Artigo de método

Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 de março de 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve a montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), uma técnica microfluídica para gerar lipossomas biocompatíveis. O OLA produz lipossomas monodispersos do tamanho de mícrons com encapsulamento eficiente, permitindo a experimentação imediata no chip. Prevê-se que este protocolo seja particularmente adequado para biologia sintética e pesquisa de células sintéticas.

Resumo

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A microfluídica é uma ferramenta amplamente utilizada para gerar gotículas e vesículas de vários tipos de forma controlada e de alto rendimento. Os lipossomas são miméticos celulares simplistas compostos por um interior aquoso circundado por uma bicamada lipídica; Eles são valiosos para projetar células sintéticas e entender os fundamentos das células biológicas de forma in vitro e são importantes para ciências aplicadas, como a entrega de carga para aplicações terapêuticas. Este artigo descreve um protocolo de trabalho detalhado para uma técnica microfluídica on-chip, montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), para produzir lipossomas biocompatíveis monodispersos, de tamanho micron. O OLA funciona de forma semelhante ao sopro de bolhas, onde uma fase aquosa interna (IA) e uma fase adjacente de 1-octanol carreadora de lipídios são pinçadas por fluxos de fluido externo contendo surfactante. Isso gera prontamente gotículas de emulsão dupla com bolsas de octanol salientes. À medida que a bicamada lipídica se reúne na interface da gota, a bolsa se desprende espontaneamente para dar origem a um lipossomo unilamelar que está pronto para posterior manipulação e experimentação. O OLA oferece várias vantagens, como geração constante de lipossomas (>10 Hz), encapsulamento eficiente de biomateriais e populações de lipossomas monodispersas, e requer volumes de amostra muito pequenos (~50 μL), o que pode ser crucial quando se trabalha com biológicos preciosos. O estudo inclui detalhes sobre microfabricação, litografia suave e passivação de superfície, que são necessários para estabelecer a tecnologia OLA no laboratório. Uma aplicação da biologia sintética de prova de princípio também é mostrada induzindo a formação de condensados biomoleculares dentro dos lipossomas via fluxo de prótons transmembrana. Espera-se que este protocolo de vídeo que o acompanha facilitará aos leitores estabelecer e solucionar problemas de OLA em seus laboratórios.

Introdução

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Todas as células têm uma membrana plasmática como limite físico, e esta membrana é essencialmente um arcabouço na forma de uma bicamada lipídica formada pela auto-montagem de moléculas lipídicas anfifílicas. Os lipossomas são as contrapartes sintéticas mínimas das células biológicas; Possuem lúmen aquoso circundado por fosfolipídios, que formam uma bicamada lipídica com os grupos de cabeças hidrofílicas voltadas para a fase aquosa e as caudas hidrofóbicas enterradas para dentro. A estabilidade dos lipossomas é governada pelo efeito hidrofóbico, assim como pela hidrofilicidade entre os grupos polares, forças de van der Waals entre as caudas de carbono hidrofóbicas e a ligação de hidrogênio entre as moléculas de água e as cabeças hidrofílicas 1,2. Dependendo do número de bicamadas lipídicas, os lipossomas podem ser classificados em duas categorias principais: vesículas unilamelares compostas por uma única bicamada e vesículas multilamelares construídas a partir de múltiplas bicamadas. As vesículas unilamelares são ainda classificadas com base em seus tamanhos. De forma tipicamente esférica, podem ser produzidas em uma variedade de tamanhos, incluindo pequenas vesículas unilamelares (SUV, diâmetro de 30-100 nm), grandes vesículas unilamelares (LUV, diâmetro de 100-1.000 nm) e, finalmente, vesículas unilamelares gigantes (GUV, >diâmetro de 1.000 nm)3,4. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de lipossomas, e estas podem ser amplamente categorizadasem técnicas de massa5 e técnicas microfluídicas6. Técnicas de massa comumente praticadas incluem reidratação de filme lipídico, eletroformação, transferência de emulsão invertida e extrusão 7,8,9,10. Estas técnicas são relativamente simples e eficazes, e estas são as principais razões para o seu uso generalizado na comunidade de biologia sintética. No entanto, ao mesmo tempo, sofrem de grandes desvantagens no que diz respeito à polidispersidade de tamanho, à falta de controle sobre a lamelaridade e à baixa eficiência de encapsulação 7,11. Técnicas como continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE)12 e droplet shooting and size filtration (DSSF)13 superam essas limitações até certo ponto.

