Summary
Bu çalışma, embriyonik zebra balığı beyninin radyal glia progenitörlerinin bölünmesinde soy içi Notch / DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirmektedir.
Abstract
Farklı kaderlere sahip iki yavru hücre üreten asimetrik hücre bölünmesi (ACD), hücresel çeşitlilik oluşturmak için temeldir. Hem omurgasızların hem de omurgalıların gelişmekte olan organlarında, asimetrik olarak bölünen progenitörler, bir Notchhi kendini yenileyen ve bir Notchlo farklılaştırıcı kızı üretir. Embriyonik zebra balığı beyninde, radyal glia progenitörleri (RGP'ler) - başlıca omurgalı nöral kök hücreleri - çoğunlukla bir RGP ve bir farklılaştırıcı nöron doğurmak için ACD'ye maruz kalırlar. Zebra balığı embriyolarının optik netliği ve kolay erişilebilirliği, ACD sırasında Çentik sinyalizasyonunun asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu doğrudan görselleştirmek için in vivo hızlandırılmış görüntüleme için idealdir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Notch ligand DeltaD'nin dinamik endositozunun ACD sırasında hücre kaderinin belirlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını ve sürecin evrimsel olarak korunmuş polarite düzenleyicisi Par-3 (Pard3 olarak da bilinir) ve dinein motor kompleksi tarafından düzenlendiğini göstermiştir. Mitotik RGP'lerde Notch sinyal endozomlarının in vivo kaçakçılık paternlerini görselleştirmek için, bu antikor alım testini geliştirdik. Tahlil kullanarak, RGP bölünmesi sırasında DeltaD içeren endozomların dinamiğini ortaya çıkardık.
Introduction
Çentik sinyalizasyonu, metazoalarda1 gelişim sırasında hücre kaderi kararını ve modellemesini kontrol eder ve son çalışmalar, kök hücre bölünmesinde Çentik sinyallemesinin esas olarak endositik kaçakçılığa bağlı olduğunu göstermiştir 2,3. Endositozlu Çentik / Delta, çekirdekteki Çentik sinyallemesini aktive edebilir ve Çentik hedef genlerinin transkripsiyonunu artırabilir 4,5,6. Yönlü Çentik/Delta endozomal kaçakçılığı ilk olarak asimetrik hücre bölünmesi (ACD) sırasında Drosophila duyu organı öncüsü (SOP) hücrelerinde gözlendi ve pIIa'da pIIb 7,8'den daha yüksek bir Notch sinyal aktivitesi ile sonuçlandı. Mitotik SOP hücrelerinde endositik süreci izlemek için anti-Delta ve anti-Notch antikorları ile antikor alım testleri uygulanmıştır. Çentik/DeltaD endozomları, sitokinez sırasında bir kinesin motor proteini ile birlikte merkezi iş miline doğru hareket eder ve hücre bölünmesi 3,8'in son anında asimetrik merkezi milin antiparalel dizisi nedeniyle asimetrik olarak pIIa hücresine translokasyona uğrar. Bu çalışmalar, Drosophila SOP hücrelerinde asimetrik bölünmeyi düzenleyen moleküler mekanizmalara ışık tutmuştur, ancak omurgalı radyal glia progenitörlerinde (RGP'ler) benzer endositik süreçlerin meydana gelip gelmediği belirsizdir.
Ayrıca, omurgalı RGP bölünmesi sırasında asimetrik Çentik / DeltaD sinyallemesini düzenleyen moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. Zebra balıklarında, Çentik ve Delta'nın etkileşiminin DeltaD ligand9'un endositozunu kolaylaştırdığı bildirilmiştir. DeltaD endositozunun gelişmekte olan omurgalı beynindeki yavru hücrelerin hücre kaderi seçimini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, floresan olarak konjuge edilmiş anti-DeltaD antikorlarının nöral tüpe enjekte edilmesinin, Sara endozomlarını spesifik olarak nöroepitel hücrelerinde etiketleyebileceğini ve Sara endozomları içeren anti-DeltaD'nin tercihen çoğalan yavru hücrelere ayrıldığını göstermektedir10. Endozomlardan gelen Notch sinyallerinin yavru hücre kaderini düzenleyebileceği öne sürülmüştür. Önceki sonuçlar, gelişmekte olan ön beyindeki zebra balığı RGP hücrelerinin çoğunun ACD'ye maruz kaldığını ve yavru hücre kaderinin belirlenmesinin intralineage Notch / DeltaD sinyallemesine bağlı olduğunu göstermiştir11. Zebra balığı RGP'lerinde soy içi Çentik / DeltaD sinyallemesinin doğasını aydınlatmak için, zebra balığı gelişmekte olan beyinde anti-DeltaD antikor alım testini geliştirdik. Bu protokolü kullanarak, mitotik RGP'lerde DeltaD endositik kaçakçılığının canlı etiketlemesini ve görüntülemesini başarıyla gerçekleştirdik.
