualizados in vivo e cultivados ex vivo, permitindo assim muitos tipos de tratamentos moleculares que são difíceis com outros sistemas. Jacques-Fricke et al. descrevem um método flexível para cultura de pregas neurais cranianas para gerar culturas primárias de NCC em lamínulas revestidas com fibronectina, que podem ser seguidas por experimentos de imagem fixa ou imagem ao vivo5. Eles descrevem como 1) incubar e isolar os embriões, 2) dissecar e plaquear as dobras neurais, 3) fixar e corar os NCCs e 4) quantificar e analisar a morfologia do NCC.
A membrana basal - uma matriz extracelular gerada ao longo da superfície basal das células epiteliais - é crítica para o estabelecimento da morfologia do tecido e da função dos órgãos em animais6. O epitélio folicular de Drosophila , que envolve o ovo em formação, é um excelente modelo para estudar como as membranas basais são formadas, pois secreta todos os principais componentes conservados da membrana basal7, e a matriz é orientada para o "exterior" da câmara do ovo, facilitando assim as análises baseadas em microscopia8. Shah e Devergne descrevem o uso de um dos tipos mais populares de microscopia de super-resolução - Airyscan - para examinar como o tráfego vesicular afeta a formação da membrana basal9. Eles mostram como 1) coletar e corrigir ovários de Drosophila , 2) realizar imunofluorescência, 3) montar adequadamente as amostras e 4) capturar conjuntos de dados de super-resolução de alta qualidade para análise tridimensional. Observamos que este artigo inclui um tutorial extremamente útil e conciso sobre a aquisição adequada de conjuntos de dados confocais tridimensionais não saturados, que devem ser de interesse geral para qualquer pessoa que deseje quantificar imagens de fluorescência.
Embora as tecnologias de super-resolução baseadas em microscópio (por exemplo, STED, SIM e Airyscan)10 estejam se tornando cada vez mais comuns, elas são mais caras do que os microscópios confocais padrão e não estão disponíveis para todos os pesquisadores. Uma técnica alternativa para a obtenção de imagens de super-resolução é a microscopia de expansão (ExM), que envolve o aumento físico de uma amostra biológica em três dimensões, incorporando-a e ligando-a a um hidrogel expansível11. As amostras expandidas podem então ser visualizadas usando um microscópio confocal padrão para gerar imagens com resolução lateral da ordem de dezenas de nanômetros, rivalizando com outros tipos de microscopia de super-resolução12. Nosso grupo descreve como implementar o ExM em embriões de Drosophila de montagem inteira para revelar características subcelulares do citoesqueleto de actomiosina e redes mitocondriais que não são detectáveis com microscopia confocal padrão13. Descrevemos como 1) selecionar embriões adequadamente estadiados, 2) realizar imunofluorescência, 3) preparar e montar os embriões para expansão, 3) digerir e expandir os embriões e 4) coletar conjuntos de dados de super-resolução. Esta técnica deve ser modificável para uma ampla gama de espécimes biológicos da ordem de 1 mm, tornando-a acessível a uma ampla gama de laboratórios de biologia.
A biologia do desenvolvimento é, por necessidade, um campo altamente inventivo e interdisciplinar que se baseia em técnicas de diversas áreas científicas para quantificar a biologia celular como ela ocorre no animal. Aqui, destacamos quatro métodos de biologia do desenvolvimento no peixe-zebra, pintinho e mosca-da-fruta que apresentam técnicas clássicas e de ponta para sondar a morfologia celular e a localização de proteínas subcelulares durante o desenvolvimento animal. Atualmente, o campo está focado na fusão de análises quantitativas da morfologia e comportamento celular com experimentos transcriptômicos e proteômicos para revelar toda a diversidade de moléculas e forças biomecânicas que controlam o desenvolvimento animal.