As abordagens microfluídicas têm ganhado destaque na última década. A tecnologia microfluídica fornece um ambiente controlável para manipular fluxos de fluidos dentro de microcanais definidos pelo usuário devido ao fluxo laminar característico e à transferência de massa dominada por difusão. Os dispositivos lab-on-a-chip resultantes oferecem possibilidades únicas para o controle espaço-temporal de moléculas, com volumes de amostra significativamente reduzidos e capacidade de multiplexação14. Numerosos métodos microfluídicos para fazer lipossomas foram desenvolvidos, incluindo jato pulsado 15, modelagem de emulsão dupla 16, ejeção de membrana transitória 17, transferência de emulsão em gotícula18 e focalização hidrodinâmica 19. Essas técnicas produzem lipossomas monodispersos, unilamelares do tamanho de células com alta eficiência de encapsulação e alto rendimento.

Este artigo detalha o procedimento de montagem de lipossomas assistidos por octanol (OLA), um método microfluídico on-chip baseado no pinch-off hidrodinâmico e subsequente mecanismo de desidratação do solvente20 (Figura 1). Pode-se relacionar o funcionamento do OLA a um processo de explosão de bolhas. Uma junção de seis vias concentra a fase aquosa interna (IA), duas correntes orgânicas carreadoras de lipídios (LO) e duas correntes aquosas externas (OA) contendo surfactante em um único ponto. Isso resulta em gotículas de emulsão dupla água-em-(lipídios + octanol)-em-água. À medida que essas gotículas fluem rio abaixo, a minimização da energia interfacial, o fluxo de cisalhamento externo e a interação com as paredes do canal levam à formação de uma bicamada lipídica na interface à medida que a bolsa de solvente se desprende, formando assim lipossomas unilamelares. Dependendo do tamanho do bolso octanol, o processo de desumectação pode levar de dezenas de segundos a alguns minutos. No final do canal de saída, as gotículas octanol menos densas flutuam para a superfície, enquanto os lipossomas mais pesados (devido a uma solução encapsulada mais densa) afundam no fundo da câmara de visualização prontos para experimentação. Como um experimento representativo, o processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas é demonstrado. Para isso, os componentes necessários são encapsulados dentro de lipossomas a um pH ácido que impede a LLPS. Ao desencadear externamente uma mudança de pH e, portanto, um fluxo transmembrana de prótons, gotículas de condensado separadas por fase são formadas dentro dos lipossomas. Isso destaca os recursos efetivos de encapsulamento e manipulação do sistema OLA.

Protocolo

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1. Fabricação do wafer mestre

  1. Pegue um wafer de silicone limpo de 4 polegadas (10 cm) de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais). Limpe-o ainda mais usando ar pressurizado para remover quaisquer partículas de poeira.
  2. Monte o wafer em um revestidor de spin e distribua suavemente ~5 mL de um fotorresiste negativo (consulte a Tabela de Materiais) no centro do wafer. Tente evitar bolhas de ar, pois elas podem interferir no processo de impressão a jusante do wafer.
  3. Para obter uma camada fotorresistente de 10 μm de espessura, spin-coat o wafer a 500 rpm por 30 s com uma aceleração de 100 rpm/s para espalhamento inicial, seguido por um giro de 60 s a 3.000 rpm com uma aceleração de 500 rpm/s. Caso se deseje uma espessura diferente, altere os parâmetros de fiação de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Asse a bolacha numa placa de aquecimento durante 2 min a 65 °C e depois durante 5 min a 95 °C.
  5. Assim que o wafer esfriar, monte o wafer na câmara de impressão da máquina de litografia óptica de gravação direta (consulte Tabela de Materiais) e alimente o projeto OLA (Figura 2A, Arquivo de codificação suplementar 1) no software.
    NOTA: O projeto OLA consiste essencialmente em dois canais OA, dois canais LO e um canal IA, que se fundem para formar uma junção de seis vias que continua como um canal de pós-produção e termina no poço experimental (EW).
  6. Imprima o(s) design(s) OLA no(s) wafer revestido(s) utilizando um laser UV (ver Tabela de Materiais) com uma dose de 300 mJ/cm2.
  7. Uma vez impresso o desenho, asse o wafer a 65 °C por 1 min, seguido de 95 °C por 3 min.
  8. Neste ponto, certifique-se de que o contorno do dispositivo impresso aparece na bolacha e é visível a olho nu. Para lavar o fotorresiste não curado, mergulhe o wafer em um copo de vidro contendo a solução reveladora (consulte a Tabela de Materiais) até que o fotorresiste não curado seja totalmente removido.
    Observação : excesso de tratamento do desenvolvedor pode afetar a resolução do design.
  9. Lave o wafer com acetona, isopropanol e água deionizada (DI) em sequência e, finalmente, com ar pressurizado/N2 usando uma pistola.
  10. Asse o wafer a 150 °C por 30 min para garantir que o design impresso esteja firmemente preso à superfície do wafer e não saia no processo de fabricação a jusante. O wafer mestre está então pronto para uso posterior (Figura 2B).