Floresan olarak etiketlenmiş anti-DeltaD-antikoru, ön beyin ventrikülü boyunca RGP'lere etkili bir şekilde içselleştirilir. Asimetrik olarak bölünen RGP'ler12,13'te DeltaD endozomlarının yönlü kaçakçılığının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Drosophila notum kültürleri ve zebra balığı omuriliği 10 için geliştirilen önceki antikor alım protokolleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol beyin ventrikül hücre tabakasında, özellikle10 nL'den az mikroenjeksiyonlu antikor karışımı ile uzun ömürlü ve yüksek etkili anti-DeltaD etiketlemesi sağlamıştır. Arka beyin ventrikül enjeksiyonu, gelişmekte olan beyinde antikor alım testini uygulamak için çok uygundur, çünkü arka beyin ventrikülü zebra balığı embriyolarında iyi genişlemiş ve erken gelişim aşamasında beyin omurilik sıvısı ile doldurulmuştur14. Antikor karışımını herhangi bir önemli gelişmekte olan dokuya zarar vermeden arka beyin ventrikülüne enjekte ederek, protokol ön beyindeki görüntüleme bölgesine olası hasarı mümkün olduğunca en aza indirmiştir. Enjekte edilen primer antikorun azaltılmış dozu, endojen Delta-Notch sinyallemesine in vivo müdahale etmenin potansiyel yan etkilerinden de kaçınmıştır. Bu protokol, diğer farmakolojik veya genetik bozulmalarla kolayca birleştirilebilir, farklı gelişim aşamalarında kullanılabilir ve muhtemelen yetişkin beynine ve insan pluripotent kök hücre kaynaklı 2D / 3D beyin organoidlerine uyarlanabilir. Birlikte ele alındığında, protokol ACD sırasında Notch sinyal asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu anlamayı mümkün kılmıştır. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasındaki temel zorluk, spesifik deneysel koşullara dayanarak uygun antikor konsantrasyonlarının hassas bir şekilde verilmesini sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma için AB vahşi tip çizgisini ve transgenik çizgi Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] kullanılmıştır. Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco, ABD'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: AN179000).
1. Zebra balığı embriyolarının hazırlanması
- Öğleden sonra saat 17:00'den önce, her tankta ayırmak için bölücüler kullanarak bir dişi vahşi tip balık ve bir erkek Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] balığı ile balık geçiş tankları kurun.
- Ertesi sabah saat 11:00'den önce bölücüleri tüm geçiş tanklarından çıkarın. Sessiz olun ve çiftleşirken balıkları rahatsız etmeyin. Yumurtlama tipik olarak bölücüleri çıkardıktan sonra 30 dakika içinde gerçekleşir. Döllenmiş yumurtalar tankın dibinde kalır.
- Döllenmiş yumurtaları bir ağ filtresi ile tanklardan toplayın. Yumurtaları yumurta suyuyla dolu bir Petri kabına yıkayarak aktarın ve embriyoları diseksiyon mikroskobu altında 10x ila 20x büyütmede inceleyin.
- Döllenmiş embriyoları, büyük delikli cam Pasteur pipetlerle yaklaşık 20 mL embriyo ortamı (100 mL 1.000x stok çözeltisi 29.4 g NaCl, 1.27 g KCl, 4.85 g CaCl 2.2H 2 O ve 8.13 g MgSO4.7H 2O içerir) içeren temiz bir Petri kabına aktarın. Embriyoları 28 °C'de tutun. Petri kabı başına 50 döllenmiş embriyoyu, 28.5 ° C'de 30 mL embriyo ortamı ile tutun.
NOT: Bir çift balık normalde 100-300 embriyo üretir ve sağlıklı embriyoların döllenme ve hayatta kalma oranı her çiftleşme için% 95'in üzerindedir. - Ertesi sabah, embriyolar döllenme sonrası ~ 18-20 saatlik (hpf) gelişim aşamasına ulaştığında, embriyoları sabah 8: 00'de inkübatörden çıkarın. Onları ilk başta beyaz ışık kullanarak 20x büyütmede bir epifloresan mikroskobu altında gözlemleyin. O zaman, zebra balığı embriyoları 20 somit aşamasındadır.
