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A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta cerca de 1 em cada 400 pessoas durante a vida. A doença apresenta-se inicialmente como comprometimento dos neurônios motores superiores e inferiores e, eventualmente, progride para paralisia e morte como resultado de insuficiência respiratória dentro de 2 a 5 anos após o início dos sintomas1. A ELA pode ser hereditária, com mais de 30 mutações genéticas diferentes, mas apenas 4 variantes genéticas (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) representando cerca de 55% da ELA familiar. A maioria dos casos de ELA, aproximadamente 90%, representa ELA esporádica, para a qual as principais causas ainda não são totalmente compreendidas2. Há uma necessidade urgente de desvendar os mecanismos da ELA usando as ferramentas apropriadas e os organismos modelo. Nesta coleção de métodos, fornecemos uma visão geral do progresso recente da pesquisa em termos de imitar esta doença e, esperançosamente, encontrar opções de tratamento. Por exemplo, a aplicação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que podem ser diferenciadas em neurônios motores ou astrócitos oferece um sistema modelo humanizado 3,4,5. Além disso, nesta coleção de métodos, são apresentados modelos animais, como Drosophila para estudar a captação de glicose e a junção neuromuscular (JNM) in vivo 6,7, camundongos para estudar neurônios corticais8 e C. elegans ou peixe-zebra para investigar comprometimentos motores 9,10 e tecido post-mortemdo paciente 11.
As larvas do peixe-zebra são transparentes e seus neurônios motores são diretamente visíveis, tornando-os uma ferramenta perfeita para estudos in vivo não invasivos. Asakawa et al. mostram a transição de fase do TDP-43 expresso optogeneticamente em neurônios motores espinhais únicos9. Após a irradiação, a realocação citoplasmática do TDP-43 pode ser observada e analisada. A agregação de TDP-43 citoplasmático é uma característica da degeneração dos neurônios motores na ELA. Este método permite o estudo funcional e a análise de proteínas associadas à ELA de maneira subcelular e temporal.
Empregando microscopia de iluminação estruturada (SIM) de super-resolução, Coyne e Rothstein detalham um protocolo que isola os núcleos e descrevem como investigar complexos de nucleoporinas11. Os complexos de nucleoporinas consistem em várias cópias de cerca de 30 proteínas de nucleoporina diferentes (Nups). O comprometimento do transporte nucleocitoplasmático (NCT) e as alterações de Nup demonstraram ser características precoces de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a ELA. Ao extrair os núcleos, é possível investigar as proteínas Nup individuais dentro do NPC e do nucleoplasma em 3D. Curiosamente, isso pode ser aplicado não apenas a células derivadas de iPSC, mas também a tecidos post-mortem.
Currey e Liachko descrevem dois ensaios para discriminar entre comprometimento motor leve, moderado e grave em modelos de C. elegans de ALS10. No ensaio de locomoção radial, o rastejamento em uma superfície é medido, tornando este um ensaio fácil e econômico. Em seu segundo método, o ensaio de natação, os movimentos de debulhamento podem ser medidos usando um método de rastreamento baseado em computador. Os autores usam isso para estudar TDP-43 e tau.
Hayes et al. também descrevem um método para estudar o NCT8. Eles aplicam um método de permeabilização a culturas neuronais. Usando neurônios corticais primários de camundongos, eles descrevem um método que mantém a integridade da membrana nuclear usando lise hipotônica combinada com uma almofada de albumina de soro bovino. Ao fazer isso, a importação nuclear ainda funciona de maneira dependente de energia, fornecendo assim uma plataforma de microscopia e análise de alto conteúdo. Esta plataforma terá ampla aplicabilidade no futuro para estudar o transporte nuclear passivo e ativo em neurônios primários.