2. Preparação do dispositivo microfluídico

  1. Coloque o wafer mestre sobre um pedaço quadrado de alumínio e envolva a folha de alumínio ao redor do wafer, formando uma estrutura bem parecida (Figura 2C).
  2. Meça 40 g de polidimetilsiloxano (PDMS) e 4 g de agente de cura (10:1, relação de peso, ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 50 mL e misture vigorosamente usando uma espátula ou uma ponta de pipeta por 2-3 min.
  3. A mistura vigorosa do PDMS e do agente de cura aprisiona bolhas de ar dentro da mistura. Gire o tubo a 100 x g por 2-3 min para remover a maioria das grandes bolhas de ar.
  4. Deite cerca de 15-20 g da mistura preparada na etapa 2.3 sobre o wafer principal e desgaseifique utilizando um dessecador. Guarde o excesso de mistura para fazer lâminas de vidro revestidas com PDMS (passo 3).
  5. Incubar o conjunto num forno a 70 °C durante, pelo menos, 2 horas.
  6. Retire a bolacha mestra do forno e deixe esfriar. Para remover o bloco PDMS solidificado, remova a folha de alumínio e descasque cuidadosamente o bloco PDMS da borda do wafer.
    NOTA: O wafer é frágil e pode quebrar, por isso é importante fazer esse processo com cuidado.
  7. Uma vez removido o bloco de PDMS, mantenha a estrutura padronizada voltada para cima e, usando uma lâmina afiada ou um bisturi, corte blocos PDMS individuais, cada um contendo um único dispositivo microfluídico.
  8. Coloque o bloco PDMS em uma superfície escura e ajuste a direção da luz (uma lâmpada de mesa é útil para isso) para que os canais gravados sejam brilhantes e, como resultado, visíveis. Faça furos nas entradas e no canal de saída usando punções de biópsia de 0,5 mm e 3 mm de diâmetro (ver Tabela de Materiais), respectivamente.
    NOTA: Use um punção de biópsia afiado para evitar rachaduras no PDMS, que podem causar vazamento mais tarde. Empurre suavemente o punção de biópsia através do bloco PDMS e certifique-se de que ele passe completamente por ele. Para remover o punch da biópsia, retraia-o suavemente enquanto o gira em direções alternativas. O bloco PDMS com o design OLA gravado agora está pronto para se ligar a uma lâmina de vidro revestida por PDMS.

3. Fazendo a lâmina de vidro revestida com PDMS

  1. Pegue uma lamínula de vidro transparente, despeje aproximadamente 0,5 mL de PDMS (preparado em excesso na etapa 2.4) no centro da lâmina de vidro e espalhe-a por toda a lamínula inclinando suavemente a lâmina de vidro, garantindo a cobertura total da lâmina de vidro com PDMS.
  2. Monte a lâmina de vidro no revestidor de spin, certifique-se de sua posição central (de modo que o meio da lâmina se sobreponha ao centro do eixo de pressão) e gire a lâmina de vidro a 500 rpm por 15 s (a um incremento de 100 rpm/s) e depois a 1.000 rpm por 30 s (a um incremento de 500 rpm/s).
  3. Coloque a lâmina de vidro revestida com PDMS (lado revestido voltado para cima) em uma plataforma elevada como um bloco de PDMS (1 cm x 1 cm) em uma placa de Petri coberta e asse a 70 °C por 2 h.

4. Colagem do dispositivo microfluídico

  1. Limpe o bloco PDMS (preparado na etapa 2) colando e removendo a fita adesiva disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) duas vezes. Certifique-se de manter o lado limpo virado para cima até o uso.
  2. Limpe a lâmina de vidro revestida com PDMS com ar/N2 pressurizado usando uma pistola de sopro e mantenha o lado limpo voltado para cima.
  3. Coloque o bloco PDMS (canais gravados virados para cima) e a lâmina de vidro revestida com PDMS (lado revestido virado para cima) na câmara de vácuo do limpador de plasma (ver Tabela de Materiais).
  4. Ligue o vácuo e exponha o conteúdo ao plasma de ar a uma frequência de rádio de 12 MHz (modo RF alto) por 15 s para ativar as superfícies. O plasma de oxigênio pode ser visto na forma de uma tonalidade rosada.
  5. Imediatamente após o tratamento com plasma, coloque a lâmina de vidro revestida com PDMS em uma superfície limpa com o lado PDMS voltado para cima. Coloque suavemente o bloco PDMS com o padrão microfluídico agora voltado para a lâmina de vidro revestida com PDMS, permitindo que eles se unam (Figura 2D).
    NOTA: A remoção do ar preso no dispositivo é crucial para garantir a colagem completa.
  6. Asse os dispositivos colados a 70 °C durante 2 horas.