- Bulutlu veya yırtılmış ölü embriyoları mikroskop altında bir cam pipet kullanarak atın.
- Floresan lambayı açın ve mikroskobun RFP filtre ayarını seçin. Ardından, güçlü kırmızı floresansı olan embriyoları seçin ve yumurta suyuyla yeni bir kaba aktarın.
- Embriyoları beyaz ışık altında iki ince forseps (forseps uçları keskin ve hasarsız olmalıdır) ile manuel olarak dekoryonlayın (Malzeme Tablosu).
- Koryonu bir çift forseps ile tutun ve diğer forsepslerle koryonda bir yırtılma yapın. Forsepsleri kullanarak gözyaşını dikkatlice açın ve embriyoyu diğer forsepslerin uçlarıyla hafifçe iterek embriyonun geçmesi için yeterince büyütün.
- Mikroenjeksiyondan önce hızlı bir durulama için dekoryonlanmış embriyoları taze embriyonik ortama sahip yeni bir Petri kabına aktarın.
2. Mikroenjeksiyonun hazırlanması
- Bir çektirme üzerine ince enjeksiyon iğneleri çekmek için kılcal damarları (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, filamentli) kullanın. Çekme programını el kitabına göre tasarlayın ve optimize edin.
- İğnenin ucunu stereo diseksiyon mikroskobu altında forseps ile açın. Ucun çapını 10 μm civarında ve konik açısını 30° civarında yapın.
- Enjeksiyondan önce fare monoklonal anti-Dld antikorunu anti-Mouse-IgG-Atto647N ile konjuge edin.
- Her enjeksiyon deneyi için, 5-10 kez pipetleme yaparak 0,5 μL anti-Dld antikoru (0,5 mg/mL) ile 2 μL anti-Mouse-IgG-Atto647N antikoru (1 mg/mL) karıştırın. Ardından, oda sıcaklığında en az 30 dakika (veya 2-3 saat boyunca buz üzerinde) inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, antikor karışımına 2,5 μL bloke edici tampon (10 mg/mL fare IgG) ve 0,5 μL% 0,5 fenol kırmızısı ekleyin ve karışımda kalan konjuge edilmemiş antikorları bloke etmek için iyice karıştırmak için 10x pipet ekleyin.
NOT: Her deneme için, anti-Dld antikoru olmadan ekstra bir karışım hazırlayın ve kontrol olarak kullanın.
- Embriyo ortamında% 1 düşük erime noktası agarozu hazırlayın. Agaroz içeren karışımı, karışım şeffaflaşana kadar 70 ° C'de ısıtın.
- 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde agaroz çözeltisini aliquot. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.
- Embriyoyu% 1 düşük erime noktası agaroz içeren tüpte 3 saniye boyunca durulayın.
- Embriyoyu, Şekil 1'de gösterildiği gibi her embriyoyu ayrı ayrı kapağa monte etmek için ayrı ayrı agaroz damlaları (~ 30-40 μL) ile birlikte ters çevrilmiş plastik bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Embriyoları agarozun içine yanal olarak düz bir şekilde yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bu pozisyonu koruyun.
- 12 embriyoyu yukarıdaki gibi birer birer üç sıraya monte edin. Agarozdaki tüm monte edilmiş embriyoları yumurta ortamı ile örtün.
3. Mikroenjeksiyon
- Gömülü embriyoları stereomikroskop altına koyun ve agarozu yumurta suyuyla örtün.
- Hava basıncı enjektörünü mikromanipülatörlerle birlikte ayarlayın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi mikroskoplara yakın yerleştirin. Hava kaynağı olarak yüksek basınç altında gaz halinde azot (N2) içeren çelik gaz tüpünü kullanın.
- Gaz valfini ancak embriyolar agaroza monte edildikten sonra açın. Daha sonra, mikroenjektörün ön doldurma modülünü kullanırken, hazırlanan cam iğneyi, Şekil 1'de gösterildiği gibi, mikromanipülatöre 2 μL antikor karışımı ile önden yükleyin.
- Giriş basıncını ~80-90 psi'ye ve enjeksiyon basıncını ~20 psi'ye ayarlayın.
