ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Resumo

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

Resumo

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é uma técnica robusta que permite o perfil de acessibilidade da cromatina em todo o genoma. Esta técnica tem sido útil para a compreensão dos mecanismos regulatórios da expressão gênica em uma variedade de processos biológicos. Embora o ATAC-seq tenha sido modificado para diferentes tipos de amostras, não houve modificações efetivas dos métodos ATAC-seq para o tecido adiposo. Os desafios com o tecido adiposo incluem a complexa heterogeneidade celular, grande conteúdo lipídico e alta contaminação mitocondrial. Para superar esses problemas, desenvolvemos um protocolo que permite ATAC-seq específico de adipócitos empregando a classificação de núcleo ativado por fluorescência com tecidos adiposos do camundongo transgênico Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produz dados de alta qualidade com leituras de sequenciamento desperdiçadas mínimas, reduzindo a quantidade de entrada de núcleo e reagentes. Este artigo fornece instruções detalhadas passo a passo para o método ATAC-seq validado para o uso de núcleos de adipócitos isolados de tecidos adiposos de camundongos. Este protocolo auxiliará na investigação da dinâmica da cromatina em adipócitos após diversos estímulos biológicos, o que permitirá novos insights biológicos.

Introdução

O tecido adiposo, que é especializado para armazenar o excesso de energia na forma de moléculas lipídicas, é um órgão chave para a regulação metabólica. O controle rigoroso da formação e manutenção dos adipócitos é vital para a função do tecido adiposo e para a homeostase energética de todo o corpo¹. Muitos reguladores transcricionais desempenham um papel crítico no controle da diferenciação, plasticidade e função dos adipócitos; Alguns desses reguladores estão implicados em distúrbios metabólicos em humanos ^2,3. Avanços recentes em técnicas de sequenciamento de alto rendimento para expressão gênica e análise epigenômica têm facilitado ainda mais a descoberta dos reguladores moleculares da biologia dos adipócitos⁴. Estudos de perfis moleculares utilizando tecidos adiposos são desafiadores devido à heterogeneidade desses tecidos. O tecido adiposo é constituído principalmente por adipócitos, responsáveis pelo armazenamento de gordura, mas também contém vários outros tipos celulares, como fibroblastos, células endoteliais e células imunes⁵. Além disso, a composição celular do tecido adiposo é drasticamente alterada em resposta a mudanças fisiopatológicas, como temperatura^{e estado} nutricional6. Para superar esses problemas, desenvolvemos previamente um camundongo repórter transgênico, denominado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produz ribossomos marcados com GFP e núcleos biotinilados marcados com mCherry de maneira dependente de Cre recombinase⁷. O sistema de marcação dupla permite realizar análises transcriptômicas e epigenômicas específicas do tipo celular com tecidos. Usando camundongos NuTRAP cruzados com linhagens adiponectina-Cre específicas de adipócitos (Adipoq-NuTRAP), caracterizamos previamente perfis de expressão gênica e estados de cromatina de populações de adipócitos puros in vivo e determinamos como eles são alterados durante a obesidade ^7,8. Anteriormente, camundongos NuTRAP cruzados com linhagens Ucp1-Cre específicas de adipócitos marrom e bege (Ucp1-NuTRAP) permitiram caracterizar o remodelamento epigenômico da rara população termogênica de adipócitos, adipócitos bege, em resposta a mudanças de temperatura⁹.