5. Funcionalização superficial do dispositivo microfluídico

NOTA: Antes da funcionalização da superfície, é importante calibrar a bomba de pressão de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) e montar a tubulação para conectá-la ao dispositivo microfluídico.

  1. Conectando o dispositivo microfluídico às bombas de pressão
    1. Conecte o controlador de fluxo acionado por pressão a uma fonte de pressão externa (até 6 bares). Pelo menos quatro canais de pressão de ar independentes são necessários: três módulos individuais de 0-2 bar e um módulo de -0,9-4 bar.
    2. Calibrar a bomba de pressão de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    3. Corte a tubulação (1/16 em OD x 0,02 em ID) em quatro peças de tamanho igual com aproximadamente 20 cm de comprimento.
    4. Insira conectores dobrados de 90° em aço inoxidável de 23 G (consulte a Tabela de Materiais) em uma extremidade de cada peça. Esta extremidade é posteriormente inserida nas três entradas (OA, LO e IA) do dispositivo microfluídico e a quarta é usada para remover o excesso de solução (passo 5.2.5).
    5. Insira a outra extremidade da tubulação no suporte do reservatório microfluídico e sela-a usando conexões microfluídicas, garantindo que a tubulação seja longa o suficiente para tocar o fundo do reservatório (tubos de 1,5 mL, consulte Tabela de Materiais). Isso evita que bolhas de ar indesejadas entrem no dispositivo microfluídico durante o tratamento PVA/produção de lipossomas.
  2. Tratamento PVA do canal de saída
    NOTA: Antes da geração de lipossomas, é crucial tornar o dispositivo parcialmente hidrofílico a jusante da junção de produção. Isso é feito tratando esses canais com solução de álcool polivinílico (PVA) a 5% (p/v). A solução de PVA é preparada dissolvendo o pó de PVA (ver Tabela de Materiais) em água a 80 °C durante 3 h com agitação constante utilizando um agitador magnético. Filtrar a solução antes de a utilizar para tratamento de superfície. Imediatamente após a ligação do dispositivo, os canais microfluídicos são hidrofílicos devido à ativação superficial induzida pelo plasma, e gradualmente se tornarão hidrofóbicos novamente. Recomenda-se aguardar 2 h após o cozimento (passo 4.6) antes de iniciar o tratamento com PVA.
    1. Distribuir 200 μL de solução de PVA a 5% p/v em um tubo de 1,5 mL e conectá-lo ao suporte do reservatório microfluídico. Introduzir o tubo (o mencionado no passo 5.1.3) de modo a que uma extremidade fique submersa na solução de PVA e a outra extremidade seja ligada à entrada do canal OA do dispositivo microfluídico.
      NOTA: Uma concentração mais baixa de PVA pode levar à funcionalização superficial abaixo do padrão.
    2. Repita o passo acima sem PVA (tubo vazio de 1,5 mL) e conecte-o aos canais LO e IA.
    3. Aumentar a pressão da fase OA para 100 mbar para escoar a solução de PVA nos canais OA. Aumentar as pressões das fases IA e LO para 120 mbar para evitar o refluxo da solução de PVA no interior desses canais (Figura 2E).
      NOTA: Se necessário, ajuste as pressões dos canais individuais para manter o menisco estável na junção de produção.
    4. Escoar a solução de PVA desta forma por aproximadamente 5 min, garantindo a completa funcionalização do canal de saída.
    5. Para remover a solução de PVA, retire a tubulação da entrada OA e aumente imediatamente a pressão nos canais LO e IA para 2 bar. Simultaneamente, use uma tubulação conectada a um canal de pressão negativa (−900 mbar) para remover o excesso de PVA primeiro do canal de saída e depois da entrada do AA (Figura 2F).
    6. Asse o aparelho a 120 °C por 15 min e deixe esfriar antes de usar. O dispositivo pode ser armazenado em condições ambientais por pelo menos 1 mês.
      NOTA: Recomenda-se aguardar 1 dia (à temperatura ambiente) antes de prosseguir com OLA para garantir que o PDMS não tratado recupere sua hidrofobicidade após o tratamento com plasma.

6. Montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA)

  1. Preparo do estoque lipídico
    NOTA: Aqui, uma mistura de 1,2-dioloil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) (Liss Rhod PE) lipídios (ver Tabela de Materiais) são usados como exemplo; Os usuários devem preparar a composição lipídica que precisam de maneira semelhante.
    1. Distribuir 76 μL de DOPC (25 mg/mL) e 16,6 μL de Liss Rhod PE (1 mg/mL) em um balão de fundo redondo usando seringas de vidro separadas.
    2. Mantenha o balão de fundo redondo na posição vertical e utilize uma pistola N2 comprimida para dar um fluxo suave de azoto para evaporar o clorofórmio e formar uma película lipídica seca no fundo do frasco.
    3. Colocar o balão no exsicador durante, pelo menos, 2 h sob vácuo contínuo para remover qualquer clorofórmio remanescente.
    4. Adicionar 100 μL de etanol no balão de fundo redondo, seguido de pipetagem suave ou agitação para garantir que os lípidos são dissolvidos para formar um stock lipídico de 10% (p/v).
      NOTA: Caso uma determinada composição lipídica não seja completamente solúvel em etanol, use uma mistura etanol/clorofórmio, mantendo o volume de clorofórmio o menor possível.
    5. Pipetar a solução para um frasco para injetáveis de vidro escuro. Lave suavemente o frasco para injetáveis com azoto utilizando uma pistola de sopro para substituir o ar por uma atmosfera inerte. Sele a tampa com película de parafina e armazene a -20 °C.
      NOTA: A solução estoque pode ser usada por até alguns meses. Cada vez que o frasco para injetáveis for aberto, substitua suavemente o ar por azoto e volte a selar com tampa com película de parafina.
  2. Preparando as soluções OLA
    1. Faça estoque de soluções dos componentes indispensáveis: dextran 20 mM (Mw 6.000); glicerol 60% (v/v); um buffer de escolha. Neste caso, 5x solução salina tamponada com fosfato (NaCl 0,68 M, KCl 13,5 mM, 50 mM Na 2 HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH 7,4) foi preparada (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Como o glicerol puro é altamente viscoso, recomenda-se cortar um pequeno pedaço no final da ponta da pipeta de forma inclinada para uma pipetagem eficaz.
    2. Preparar 100 μL de amostras de IA, OA e solução de saída (ES, a solução desejada para encher o EW). Para facilitar a visualização, proteína fluorescente amarela (YFP) foi adicionada à solução IA neste caso em particular. Verificar o equilíbrio osmótico entre o IA e os AO, calculando a osmolaridade dos componentes encapsulados e adicionando uma quantidade adequada de açúcar ou sal no AO, se necessário. Isso é feito para evitar o estouro ou encolhimento dos lipossomas durante a produção.
      OBS: As composições finais das três fases são as seguintes:
      IA: 15% glicerol, 5 mM dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glicerol, 5% surfactante F68, 1x PBS
      ES: 15% glicerol, 1x PBS
      Uma menor concentração de surfactante F68 afeta negativamente a geração de emulsões duplas.
    3. Preparar 80 μL da fase LO pipetando 4 μL de lípido reserva em 76 μL de 1-octanol (ver Tabela de Materiais). A concentração final de DOPC é de 5 mg/mL.
    4. Centrifugar as amostras a 700 x g por 60 s para remover quaisquer agregados grandes antes de prosseguir com os experimentos microfluídicos. Isso evita que quaisquer fatores de entupimento óbvios entrem no chip microfluídico.
  3. Produção de lipossomas
    1. Distribuir as soluções (IA, LO, OA) em três tubos de 1,5 ml, montá-las (conforme mencionado no passo 5.1) e ligá-las ao chip microfluídico tratado com PVA (passo 5.2.6).
    2. Aplique uma pressão positiva nos três canais: ~100 mbar nos canais IA e LO e ~200 mbar no canal OA.
      NOTA: Como a pressão do AA é maior que as demais, a solução do AA será a primeira a chegar ao EW; isso é altamente recomendado.
    3. Quando a solução de OA atingir EW, diminua a pressão de OA para 100 mbar e aumente o LO para 200 mbar.  A solução LO que chega à junção de produção provavelmente resultará em bolhas de ar por causa do deslocamento de ar dos canais de LO. Uma vez que as bolhas de ar são dispensadas no EW, ajuste a pressão do LO para 100 mbar. Por fim, aumente a pressão IA para 200 mbar e aguarde até que todo o ar no canal IA seja removido. A sequência ideal de chegada à junção das três fases é, portanto, OA, LO e IA.
    4. Depois de remover o ar dos três canais, ajuste todas as pressões do canal para 50 mbar e pipete 10 μL de ES para a câmara de saída. Após pipetar o ES, coloque uma tampa deslizante no orifício de saída para evitar a evaporação. Caso o LO seja empurrado para trás, aumente gradualmente a pressão do LO em incrementos de 1 mbar até que ele comece a fluir para a junção.
    5. Uma vez que todas as três fases comecem a cofluir na junção, assegure-se do início da produção de emulsão dupla e ajuste de acordo com sua qualidade (Figura 3A-C). Mude as pressões gradualmente (passos de 0,1-1 mbar) em vez de abruptamente, a menos que a pressão esteja sendo alterada para eliminar um entupimento indesejado no canal.
      NOTA: Os canais a ajustar dependem do que está acontecendo na junção. Por exemplo, o IA precisa ser diminuído se as emulsões forem muito grandes; o AA precisa ser aumentado se emulsões duplas se formarem, mas estourarem em vez de serem beliscadas; e o LO precisa ser diminuído se a bolsa de octanol for muito grande.
    6. Verifique se as gotículas de emulsão dupla fluem a jusante para EW. À medida que fluem, as bolsas de octanol tornam-se cada vez mais proeminentes e, finalmente, são pinçadas, formando lipossomas (Figura 3D-F). Certifique-se de que o canal de pós-produção seja longo o suficiente e que a migração das emulsões duplas seja lenta o suficiente para a desumectação.
      NOTA: Dentro de minutos após a produção decente, lipossomas e gotículas de octanol sairão do canal de pós-produção e irão para o EW. Como resultado, sendo menos densas que a água, as gotículas octanol flutuam até a superfície do ES. Devido à adição de dextran no IA, os lipossomas são mais pesados que seus arredores e vão para o fundo da câmara prontos para observação e posterior manipulação.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo demonstra a formação de condensados sem membrana através do processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas como um experimento representativo.