- Daha önce açıklandığı gibi mikroskop altında bir mikrometre kullanarak enjeksiyon hacmini kalibre edin15. İğne açıklığının boyutuna göre ayar süresini 10 ms ile 120 ms arasında olacak şekilde ayarlayın. Küreğe dokunarak her enjeksiyon darbesini iletin. Her teslimatın enjeksiyon hacmini ~ 4-5 nL'ye ayarlayın.
- Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu arka beynin arka çatı plakasından r0/r1 menteşe noktasına doğru dürtün ve beyin dokusuna çarpmadan yaklaşık 10 nL (iki veya üç darbe) antikor karışımı enjekte edin. Beyin ventrikülündeki kırmızı sıvıların akışını gözlemleyin.
NOT: Arka beyin ventrikülü, orta beyin arka beyin sınırının arkasındadır. Enjekte edilen fenol kırmızısı içeren antikor karışımı, beyin omurilik sıvısı ile yayılarak beyin ventrikülünü arka beyinden ön beyne hemen doldurur. - Enjeksiyondan sonra, mikromanipülatörün düğmesini döndürerek iğnenin ucunu embriyodan hızlı bir şekilde çıkarın. Başarılı bir enjeksiyon için, enjekte edilen karışımın kırmızı boyası, etraftaki agaroza sızmadan beyin ventrikülünde stabil bir şekilde kalır.
- Montaj plakasını mikroskop altında hareket ettirerek başka bir monte edilmiş embriyoyu tekrarlar için uygun bir konumda bulun.
- Altı ila sekiz embriyo enjekte ettikten sonra, embriyoları gömülü agarozdan serbest bırakmak için agarozu mikrocerrahi bir bıçakla soyun. Mikroenjeksiyonlu embriyoları 30 mL embriyo ortamına sahip taze bir kaba aktarın ve sonraki adımlar için oda sıcaklığına yerleştirin.
4. Montaj ve hızlandırılmış canlı görüntüleme
- 30 dakika sonra, seçilen embriyoları 10 mL embriyo ortamına aktarın. Embriyoları uyuşturmak için 10 mL embriyo ortamına 420 μL trikain stoğu (4 mg / mL) ekleyin.
- Embriyoları monte etmek için, tüpte aynı konsantrasyonda trikain içeren% 0.8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.
- Enjekte edilen embriyoları 3 s boyunca sıcak agaroza batırmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra, embriyoları hemen aynı cam pipetle agarozdan çıkarın ve embriyoları tüpten bir damla agaroz ile 35 mm cam tabanlı kültür kaplarının ortasına yerleştirin. Camın üzerine damla başına sadece bir embriyo yerleştirin.
- Embriyonik beynin dorsal tarafını cam tabana mümkün olduğunca yakın tutmak için embriyoları bir lif probu veya yükleme ucu ile nazikçe yönlendirin. Agaroz yavaş yavaş katılaştıkça embriyoyu kıvrılmadan uzatmak için embriyo pozisyonunu yavaşça ayarlayın.
- Daha sonra, cam alt kabı ters çevirerek embriyo pozisyonunu kontrol edin. Doğru şekilde monte edilmiş embriyolara sahip tüm dorsal ön beynin mikroskop altında görülebildiğinden emin olun.
- Embriyoyu örtmek için trikain içeren 28.5 °C önceden ısıtılmış embriyonik ortamdan 2-3 mL ekleyin. Çanağı, Şekil 1'de gösterildiği gibi, konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına düzgün bir şekilde yerleştirin. Görüntüleme odasının sıcaklığını 28,5 °C'de olacak şekilde ayarlayın. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.
- 40x suya daldırma hedefini kullanarak sabit bir zaman aralığıyla hızlandırılmış canlı görüntüleme gerçekleştirin.
- Görüntüleme ve mikroskop kontrol yazılımını kullanın (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Hücredeki MyR-Tdtomato transgenik zebra balığı ve endozomal anti-Dld-Atto647N'nin membran floresansını görüntülemek için 564 nm ve 647 nm görüntüleme kanallarını seçin (Şekil 1).
- Lazer gücünü her iki kanal için de %30'a ayarlayın. Her kanal için z düzlemi başına 200 ms'lik bir pozlama süresi kullanın.
- Takılan her zebra balığı embriyosu için, toplamda 20 z-düzlemi için 1 μm'lik bir tarama z adımı ve 100 zaman diliminde bir tarama döngüsü kullanın.
