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Sistemas de Expressão Livre de Células: Métodos de Produção e Uso

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28 de julho de 2023

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

Neste artigo

Resumo

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. Sistema livre de células PURE OnePot. Jornal de Experimentos Visualizados. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Das células à síntese de proteínas livres de células em 24 horas usando o fluxo de trabalho de autoindução sem células. Jornal de Experimentos Visualizados. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Produção rápida, acessível e descomplicada de lisado livre de células bacterianas. Jornal de Experimentos Visualizados. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos lineares mínimos para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células. Jornal de Experimentos Visualizados. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Caracterização rápida de partes genéticas com sistemas livres de células. Jornal de Experimentos Visualizados. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Um kit de ferramentas de transcrição-tradução streptomyces de alto rendimento para aplicações em biologia sintética e produtos naturais. Jornal de Experimentos Visualizados. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Cromatografia líquida acoplada ao índice de refração ou detecção por espectrometria de massa para perfil de metabólitos em sistemas livres de células baseados em lisados. Jornal de Experimentos Visualizados. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparação de microcápsulas multifuncionais à base de seda carregadas com plasmídeos de DNA que codificam aptâmeros e riboswitches de RNA. Jornal de Experimentos Visualizados. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Estudo de design para implementação para desenvolvimento e validação de pacientes de diagnósticos de toehold switch baseados em papel. Jornal de Experimentos Visualizados. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Editorial

Os sistemas de expressão livre de células (CFE) são um conjunto de ferramentas que reconstituem os principais processos celulares de transcrição, tradução e metabolismo fora dos limites da célula1. Tais métodos cresceram rapidamente em popularidade, oferecendo experimentação simplificada por meio da remoção de membranas celulares e complexidade reduzida por meio da remoção de DNA genômico e a complexidade correspondente de interações entre uma construção genética e o hospedeiro. Os sistemas CFE agora são usados para pesquisa fundamental, detecção, biofabricação e educação. Esta coleção de métodos apresenta nove exemplos de novas maneiras de produzir e usar sistemas livres de células.

Três dos métodos se concentram em tornar a produção de sistemas livres de células mais acessível. Grasemann et al. descrevem uma maneira mais fácil de fazer o sistema PURE, um sistema CFE que reconstitui todos os componentes necessários para transcrição e tradução, em vez de usar lisados celulares2. Em vez de expressar e purificar cada um dos 36 componentes da proteína, os autores agrupam as cepas de expressão, oferecendo a produção de um sistema PURE funcional em uma semana. Smith et al. oferecem um processo simplificado para a produção de sistemas CFE baseados em lisado usando uma abordagem de cultura simplificada que reduz o fluxo de trabalho total para 24 horas, realizável dentro do horário normal de trabalho3. Cooper et al. descrevem um método usando uma cepa de E. coli modificada que permite a lise celular por congelamento-descongelamento, eliminando a necessidade de equipamentos especializados exigidos por outros métodos4. Todos esses métodos contribuem para uma tendência de esforços para tornar a produção de sistemas livres de células alcançável por laboratórios com menos infraestrutura e experiência nos complicados protocolos tradicionais. Com a disponibilidade de kits comerciais concorrentes, mais e mais laboratórios podem explorar as vantagens dos sistemas CFE com pouco risco. Com métodos como os apresentados aqui, esses laboratórios podem optar por fazer seus próprios sistemas CFE adaptados às suas necessidades, sem um grande investimento em equipamentos ou tempo.

Dois métodos se concentram nas vantagens da experimentação rápida e de alto rendimento possível com sistemas CFE. Dopp et al. apresentam um método para amplificar modelos lineares de DNA para triagem rápida de construções genéticas5. Usando sua abordagem, os projetos genéticos podem ser encomendados de empresas de síntese de DNA e, em seguida, amplificados e rastreados em 24 horas. McManus et al. descrevem uma abordagem semelhante em que um gene repórter é amplificado com primers variados que codificam para diferentes componentes regulatórios6. O baixo custo dos oligos emparelhados com sistemas CFE permite uma triagem rápida e econômica de componentes como promotores. Ambos os métodos destacam o potencial dos sistemas CFE para experimentação rápida, reduzindo os prazos para projetar e testar uma construção de semanas usando a clonagem tradicional para dias ou até horas.

Os próximos três métodos fornecem ferramentas para usos especializados de sistemas CFE. Toh et al. oferecem um método para a criação de sistemas CFE a partir de Streptomyces venezuelae7. A maioria dos protocolos CFE é baseada em E. coli, incluindo todos os outros métodos nesta coleção. Este novo método para S. venezuelae traz as vantagens dos sistemas CFE para um organismo de amplo interesse para a produção de produtos naturais. Dinglasan et al. fornecem uma maneira de medir as concentrações de metabólitos em reações livres de células8. Tais medições são críticas para aplicações em engenharia metabólica livre de células, onde o metabolismo intacto dos sistemas CFE é usado para produzir produtos não proteicos de interesse. Em terceiro lugar, Drachuk et al. apresentam microencapsulação de DNA para adição às reações CFE9. Essa abordagem é representativa de um conjunto de técnicas que permite que as vantagens da compartimentalização sejam racionalmente reintroduzidas nos sistemas CFE após a remoção das membranas naturais durante a fabricação dos sistemas CFE. Cada um desses métodos diversifica a gama de aplicações às quais os sistemas CFE podem ser aplicados.

Finalmente, Jaenes et al. descrevem métodos para produzir um diagnóstico do mundo real para o vírus Zika com base em sistemas CFE10. Os testes e a instrumentação são de baixo custo em comparação com tecnologias concorrentes, como PCR, e os autores testaram com sucesso seus diagnósticos usando amostras de pacientes em vários países. Este trabalho é um forte exemplo de aplicações de detecção de ponto de necessidade, que talvez seja a área em que os sistemas CFE estão prontos para causar o impacto mais imediato no mundo real.

Como uma coleção, esses métodos capturam uma faixa representativa das principais áreas de pesquisa ativa em sistemas CFE nos últimos anos. Os métodos que melhoram a produção de sistemas CFE e permitem a experimentação de alto rendimento estão bem representados, e exemplos dos inúmeros usos mais específicos dos sistemas CFE estão presentes. Outras áreas de interesse incluem a produção de proteínas complexas para aplicações médicas, incorporação de aminoácidos não canônicos, otimização para armazenamento de longo prazo e desenvolvimento de células artificiais. Prevemos que a adoção de sistemas CFE continue a acelerar, dada a barreira reduzida à entrada, o potencial para experimentação rápida e a ampla gama de recursos, todos possibilitados por métodos como os apresentados nesta coleção. Os desafios restantes dependem do espaço de aplicação. Para a biofabricação, a redução de custos em escala por meio da mudança para substratos mais baratos e melhor reciclagem será fundamental. Para a detecção, é necessário um trabalho significativo com base no exemplo de Jaenes et al. para demonstrar um desempenho robusto em várias aplicações de ponto de necessidade. Em termos gerais, o campo precisa continuar a refinar as técnicas básicas enquanto expande o repertório do que pode ser feito com os sistemas CFE.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao programa de Pesquisa Aplicada para o Avanço das Prioridades de C&T do Gabinete do Secretário de Defesa por apoiar a colaboração que levou a esta coleção.

Referências

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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