Preparo da amostra
O IA, OA, ES e a solução de alimentação (FS) são preparados da seguinte forma:

IA: glicerol a 12%, dextrana 5 mM, KCl 150 mM, poli-L-lisina (PLL) a 5 mg/mL, poli-L-lisina-FITC marcada com 0,05 mg/mL (PLL-FITC), trifosfato de adenosina (ATP) 8 mM, citrato-HCl 15 mM (pH 4)

OA: 12% v/v glicerol, 5% p/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

ES: 12% glicerol, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

FS: 12% glicerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Formação de condensado no interior de lipossomas
Um ensaio simples de coacervação complexa sensível ao pH de poli-L-lisina (PLL) com carga positiva e trifosfato de adenosina multivalente (ATP) negativamente carregado foi selecionado para demonstrar os fenômenos de LLPS em lipossomas. Para evitar a separação de fases de polilisina e ATP durante o encapsulamento, o pH da solução foi mantido em 4, no qual o ATP é neutro. O aumento do pH da ES pela adição de FS (um tampão de pH 9) acabou aumentando o pH no interior dos lipossomas devido ao fluxo de prótons transmembrana, tornando o ATP carregado negativamente e desencadeando sua separação de fases com PLL21 carregado positivamente (Figura 4A). Após cerca de 2 h da geração do lipossoma, as pressões IA e LO foram desligadas. A pressão do canal de OA foi mantida em 100 mbar para fluir lentamente os lipossomas restantes para a câmara de observação. Uma vez que todos os lipossomas no canal foram recuperados no EW, as pressões foram desligadas para parar o fluxo e impedir que os lipossomas se movessem. Os lipossomas gerados em pH mais baixo apresentaram fluorescência homogênea (da fluorescente encapsulada PLL-FITC) em seu lúmen (Figura 4B,D). As gotículas de octanol que flutuavam na superfície foram removidas pipetando cuidadosamente 5 μL de solução do topo para evitar que afetassem as etapas de pipetagem posteriores. Posteriormente, 10 μL de tampão FS foram adicionados ao EW, o que induziu a separação de fases do PLL e ATP encapsulados. A fluorescência homogênea do FITC de cada lipossomo gradualmente se transformou em gotículas de condensado fluorescente distintas. Eventualmente, as gotículas individuais se fundiram em uma gota maior de condensado que se difundiu livremente dentro dos lipossomas (Figura 4C,E-G).