- Her tarama döngüsü ile tarama modu arasındaki zaman aralığını 20 sn olarak ayarlayın ve kanal, dilim olarak ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A'da, birincil antikora bağlanmadan Atto647N ile enjekte edilen embriyolar, beyin ventrikülünde arka plan floresansı gösterdi. Hücrelerde çok az yutulmuş floresan partikülü gözlenebilir. Anti-Dld-Atto647N enjekte edilen zebra balığı embriyoları, gelişmekte olan ön beynin çoğu hücresinde büyük miktarlarda içselleştirilmiş floresan parçacıkları gösterdi (Şekil 2A, sağ panel). Mitotik RGP'lere odaklanmak için yakınlaştırdıktan sonra, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, hücre bölünmesi sırasında hücre içi anti-Dld-Atto647N endozomlarının dinamik hareketini kaydedebildik (Video 1). Çoğu mitotik RGP, anti-Dld-Atto647N endozomlarının iki kızı hücreye anterior veya posterior asimetrik ayrışmasını gösterdi12. Ayrıca, asimetrinin anafazın sonuna doğru stabilize olduğunu ve12'den sonra kızı hücreler tarafından Notch sinyal endozomlarının asimetrik kalıtımına neden olduğunu fark ettik.
Şekil 1: Deneysel adımların akış şeması. MyR-Tdtomato muhabirini ifade eden transgenik zebra balığı, 1. günde AB vahşi tipi ile geçildi. 2. günde, mikroenjeksiyon için kırmızı floresan embriyolar seçilir ve ardından zaman atlamalı görüntüleme yapılır. 2. gündeki tüm deney yaklaşık 8 saat sürer. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gelişmekte olan zebra balığı beyninde anti-Dld-Atto-647N antikor alımının hızlandırılmış görüntülemesi. (A) Döllenme sonrası 1 günlük (dpf) embriyonun ön beyninde 30 dakikalık mikroenjeksiyondan sonra Anti-Dld-Atto-647N alımı. Sol panelde sadece Atto-647N ile enjekte edilen embriyo bulunur. Sağ panelde anti-Dld-Atto-647N ile enjekte edilen embriyo bulunur. Çizgi çizgileri ventrikül boyunca apikal tabakayı gösterir. Dikdörtgen bölgesi B'de yüksek büyütme ile gösterilir. Ölçek çubuğu = 40 μm. Kısaltmalar: Di = Diencephalon; Tel = Telencephalon; Ve = ventrikül. (B) Mitoz sırasında anti-Dld-Atto-647N dinamiklerinin hızlandırılmış görüntüleme panelleri. Montajdaki sekiz zaman dilimi, anti-Dld-Atto-647N'nin bölünen bir RGP'nin iki kızı hücresine alımını ve ayrılmasını gösteren tüm mitotik döngüyü kapsıyordu. Ölçek çubuğu = 5 μm Hücre zarı ana hatlarıyla belirtilmiştir. Hem A hem de B'de, membran üzerindeki MyR-Tdtomato etiketlemesi mavidir ve anti-Dld-Atto-647N macentadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: İçselleştirilmiş anti-Dld-Atto-647N'nin mitoz boyunca radyal glia hücrelerini bölmede dinamikleri (40 zaman dilimi ve her kare arasında 30 s'lik bir aralık süresi; toplamda 20 dakika). Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı radyal glia progenitörlerinde endozomal Notch / Delta kaçakçılığını yüksek verimlilikle etiketlemek ve görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirdik. Drosophila SOP hücreleri 7,8'de etiketli anti-DeltaD antikorunu izlemek için kullanılan önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz konjuge antikordaki numunelerin inkübasyonu yerine mikroenjeksiyon kullanmıştır. Floresan konjuge anti-Dld antikorları arka beyin ventrikülüne mikroenjekte edildi; Bu teknik, enjeksiyondan sonra embriyoların normal gelişimi ve tam iyileşmesi ile kanıtlandığı gibi yaralanmaya neden olmaz. Embriyonik ventriküller süreklidir ve enjekte edilen antikorun mikroenjeksiyondan sonra ön beyne doğru serbestçe dağılmasına izin verir. Enjekte edilen anti-Dld-atto647N, beyinde sürekli antikor alımının kararlı bir kaynağı olarak 24 saatten fazla sürer. Önceki bir rapor10'da tanıtılan nöral tüp enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, zebra balığı arka beyin ventrikül enjeksiyonu doku hasarına neden olmaz ve beyin ventriküllerini in vivo olarak kaplayan mitotik RGP'ler tarafından seçici anti-Dld-Atto647N alımını sağlar. Omurilikteki nöroepitel hücrelerinde antikor alımını kontrol etmemiş olsak da, anti-Dld-Atto647N antikor alımı beyinde olduğu gibi orada da uygulanmalıdır. Arka beyin ventrikülüne enjekte edilen konjuge antikorların omurilik boyunca da yayılması beklenir.
