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As abordagens proteômicas podem incluir a detecção e quantificação dos peptídeos, proteínas e modificações pós-traducionais específicas (PTMs) presentes em um determinado estado celular, bem como as proteínas que se juntam em organelas específicas ou complexos de proteínas macromoleculares. A proteômica é um campo diversificado que pode ser particionado em fluxos de trabalho gerais e quantitativos. A proteômica quantitativa está focada em determinar a quantidade de proteína ou proteína PTM em uma amostra. A questão biológica deve ser considerada antes de realizar qualquer experimento proteômico, a fim de determinar o método de preparação de amostra, sequenciamento e análise de dados mais apropriado necessário para responder à pergunta. As proteínas são altamente dinâmicas e os espectrômetros de massa são sensíveis ao sequenciamento de proteínas mais abundantes em relação a PTMs menos abundantes; portanto, a escolha dos fluxos de trabalho de preparação e sequenciamento de amostras é crítica. Esta coleção de métodos descreve abordagens para quantificar certos tipos de proteínas usando métodos de MS de ponta e fornece um fluxo de trabalho de análise de dados para redes de proteínas.
Peptidômica é o estudo de peptídeos gerados naturalmente durante processos celulares normais, bem como sob condições de doença, e essa abordagem foi historicamente limitada à quantificação baseada em anticorpos até que a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa e os processos de extração de peptídeos avançaram para seu estado atual1. Esses avanços, juntamente com a aplicação da inativação por calor de proteases endógenas, agora permitem a identificação e quantificação de centenas de peptídeos intracelulares. Em Correa et al.2, os autores descrevem um fluxo de trabalho de preparação de amostras, que inclui inativação por calor, extração de peptídeos em condições amenas para preservar as ligações peptídicas e quantificação relativa por meio da marcação isotópica estável de aminas. Os autores desenvolveram uma abordagem barata que poderia permitir a identificação e quantificação de peptídeos nativos e biologicamente ativos de cultura de células e amostras de tecido. Essa abordagem pode ser usada para descobrir biomarcadores de peptídeos específicos da doença, peptídeos antimicrobianos ou alvos para desenvolvimento terapêutico futuro.
Os avanços nas abordagens de espectrometria de massa e bioinformática agora permitem a caracterização detalhada de proteomas de diversas fontes de material biológico3. Decifrar o significado biológico dos padrões de expressão proteômica nessas amostras complexas continua sendo um desafio significativo no campo. Para enfrentar esse desafio, Vanderwall et al. introduzem o JUMPn, um programa de biologia de sistemas e seu fluxo de trabalho associado que organiza dados proteômicos em módulos (ou seja, complexos de proteínas) que conectam clusters de co-expressão de proteínas com nós de rede de interação proteína-proteína (PPI) relacionados4. Os autores avaliam a eficácia dessa ferramenta usando conjuntos de dados proteômicos existentes, bem como dados simulados, e mostram sua utilidade para facilitar a interpretação biológica de conjuntos de dados complexos de proteoma. Seus resultados mostram que essa abordagem pode ser usada para medir o fator de transcrição e a ativação da cascata da quinase, demonstrando sua utilidade para identificar os condutores de doenças humanas e para outros estudos que tentam determinar mecanismos biológicos a partir de dados profundos do proteoma.
Os pirofosfatos de inositol (PP-InsPs) são encontrados em todas as células eucarióticas, onde funcionam como moléculas de sinalização metabólica e regulam diversos processos5. Historicamente, devido às propriedades físicas e baixa abundância de PP-InsPs, a análise tem se limitado ao uso de traçadores radioativos, que são caros e requerem cuidados e armazenamento especiais. Como alternativa, Qiu et al. desenvolveram um protocolo que permite a quantificação absoluta e de alto rendimento de pirofosfatos de inositol de cultura de células ou material de origem de tecido por espectrometria de massa de ionização por eletroforese capilar acoplada a eletrospray (CE-ESI-MS)6. Em seu relatório, eles mostram como essa abordagem pode ser usada para traçar o perfil de todos os PP-InsPs presentes em um espécime, resolvendo espécies e identificando regioisômeros, a fim de identificar mudanças espaciais e temporais sob diversas condições e estados de doença.
Uma grande proporção dos processos celulares é controlada por meio da fosforilação de proteínas e erros nessas vias de sinalização estão associados a muitos estados de doença diferentes7. No entanto, ainda existem lacunas significativas na compreensão dos mecanismos completos que regulam as proteínas fosfatases e quinases em diferentes tipos de células e sob várias condições. Para resolver essas lacunas na compreensão, Smolen et al. introduzem um novo fluxo de trabalho utilizando esferas inibidoras de fosfatase acopladas à espectrometria de massa (PIB-MS) 8 . Usando um inibidor não seletivo da fosfoproteína fosfatase, microcistina-LR, acoplado a grânulos de tosepharose, os autores são capazes de enriquecer essas proteínas-alvo. Além disso, usando condições de lavagem suaves para remover contenções não específicas, eles também foram capazes de capturar interagentes de proteínas. Eles mostram como essa abordagem pode ser usada para identificar e quantificar fosfoproteínas fosfatases, seu status de fosforilação e possíveis interações proteína-proteína em cultura de células e tecidos.
Os avanços nos métodos de preparação de amostras, como estratégias para quantificar peptídeos endógenos, enriquecimento de fosfatases e quinases, interações proteicas e pirofosfatos de inositol, estão expandindo a base de conhecimento para a dinâmica de proteínas em processos biológicos. O avanço dos espectrômetros de massa, como a aquisição independente de dados, em contraste com a aquisição dependente de dados, permite uma maior profundidade da capacidade de sequenciamento para identificar peptídeos de tal forma que os peptídeos mais abundantes não mascarem peptídeos menos abundantes durante a coleta de dados, o que permite que outras classes de proteínas sejam identificadas. Os espectrômetros de massa timsTOF ajudarão a impulsionar o futuro, incorporando a mobilidade iônica, além da cromatografia líquida, como uma separação adicional de peptídeos para permitir um sequenciamento ainda mais profundo e maior chance de detectar peptídeos a partir das estratégias de preparação de amostras descritas nesta coleção. O campo da proteômica continuará avançando com base em novas metodologias de preparação de amostras, avanços em espectrômetros de massa para aquisição de dados e ferramentas de análise de bioinformática, como o JUMPn, para entender as complexidades e funções biológicas.