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O glicogênio, um polímero de glicose ramificado, desempenha um papel importante no metabolismo energético em procariontes e eucariotos. Em condições de limitação de nutrientes, bactérias e leveduras utilizam glicogênio para a sobrevivência celular1. Nos mamíferos, o glicogênio tem papéis específicos do tecido, incluindo o uso local nos músculos para alimentar a contração e no fígado para regularos níveis de glicose no sangue. A síntese de glicogênio é catalisada pela glicogênio sintase, que une os resíduos de glicose por meio de ligações alfa 1,4, e pela enzima ramificada, que forma ligações alfa 1,6, criando ramificações na macromolécula de glicogênio. A utilização desse estoque de energia é facilitada pela glicogênio fosforilase em conjunto com a enzima desramificadora, resultando na remodelação do glicogênio e na liberação de glicose-1-P. A estrutura do glicogênio, incluindo o tamanho e a ramificação das partículas, é de interesse em parte porque a ramificação afeta a solubilidade do glicogênio, o tamanho das partículas de glicogênio afeta sua taxa de degradação e a instabilidade estrutural do glicogênio tem sido implicada no diabetes. Além disso, investigar a localização subcelular do glicogênio é importante em tecidos como os músculos para fornecer informações sobre o papel desse combustível durante o exercício.
O acúmulo de glicogênio é controlado pelas atividades relativas das enzimas sintetizadoras de glicogênio e aquelas que degradam a macromolécula. Wilson3 descreve técnicas para medir a atividade enzimática da glicogênio sintase, glicogênio fosforilase, enzima de ramificação e enzima de desramificação. Esses métodos bioquímicos medem a produção ou consumo de NADH / NADPH ou mudança colorimétrica com um espectrofotômetro. Essas são abordagens escaláveis que contornam o alto custo, equipamentos especializados e carga regulatória associados ao método mais sensível que utiliza radioisótopos. Os métodos descritos são mais adequados para medir a atividade enzimática com enzimas purificadas, embora com diluição homogeneizada suficiente e controles adequados, eles tenham sido usados com amostras de tecido. Wilson3 também descreve um ensaio colorimétrico simples para medir a ramificação do glicogênio. Embora esse método produza menos informações sobre a estrutura fina do glicogênio do que técnicas de separação mais trabalhosas, ele fornece uma medida simples e rápida dos graus relativos de ramificação.
Fermont et al.4 descrevem o uso da eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE), um método para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD), que é um reflexo do tamanho da partícula de glicogênio e da porcentagem de ramificação. A estrutura do glicogênio afeta a capacidade das bactérias de sobreviver à fome, e o glicogênio anormal se acumula em várias doenças de armazenamento de glicogênio, destacando assim a importância de métodos para estudar o tamanho e a ramificação dessa fonte de combustível. A FACE envolve a aminação redutiva de um grupo hemiacetal com ácido 8-amino 1,3,6 pireno trissulfônico (APTS). Além de fornecer informações sobre o CLD, o FACE é útil para medir as propriedades catalíticas de enzimas ramificadas de várias fontes. A principal técnica concorrente, HPAEC-PAD, tem a vantagem de não exigir extremidades não redutoras, mas essa técnica tem um problema de viés de massa.
O grau de ramificação e o tamanho das partículas de glicogênio são características importantes do polímero de glicose. Foi observado usando microscopia eletrônica que o glicogênio existe em três estruturas: partículas beta esféricas (~ 20 nm), que incluem várias partículas gama (3 nm), e partículas alfa maiores em forma de roseta (~ 300 nm) compostas por partículas beta5. Os métodos tradicionais de isolamento do glicogênio são suficientes para medir a concentração de glicogênio, mas comprometem a estrutura fina do glicogênio, o que significa que é necessário o desenvolvimento de uma técnica mais branda. Uma extração de água fria usando centrifugação com gradiente de densidade de sacarose é descrita para uso em bactérias por Wang, Wang et al.6. Essa técnica é superior a outros métodos na preservação de moléculas de glicogênio maiores, medidas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), e cadeias mais longas, medidas por eletroforese capilar assistida por fluoróforo (FACE)6. Wang, Liu et al.7 também aplicam um método semelhante ao fígado. A importância de entender a estrutura do glicogênio é demonstrada por um relatório recente mostrando que, no diabetes, as partículas alfa de glicogênio hepático são "frágeis", o que resulta em degradação mais rápida em comparação com partículas alfa estáveis, possivelmente impactando o controle da glicose no sangue. As limitações desses métodos de isolamento baseados em gradiente de sacarose incluem a perda de glicogênio no sobrenadante, que pode ser mitigada por uma concentração mais baixa de sacarose, e a degradação enzimática de uma parte do glicogênio devido às condições amenas utilizadas. Este último é mitigado por uma breve etapa de ebulição, embora isso interrompa as proteínas associadas.
Finalmente, Jensen et al.8 descrevem o uso de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para obter imagens da distribuição subcelular de glicogênio e do tamanho das partículas em fibras musculares esqueléticas individuais. Este método é o único disponível para investigar pools de glicogênio subsarcolemal, intermiofibrilar e intramiofibrilar e tem sido usado em tecidos musculares de uma variedade de animais. Como alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente glicogênio como combustível, é importante caracterizar a localização desses estoques de combustível. Além disso, este método fornece a capacidade de examinar o metabolismo do glicogênio em diferentes tipos de fibras musculares, o que é importante no exercício, onde a fadiga é dependente do glicogênio apenas em fibras selecionadas. Uma limitação do método MET é a incapacidade de detectar pequenas partículas de glicogênio, e isso é uma preocupação particularmente para condições sob as quais o glicogênio está sendo degradado, como durante a contração muscular.
Em conclusão, esta coleção de métodos fornece uma amostra das técnicas que são usadas para investigar a estrutura do glicogênio e as enzimas que regulam o anabolismo e o catabolismo dessa macromolécula. Esses métodos serão fundamentais para melhorar nossa compreensão do metabolismo do glicogênio em condições fisiológicas e patológicas.