ATAC-seq é um método analítico amplamente utilizado para avaliar a acessibilidade da cromatina em todo o genoma. A transposase hiper-reativa Tn5 utilizada no ATAC-seq permite a identificação de regiões abertas da cromatina por meio da marcação de adaptadores de sequenciamento na região acessível à cromatina dos núcleos¹⁰. ATAC-seq é um método simples, mas fornece resultados robustos e é altamente eficiente mesmo com amostras de baixa entrada. Tornou-se, assim, um dos métodos de perfil epigenômico mais populares e tem contribuído para o entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão gênica em diversos contextos biológicos. Desde que o protocolo ATAC-seq original foi criado, várias técnicas derivadas do ATAC-seq foram desenvolvidas para modificar e otimizar o protocolo para vários tipos de amostras. Por exemplo, o Fast-ATAC é projetado para analisar amostras de células sanguíneas¹¹, o Omni-ATAC é um protocolo otimizado para amostras de tecido congelado 12 e o MiniATAC-seq é eficaz para análise embrionária em estágio inicial¹³. Entretanto, a aplicação do método ATAC-seq aos adipócitos, especialmente a partir de amostras de tecido, ainda é um desafio. Além da heterogeneidade do tecido adiposo, seu alto conteúdo lipídico pode interferir em reações eficientes de recombinação pela transposase Tn5 mesmo após o isolamento do núcleo. Além disso, o alto conteúdo mitocondrial em adipócitos, particularmente em adipócitos marrons e bege, causa alta contaminação do DNA mitocondrial e leituras de sequenciamento desperdiçadas. Este trabalho descreve um protocolo para ATAC-seq específico para adipócitos usando camundongos Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Aproveitando a classificação de núcleos marcados com fluorescência, este protocolo permite a coleta de populações puras de núcleos de adipócitos longe de outros tipos de células de confusão e a remoção eficiente de lipídios, mitocôndrias e debris teciduais. Assim, este protocolo pode gerar dados de alta qualidade específicos do tipo celular e minimizar o desperdício de leituras mitocondriais enquanto usa uma quantidade reduzida de entrada e reagentes em comparação com o protocolo padrão.

Protocolo

Os cuidados e experimentação com animais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana.

1. Preparações antes do início da experiência

1. Preparo de tecidos
   1. Para a marcação do núcleo do adipócito, cruze camundongos NuTRAP com linhagens de adiponectina-Cre específicas de adipócitos (Adipoq-Cre) para gerar camundongos Adipoq-NuTRAP, que são hemizigotos para Adipoq-Cre e NuTRAP.
   2. Dissecar os tecidos adiposos de interesse dos camundongos Adipoq-NuTRAP conforme descrito anteriormente¹⁴.
   3. Congelar rapidamente os tecidos em azoto líquido e armazená-los a -80 °C até à utilização.
      NOTA: Cada coxim de gordura pode ser armazenado como um todo, e os tecidos congelados podem ser posteriormente cortados em gelo seco em pedaços menores (~50 mg) para experimentos. Alternativamente, os tecidos adiposos podem ser cortados, alíquotas e congelados em tubos para armazenamento (~50 mg por tubo). As amostras congeladas nunca podem descongelar após congelamento até à utilização.
2. Preparação do tampão
   NOTA: Mantenha os buffers no gelo durante todo o experimento.
   1. Preparar tampão de preparação de núcleo (NPB): 250 mM de sacarose, 10 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl₂ e 0,1% de NP40. Preparar 7 mL de NPB por amostra. Adicionar 100x coquetel inibidor de protease fresco (final 1x), TDT (final 1 mM) e Hoechst (final 1 μg/mL) ao NPB antes de usar.
      NOTA: Recomenda-se preparar NPB fresco, mas pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.
   2. Preparar 1x solução salina tamponada com fosfato com NP-40 a 0,1% (PBS-N).