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Figura 1: Esquema mostrando a montagem e funcionamento do OLA. O controlador de pressão é conectado aos reservatórios contendo soluções aquosas externas, lipídios em octanol e soluções aquosas internas. Os tubos inseridos nos reservatórios são conectados às respectivas entradas do dispositivo OLA. Fluxos apropriados nos três canais levam à formação de emulsões duplas água-em-(lipídio-em-octanol)-em-água. As emulsões duplas formadas migram para o poço de saída, durante o qual as bolsas octanol se desprendem para formar lipossomas. Os lipossomas formados são coletados no fundo do poço para visualização e posterior experimentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Preparação do chip OLA (fotolitografia, microfabricação, tratamento de superfície). (A) Design digital mostrando as principais características do projeto OLA, incluindo três entradas, uma tomada e uma junção de produção de seis vias. (B) Um esquema do wafer mestre mostrando vários desenhos OLA produzidos usando litografia UV. (C) Um elastômero PDMS fundido no wafer mestre, colocado em um poço criado a partir de papel alumínio, e curado por cozimento a 70 °C por 2 h. (D) Um dispositivo microfluídico ligado usando tratamento de plasma de oxigênio, onde o bloco PDMS contendo o projeto OLA é anexado a uma lâmina de vidro revestida de PDMS. (E) Funcionalização superficial do cavaco fabricado para tornar o dispositivo parcialmente hidrofílico. Isso é feito fluindo 5% w/v PVA por 5 min do canal aquoso externo em direção ao canal de saída. A pressão positiva do ar nos outros canais impede que a solução de PVA entre nesses canais. (F) O PVA é removido através da aplicação de um vácuo no canal de saída. O dispositivo é assado a 120 °C por 15 min e, em seguida, está pronto para uso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Demonstração de OLA produzindo eficientemente emulsões duplas monodispersas e eventualmente lipossomas com excelente encapsulamento. (A) Imagem de campo brilhante mostrando rápida geração de gotículas de emulsão dupla. (B) O canal lipídico fluorescente mostra a formação de uma bolsa de octanol devido à desidratação parcial. A fase lipídio-em-octanol continha uma mistura de DOPC (5 mg/mL) e Lis Rhod PE na proporção de 1.000:1. (C) O canal aquoso interno mostrando encapsulamento de proteína fluorescente amarela (YFP). As inserções em (A-C) mostram vistas representativas ampliadas dos respectivos painéis (barras de escala = 10 μm). (D-F) Desumectação da bolsa de octanol no canal de saída, que forma um lipossoma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Separação de fase líquido-líquido desencadeada pelo pH da pLL/ATP dentro dos lipossomas. (A) Esquema da transição pH-dependente da solução homogênea de pLL e ATP encapsulada no lipossomo (esquerda) para coacervados pLL/ATP separados por fase (direita). O ambiente ácido inicial no lipossoma torna a carga molecular do ATP neutra, inibindo a coacervação. Quando o pH dentro dos lipossomas se equilibra com o aumento do pH aplicado externamente, o ATP ganha uma carga negativa, desencadeando a coacervação. (B-C) Gráficos de linhas (correspondentes às linhas pontilhadas nos painéis [D] e [G], respectivamente) mostrando a distribuição espacial do pLL (canal verde) e da membrana (canal vermelho). (D-G) Imagens de lapso de tempo mostrando a formação de coacervados pLL/ATP dentro dos lipossomas. A adição externa de um tampão básico eleva o nível de pH dentro dos lipossomas ao longo de minutos e inicia a coacervação. t = 0 min refere-se ao tempo imediatamente anterior à ocorrência do primeiro evento de coacervação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo CAD do projeto OLA. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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A complexidade celular torna extremamente difícil entender as células vivas quando estudadas como um todo. Reduzir a redundância e a interconectividade das células por meio da reconstituição in vitro dos componentes-chave é necessário para aprofundar o entendimento dos sistemas biológicos e criar mímica celular artificial para aplicações biotecnológicas22,23,24. Os lipossomas servem como um excelente sistema mínimo para entender os fenômenos celulares. Uma lista não exaustiva desses fenômenos inclui a dinâmica do citoesqueleto e as deformações de membrana resultantes 25,26, regulação espaço-temporal de condensados biomoleculares 27,28 e sua interação com a membrana 29, encapsulamento de uma ampla variedade de biomoléculas, incluindo sistemas de transcrição e tradução livres de células 30, síntese lipídica livre de células 31 e evolução de proteínas 32,33,34. Os lipossomas também têm sido amplamente utilizados como carreadores para liberação de fármacos e foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e European Medicines Agency (EMA) para uso clínico11. Lipossomas e nanopartículas à base de lipídios são usados como transportadores para a entrega de drogas, incluindo vacinas de mRNA como a recente vacina COVID-1935.

