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Mesmo antes de o Prêmio Nobel de 2017 ser concedido pela microscopia crioeletrônica (cryoEM) de moléculas biológicas, o campo estava gerando entusiasmo. A revolução da resolução estava bem encaminhada e a biologia estrutural estava olhando para o cryoEM como um método de caracterização que se aproximava do padrão-ouro da cristalografia de raios-x1. No início, o campo do cryoEM abrangia principalmente dados gerados por microscópios eletrônicos de transmissão criogênica (cryoTEMs). Agora, à medida que microscópios, instrumentos de preparação de amostras e métodos de preparação de amostras avançaram, os tipos de dados gerados tornaram-se mais diversificados. O CryoEM não é mais reservado para caracterização de proteínas por cryoTEM. O campo cresceu e agora compreende dados gerados a partir de microscópios eletrônicos de criovarredura e feixe de íons focalizado (cryoSEM/FIB). O impacto é sentido de forma mais ampla em várias disciplinas, incluindo pesquisas de imagem em moléculas, células, tecidos e materiais sintéticos, como hidrogéis.
Os avanços nos recursos de imagem têm sido uma força motriz no desenvolvimento do cryoEM. Melhorias em câmeras, detectores e processamento de imagens abriram caminho para imagens com menos entrada de energia, o que permite que amostras biológicas delicadas sobrevivam ao processo de imagem. Nos TEMs, a exposição do feixe de baixa dose se traduziu na aplicação de tomografia na qual uma única amostra é fotografada repetidamente em vários ângulos para gerar uma reconstrução 3D 2,3. Os avanços em SEM/FIBs também resultaram em melhor resolução usando menos energia. É importante ressaltar que isso levou à melhoria da imagem de amostras não condutoras, o que se traduz em melhor volume de imagem em MEV / FIBs 4,5. Essas melhorias avançaram todas as imagens de microscopia eletrônica biológica, mas melhoraram especialmente a imagem criogênica, onde as amostras são delicadas e não têm metais pesados adicionais adicionados para melhorar o contraste.
À medida que os recursos de imagem avançaram, também avançaram os instrumentos de preparação de amostras. Na preparação de amostras crioEM, o primeiro passo é a vitrificação bem-sucedida das amostras. As amostras hidratadas são congeladas para formar gelo amorfo, evitando assim os danos causados pela formação de cristais de gelo. As principais estratégias são o congelamento por imersão em etano líquido para moléculas e pequenas células ou o congelamento de alta pressão (HPF) para amostras maiores de até algumas centenas de mícrons de espessura. Os avanços na tecnologia de congelamento por imersão permitem a melhor captura de moléculas em todas as orientações, reduzindo a automontagem ao longo da interface ar / água6. Além disso, os avanços na tecnologia HPF permitem a estimulação luminosa e elétrica das amostras momentos antes do congelamento7. Mais recentemente, foi desenvolvida uma nova tecnologia HPF que pode interagir com um microscópio de fluorescência, permitindo um curto atraso de tempo (<2 s) entre a imagem de fluorescência de células vivas e o congelamento HPF8.
Os avanços acima energizaram o campo do cryoEM e inspiraram o desenvolvimento de novos métodos. Houve também um revigoramento das técnicas estabelecidas. Aqui, apresentamos uma coleção de métodos focados no avanço do cryoEM com o objetivo de disseminar essas estratégias para o campo de pesquisa em rápida expansão.
Embora as melhorias nas capacidades de imagem e nos instrumentos de preparação de amostras tenham sido uma grande força motriz por trás dos avanços no campo do cryoEM, um grande obstáculo nesta pesquisa continua sendo a preparação prática de amostras. Truong et al.9 apresentam um método que aproveita a formação de monocamadas lipídicas na interface ar/água. Uma camada lipídica se forma na grade TEM e atua como um andaime para as proteínas de membrana de interesse. Para amostras de membrana multilamelar ou empilhada, Johnson et al.10 apresentam uma estratégia para "descascar" as camadas excedentes, deixando uma única camada na grade que é apropriada para imagens MET. Em outro artigo, Chang et al.11 reconhecem que algumas proteínas são dependentes da temperatura e que a estrutura relevante é observada em temperaturas elevadas. Eles descrevem um método modificado de congelamento por imersão que permite que as amostras sejam aplicadas à grade em temperaturas elevadas enquanto ainda alcançam o gelo vítreo após o congelamento por imersão. Para controlar ainda mais o processo de preparação da grade criogênica, Kang et al.12 apresentam um método de alto rendimento para produzir chips micropadronizados para grades MET nas quais os poros têm uma profundidade controlável. Este método pode fornecer outra variável para controlar a espessura do gelo amorfo durante a preparação da grade.
A correlação de múltiplas modalidades de imagem é impactante. Bieber et al.13 descrevem um fluxo de trabalho criogênico no qual uma grade congelada é visualizada em um microscópio criofluorescente para localizar uma região fluorescente de interesse. A grade é então transferida para um cryoSEM/FIB, onde os fiduciais são usados para alinhar a imagem de fluorescência com a imagem de MEV, permitindo assim que a região fluorescente seja direcionada para moagem FIB. A região alvo é diluída para algumas centenas de nanômetros e, em seguida, a grade é transferida para um cryoTEM para tomografia no local alvo diluído. DiCecco et al.14 demonstram uma correlação entre MET líquido e crioTEM, aproximando-se assim do objetivo de acoplar dados de crioTEM de alta resolução com os dados de MET de moléculas em movimento dinâmico.
A aquisição automatizada de grandes conjuntos de dados também é uma área de interesse. O valioso tempo do instrumento precisa ser maximizado, e a automação é uma etapa fundamental. Kumar et al.15 descrevem a configuração clique a clique de um software automatizado de aquisição de dados para imagens crioTEM.
À medida que o campo da crioEM continua a se desenvolver, mais avanços serão vistos na preparação de amostras, e o impacto da crioEM será sentido amplamente em mais disciplinas. Alguns avanços não envolverão novas técnicas, mas o fortalecimento das técnicas existentes. As técnicas serão mais rápidas, fáceis e robustas, com maior rendimento. À medida que a automação aumenta a produção de dados, as principais áreas de desenvolvimento serão a análise de imagens e o processamento de dados. Além disso, a IA desempenhará um papel importante. Devemos esperar uma redução nos custos e na pegada de instrumentação, o que permitirá que essa tecnologia se torne mais amplamente acessível, embora esses desenvolvimentos possam demorar mais para se materializar.