2. Isolamento do núcleo

1. Homogeneizadores Chill glass Dounce, com um Dounce de vidro por amostra, sobre gelo. Em seguida, adicione 7 mL da mistura de NPB a cada Dounce de vidro.
   OBS: Recomenda-se utilizar até oito amostras em cada experimento. Trabalhar com mais de oito amostras atrasaria significativamente todas as etapas, e pode especialmente diminuir a qualidade do núcleo durante a triagem.
2. Coloque o tecido adiposo congelado (50-100 mg) no vidro e corte-o imediatamente em alguns pedaços menores usando uma tesoura longa. Derrame 10x com um pilão solto para todas as amostras e, em seguida, 10x com um pilão apertado.
   NOTA: Os tecidos adiposos são macios, então cortá-los em alguns pedaços pequenos deve ser suficiente. Para amostras raras, pedaços menores (10-20 mg) podem ser usados, embora o número de núcleos dos adipócitos coletados possa variar.
3. Filtrar através de um filtro de 100 μm para um novo tubo de 50 ml. Mover os homogeneizados filtrados para um novo tubo de 15 mL derramando. Gire a 200 × g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de balde oscilante. Remova o sobrenadante tanto quanto possível.
   NOTA: Aspirar primeiro usando um vácuo e, em seguida, remover o volume restante usando uma micropipeta.
4. Ressuspenda o pellet em 500 μL de PBS-N por meio de um toque suave, mas completo, com os dedos.
   NOTA: Evite pipetagem, pois isso pode danificar os núcleos.
5. Filtrar através de um filtro de 40 μm para um novo tubo de 50 mL usando pipetagem suave. Enxaguar o filtro com 250 μL de PBS-N. Transfira a ressuspensão nuclear filtrada para um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usando uma micropipeta.
   NOTA: Se disponíveis, tubos e filtros de células podem ser usados para volumes menores para minimizar a perda de amostra.

3. Classificação do núcleo

1. Preparo do tubo de coleta
   1. Adicionar 500 μL de PBS-N a novos tubos de 1,5 mL e inverter algumas vezes para molhar todas as superfícies internas com o tampão.
   2. Gire brevemente os tubos para derrubar todo o líquido e, em seguida, resfrie-os no gelo até a classificação.
2. FACS (Figura 2)
   1. Use o gating FSC-A/FSC-H para singlets e FSC-A/SSC-A para remoção de detritos pequenos ou grandes.
   2. Portão para a população do núcleo adipócito mCherry/GFP-positivo.
   3. Coletar 10.000 núcleos em cada um dos tubos de coleta preparados na etapa 3.1.
3. Preparação do núcleo pós-triagem
   1. Adicionar 500 μL de PBS-N a cada tubo de coleta e inverter algumas vezes para misturar.
   2. Gire os tubos de coleta a 200 × g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de balde oscilante. Remova completamente o sobrenadante.
      NOTA: Use um vácuo primeiro para remover bolhas, despeje o sobrenadante e use lenços de papel para remover o líquido restante completamente. A pelota é invisível neste ponto. Prepare a mistura mestre de Tn5 durante a etapa de centrifugação, conforme descrito abaixo.

4. Marcação Tn5 (Tabela 1)

1. Para preparar 25 μL de mistura mestre de Tn5, misturar 12,5 μL de tampão de DNA de marcação 2x (tampão TD), 1,25 μL de transposase Tn5 (enzima TDE I) e 11,25 μL de água livre de nucleases.
2. Adicionar 25 μL de mistura mestra de Tn5 a cada pastilha de núcleo e ressuspender por pipetagem suave. Incubar a 600 rpm durante 30 min a 37 °C utilizando um misturador de termomisturadores.

5. Purificação do DNA

NOTA: O procedimento a seguir usa o kit de purificação PCR mencionado na Tabela de Materiais. Quaisquer outros métodos semelhantes de purificação de DNA podem ser usados.