Antikor alım testinin başarılı bir şekilde uygulanması için en önemli konu, bir membran protein hedefinin hücre dışı alanı için yüksek bağlanma afinitesine ve özgüllüğüne sahip bir primer antikor kullanılmasıdır. Çentik / Delta sinyalini etiketlemeye ek olarak, protokol benzer stratejiler kullanarak diğer membran proteinlerini veya hücre dışı proteinleri etiketlemek için de geçerlidir. Protokolümüz, anti-Dld primer antikorunun yüksek kalitesi ve yüksek özgüllüğü nedeniyle zebra balığı embriyolarının geliştirilmesinde yüksek etkili anti-Dld antikor alımı göstermiştir. İkincisi, anti-Dld primer antikorunun floresan sekonder antikor ile konjugasyonu, in vivo olarak yüksek düzeyde antikor alım etkinliği elde etmek için kritik öneme sahiptir. Atto ağartmayan sekonder antikorların, Drosophila notum kültürlerinde kullanılan Zenon ve Alexa sekonder antikorları gibi diğer floresan antikorlardan daha kararlı ve çok daha parlak olduğunu bulduk 7,10. Normalde GFP veya RFP transgenik zebra balığı veya GFP veya RFP ile benzer uyarma dalga boylarını paylaşan diğer bazı floresan belirteçleri ile birlikte kullanacağımız için floresan etiket olarak Atto647N'yi seçtik. Farklı uyarma dalga boylarına sahip diğer ağartılamayan ikincil antikorlar da protokolle birlikte çalışmalıdır. Protokolümüzde, Atto sekonder antikoru ile karıştırılan primer antikorların inkübasyon süresini 12 saatten 30 dakikaya düşürdük ve son mikroenjeksiyon karışımlarında Anti-Dld antikorlarının konsantrasyonunu 0.05 mg / mL'ye düşürdük. Daha yüksek bir anti-Dld antikor konsantrasyonu (0.25 mg / mL), zebra balığı embriyolarında antikor alım verimliliğini arttırmamıştır; Bu, floresan sekonder antikorlar10 ile yeterli etiketleme elde etmek için uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duyulmasının nedeni olabilir. Önceki çalışmalarda olduğu gibi anti-Dld antikoru daha yüksek bir konsantrasyonda kullanmadık10, çünkü enjekte edilen anti-Dld-Atto647N antikorlarının, DeltaD ligandını RGP'lerin zarına bağlarken endojen olarak eksprese edilen Çentik / Delta ile rekabet etme olasılığı vardır, böylece in vivo olarak cis veya trans Notch / Delta sinyallemesine müdahale eder. Ayrıca, primer antikor konjugasyonundan sonra eklenen bloke edici tamponun, in vivo antikor alım testinin özgüllüğünü arttırmada yardımcı olduğunu bulduk. Şekil 2'de gösterildiği gibi, ön beyindeki çoğu RGP, anti-Dld-Atto647N'yi aktif olarak içselleştirir. Bloke edici tamponu eklemeden, çoğu hücre çok az içselleştirilmiş anti-Dld-Atto647N endozomu gösterir (veriler gösterilmemiştir).
Protokolün ana sınırlaması, alım testi için kullanılabilecek antikorların mevcudiyetidir. Protokolümüz, hücre dışı alana karşı iyi bir antikor mevcutsa, membran eksprese proteinleri etiketlemek için geçerlidir. Sitozolik ve nükleer proteinler için, konjuge antikorlar hücre içi bağlanma hedeflerine bağlanmak için hücre zarından geçemediğinden, antikor alım testi uygulanamaz. Hücre içi proteinlerin canlı görüntülenmesi esas olarak farklı floresan transgenik modellere bağlıdır. Son yıllarda, DNA, RNA, aktin ve tübülin17'nin canlı hücre görüntülemesine önemli ölçüde katkıda bulunan Silikon Rodamin benzeri (SiR) teknolojisi gibi canlı hücre görüntülemesi için daha fazla floresan boya geliştirilmiştir. Farklı canlı etiketleme stratejilerinin bir kombinasyonu, canlı hücrelerdeki karmaşık sinyal yollarını incelemenin en iyi yolu olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Proje, NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Tohum İnovasyon Ödülü ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