A avaliação rápida de como a manipulação, proteínas relacionadas à doença ou RNA afetam os processos sinápticos e se os medicamentos terapêuticos podem restaurar essas funções é essencial para a pesquisa da ELA. Usando neurônios motores derivados de iPSC, bem como neurônios primários de camundongos, Krishnamurthy et al. apresentam um protocolo que permite o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana da vesícula sináptica3. Os autores demonstram que a transfecção C9orf72-(GA)50 prejudica a transmissão sináptica, destacando a adequação desses métodos para detectar diferenças baseadas em mutações na função sináptica.
A captação alterada de glicose é uma das características patobiológicas da ELA. Neste modelo de Drosophila , Loganathan et al. descrevem um método baseado em FRET para medir as alterações intracelulares na captação de glicose em células específicas6. Usando um sensor FRET de glicose codificado geneticamente, eles validam seu método com neurônios de expressão TDP-43, que exibem maior captação de glicose. Na linha mutante TDP-43G298S , o aumento da captação de glicose só é detectável após estimulação de glicose. Este método fornece uma ferramenta importante para estudar a glicólise não apenas na ELA, mas também em geral em relação à regeneração do neurônio motor.
As técnicas de dissecação que preservam a arquitetura NMJ são de extrema importância para estudar as mudanças nos neurônios motores ao longo da perna de Drosophila ao longo do tempo. Stilwell e Agudelo utilizam uma técnica que permite a caracterização da JNM para a identificação de árvores de neurônios motores por meio de imunocitoquímica7. Curiosamente, os neurônios adultos estão presentes durante toda a vida útil de uma mosca, que é de aproximadamente 90 dias. Comparando uma mutação SOD1H71Y com o tipo selvagem, os autores demonstram diferentes marcadores para inchaço de bouton dependente da idade, agregados de proteínas e mitocôndrias aumentadas.
A inovação de mimetizar uma JNM usando um sistema de co-cultura atende à necessidade urgente de estudar a dissociação entre neurônios motores e miotubos. Em termos deste método, Stoklund Dittlau et al. descrevem como cultivar neurônios motores derivados de iPSC humanos e miotubos derivados de mesoangioblastos primários humanos para formar NMJs funcionalmente ativos4. Os autores mostram sua funcionalidade pela ativação de neurônios motores com cloreto de potássio e influxo de cálcio em miotubos marcados com Fluo-4 posteriormente, o que foi abolido pela administração de bloqueadores NMJ.
Recentemente, os sistemas de co-cultura ganharam cada vez mais atenção. Estudar não apenas um, mas vários tipos de células em um prato tem o benefício de imitar as condições fisiológicas melhor do que os métodos que usam células monocultivadas. A patobiologia relacionada à ELA, como toxicidade mediada por astrócitos e hiperexcitabilidade neuronal, pode ser estudada usando essa abordagem. No vídeo de Taga et al., a geração de neurônios corticais e astrócitos em uma co-cultura combinada com uma configuração de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) é mostrada para monitorar a eletrofisiologia5. A atividade funcional pode ser monitorada ao longo do tempo, permitindo flexibilidade na composição celular, bem como em diferentes condições de cultivo. Além disso, isso fornece uma plataforma para testar o potencial terapêutico dos medicamentos e sua influência na atividade funcional.
Atualmente, existem apenas três tratamentos aprovados pela FDA para ELA, todos com potencial de aplicação limitado. Para encontrar tratamentos mais promissores, pesquisas futuras devem entender melhor a patobiologia, empregando vários sistemas e abordagens de modelo. Sem dúvida, os modelos derivados de iPSC humanos fornecerão uma plataforma interessante para investigar os mecanismos moleculares subjacentes. Isso, combinado com sistemas modelo como peixe-zebra, C. elegans, Drosophila ou roedores, levará ao progresso no campo. Além disso, espera-se que pesquisas epidemiológicas futuras forneçam mais informações sobre como os fatores ambientais desempenham um papel no desenvolvimento da ELA12. Com a expansão dos conjuntos de dados e da bioinformática se desenvolvendo em alta velocidade, será mais fácil desvendar os denominadores comuns das doenças neurodegenerativas no futuro. Isso levará a novos caminhos para terapia ou mesmo prevenção.