1. Adicionar 25 μL de água isenta de nucleases aos 25 μL da mistura de ressuspensão do núcleo Tn5 obtida após o passo 4.2. O volume final é de 50 μL por amostra.
2. Adicionar 250 μL de tampão PB.
3. Adicionar 5 μL de acetato de sódio 3 M (NaOAc) (pH 5,2).
4. Transfira a mistura para uma coluna (fornecida com o kit referenciado) e centrifuja a 17.900 × g por 1 min à temperatura ambiente (TR).
5. Descarte o fluxo e coloque a coluna giratória de volta no mesmo tubo de coleta. Adicionar 750 μL de PE tampão contendo etanol absoluto (EtOH) e centrifugar a 17.900 × g por 1 min em TR.
6. Descarte o fluxo e coloque a coluna giratória de volta no mesmo tubo de coleta. Centrifugar a 17.900 × g por 1 min no TR e descartar o tubo coletor com o flowthrough.
7. Para eluir os fragmentos de DNA, equipar a coluna com um novo tubo de 1,5 mL, adicionar 10 μL de EB tampão e deixar em RT por 3 min. Centrifugar a 17.900 × g por 1 min no RT.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante dias ou a -20 °C durante semanas.

6. Amplificação por PCR (Tabela 2)

OBS: Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela 3.

1. Para amplificar fragmentos de DNA transpostos, prepare a mistura mestre de PCR sem adicionar um primer de código de barras Ad2.n exclusivo (primer #2). Use 38 μL da mistura mestre de PCR por amostra: 11 μL de água livre de nuclease, 2 μL de 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) e 25 μL de 2x PCR Master Mix.
2. Adicionar 38 μL da mistura mestra de PCR a um tubo de PCR de 0,2 ml.
3. Adicionar 10 μL dos fragmentos de ADN eluídos do passo 5.7.
4. Adicionar 2 μL do primer #2 de 25 μM, que precisa ser específico para cada amostra.
5. Executar o PCR de acordo com as condições de ciclagem indicadas na Tabela 2.

7. Teste de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) (Tabela 4)

NOTA: Esta etapa visa determinar os ciclos adicionais necessários para amplificar o DNA. É opcional, mas altamente recomendado, especialmente para novos experimentos.

1. Prepare a mistura mestra de qPCR sem adicionar o primer #2. Use 9,975 μL da mistura mestra de qPCR por amostra: 4,41 μL de água livre de nuclease, 0,25 μL de 25 μM primer #1, 5 μL de 2x PCR Master Mix e 0,09 μL 100x SYBR Green I.
   OBS: Para preparar 100x SYBR Green I, diluir o estoque de 10.000x com água livre de nuclease. Como o volume de 100x SYBR Green que usei para a mistura mestre de qPCR é insignificante, é mais fácil fazer uma mistura mestre adicional de 100x SYBR Green I diluído (por exemplo, para 8-10 amostras).
2. Adicionar 9,975 μL da mistura mestra de qPCR em cada poço de uma placa de qPCR.
3. Adicionar 0,25 μL do primer #2 de 25 μM em cada poço.
   NOTA: Certifique-se de adicionar o mesmo primer #2 para corresponder ao que foi adicionado a cada amostra específica na etapa 6.4.
4. Adicionar 5 μL da reação de PCR obtida após a amplificação da PCR na etapa 6.5 e misturar por pipetagem.
   NOTA: Os 45 μL restantes da reação de PCR serão utilizados para a segunda amplificação da PCR.
5. Execute o qPCR de acordo com as condições de ciclagem indicadas na Tabela 5.
6. Verifique as curvas de amplificação e identifique o número de ciclos adicionais de PCR necessários, estimando o número de ciclos que atingiram ~35% do máximo (Figura 3A).
   NOTA: Normalmente, 10.000 núcleos requerem cinco a oito ciclos de PCR adicionais.

8. Amplificação adicional por PCR

1. Executar a PCR usando todos os 45 μL restantes da reação de PCR de acordo com os cálculos da etapa 7.6 (Tabela 6).
   NOTA: Cada amostra pode requerer um número diferente de ciclos de amplificação.

9. Segunda purificação do DNA usando o kit de purificação PCR

1. Use os mesmos procedimentos da seção 5, mas elimine os fragmentos de DNA amplificados com 20 μL de EB tampão.

10. Seleção do tamanho do fragmento de DNA

NOTA: Use esferas de imobilização reversíveis de fase sólida, conforme descrito abaixo. Quaisquer outras esferas de purificação de DNA semelhantes podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante. A suspensão do cordão SPRI deve ser completamente ressuspensa e equilibrada em RT com rotação antes do uso.