Este estudo descreve um protocolo detalhado de fotolitografia, montagem microfluídica e funcionalização de superfície para a realização da técnica OLA para geração de lipossomas on-chip (Figura 1 e Figura 3). Os lipossomas produzidos com OLA são monodispersos (coeficiente de variação: 4%-11% da média) e na faixa biológica de tamanho celular (tipicamente entre 5-50 μm de diâmetro), podendo ser sintonizados utilizando-se velocidades de fluxo adequadas dos canais aquosos interno e externo36. Por exemplo, a população de lipossomas vista na Figura 1 tem uma distribuição de tamanho de 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Com taxas de produção típicas de 10-30 Hz, os lipossomas formados são unilamelares, como foi previamente confirmado pela inserção de uma única proteína transmembrana bicamada específica, a alfa-hemolisina36, na membrana, bem como pelo uso do ensaio de clareamento ditionato37. OLA também é compatível com uma grande variedade de composições lipídicas, oferecendo ao usuário flexibilidade na escolha de lipídios. É importante ressaltar que a composição lipídica inicialmente utilizada reflete-se na composição final dos lipossomas38.

Sendo uma tecnologia relativamente nova, há ainda espaço para melhorar o OLA. Por exemplo, a funcionalização da superfície usando PVA é crucial, mas tediosa de executar. Uma maneira mais fácil e simples de funcionalizar a superfície do dispositivo reduziria significativamente o tempo de fabricação do chip, bem como a variabilidade de chip para chip. O tensoativo Plurônico F68 é um componente importante na fase aquosa externa para estabilizar inicialmente as emulsões duplas; no entanto, seu uso pode ser restritivo em certos casos. A substituição do Pluronic F68 por um surfactante mais biocompatível ou a remoção completa do surfactante pode melhorar a versatilidade do sistema. Durante a migração das emulsões duplas geradas no canal de saída, elas podem estourar devido ao cisalhamento. Atualizar o design OLA para melhorar a estabilidade da emulsão dupla e a separação do bolso octanol poderia, assim, aumentar o rendimento. No entanto, o OLA tem várias vantagens, que incluem principalmente o encapsulamento eficiente, lipossomas monodispersos e unilamelares e experimentação controlada em chips.

O OLA tem sido empregado e adaptado em diversos estudos, incluindo crescimento e divisão de lipossomas39, estudo do processo de separação de fase líquido-líquido27 e sua interação com a membrana21 e compreensão da formação de bioprodutos de crescimento bacteriano em lipossomas40. Ensaios de alto rendimento baseados em OLA também estão sendo usados para entender o transporte de íons através da membrana41 e a permeabilidade do fármaco através da bicamada lipídica37, como um sistema de liberação de fármacos para fins terapêuticos 42, para estudar o efeito de antimicrobianos na membrana 43 e como uma ferramenta para encapsular cristais líquidos 44. Além da ampla gama de aplicações da tecnologia OLA, versões modificadas do OLA adequadas para fins específicos estão sendo desenvolvidas 45,46,47,48,49,50. No geral, considerando os prós e contras, acreditamos fortemente que o OLA é uma plataforma versátil para a biologia sintética.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a Dolf Weijers, Vera Gorelova e Mark Roosjen por gentilmente nos fornecerem YFP. S.D. reconhece o apoio financeiro do Conselho Holandês de Pesquisa (número da bolsa: OCENW. KLEIN.465).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
tubos de 1,5 mLFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Tubos de microcentrífuga de polipropileno
ATPSigma-AldrichNo. A2383
Punção de biópsiaDarwin microfluídicaPT-T983-050,5 mm e 3 mm
de diâmetro Sigma-Aldrich à base de citratoNo. 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
Máquina de litografia óptica de escrita diretaDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3Configuração e software
DOPC lipídioAvanti SKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Lamínula de cobertura de vidroCorning#1, 24 x 40 mm
GlicerolSigma-AldrichNo. G2025
Ácido clorídricoThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Lipídio Liss Rhod PEAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist desenvolvedormicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Limpador de plasmaHarrick plasmaPDC-32G
PolidimetilsiloxanoDowSylgard 184PDMS e agente de cura
Poli-L-lisinaSigma-AldrichNo. P7890
Poli-L-lisina– Rotulado FITCSigma-AldrichNo. P3543
Álcool polivinílicoSigma-Aldrichno. P8136peso molecular 30,000- ndash; 70.000, 87%– Controlador de pressão hidrolisado 90%
Elveflow OBK1 Mk3+Controlador de fluxo
Fita adesiva Fitamágica Fita
Bolacha de silícioMateriais de silício0620R16002
Revestidor de rotação Laurell Technologies CorporationModelo WS-650MZ-23NPP
Aço Inoxidável 90° Acopladores PDMS DobradosDarwin microfluídicaPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tubulação TygonDarwin microfluídica1/16" OD x 0.02" ID
UV laser Comprimento de onda de 365 nm
para bebêsfosca invisível

Referências

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