1. Transfira o DNA eluído para um novo tubo de PCR e adicione 80 μL de EB tampão para obter um volume final de 100 μL.
2. Adicionar 55 μL de contas SPRI (0,55x volume da amostra) e misturar por pipetagem. Incubar por 5 min no RT e, em seguida, separar em um mini suporte magnético para fitas de 8 tubos de PCR por 5 min.
3. Transferir 150 μL do sobrenadante para um novo tubo de PCR. Adicionar 95 μL de contas SPRI e misturar por pipetagem.
   NOTA: O sobrenadante contém DNA de aproximadamente 500 pb ou menor.
4. Incubar por 5 min no RT e, em seguida, separar no mini suporte magnético por 5 min. Descarte o sobrenadante com cuidado.
5. Lave as contas por 1 min com 200 μL de EtOH 70%. Repita duas vezes por três lavagens no total.
   NOTA: Não mova os tubos de PCR do suporte magnético durante as lavagens.
6. Após a lavagem final, gire os tubos a 1.000 × g por 1 min e pipete o EtOH restante. Secar o pellet com a tampa aberta a 37 °C durante 2 minutos numa máquina de PCR.
   NOTA: Os grânulos devem apresentar apenas algumas pequenas rachaduras depois de secos. Evite secar demais.
7. Ressuspender o pellet com 20 μL de EB tampão por pipetagem e incubar por 5 min em RT. Separe no mini suporte magnético por 5 min e, em seguida, transfira 18 μL do sobrenadante contendo a biblioteca final para um novo tubo de 1,5 mL.
   NOTA: A biblioteca pode ser armazenada a -20 °C durante a execução de uma verificação de qualidade.

11. Quantificação do DNA usando um fluorômetro

1. Para preparar a mistura mestre, diluir 200x reagente dsDNA High Sensitivity (HS) com tampão dsDNA HS até uma concentração final de 1x.
2. Para as normas, adicionar 190 μL da mistura mestre 1x e 10 μL da norma 1 ou padrão 2 a um tubo de fluorômetro.
   NOTA: Equilibre os padrões no RT no escuro antes de iniciar a quantificação.
3. Para as amostras da biblioteca, adicionar 198 μL da mistura mestre 1x e 2 μL de cada amostra a um tubo de fluorômetro separado.
   NOTA: Se as quantidades de amostra forem limitadas, o volume da amostra pode ser reduzido para 1 μL e o volume da mistura mestre de 1x pode ser aumentado para 199 μL.
4. Vórtice ou agite os tubos do fluorômetro e deixe-os descansar por 5 minutos no RT no escuro. Medir a concentração de DNA usando o ensaio de dsDNA HS do fluorômetro.

12. Verificação da qualidade da biblioteca por sistemas de eletroforese de alta sensibilidade

1. Pegue a biblioteca ATAC-seq e dilua com água livre de nucleases até uma concentração final de 1-5 ng/μL.
2. Analise a distribuição de tamanho das bibliotecas ATAC-seq usando sistemas de eletroforese automatizados de alta sensibilidade seguindo os protocolos do fabricante.

13. Verificação de qualidade da biblioteca ATAC-seq usando qPCR direcionado

1. Tome 5-10 ng da biblioteca ATAC-seq e dilua com 50 μL de água livre de nucleases.
2. Executar a qPCR usando primers direcionados aos promotores e potencializadores sabidamente ativos nos adipócitos de acordo com as condições de ciclagem indicadas na Tabela 7.
3. Utilizar primers de controle negativo direcionados a regiões genômicas fechadas/silenciosas (Tabela 7).
4. Calcular o enriquecimento do promotor/potenciador em relação aos controlos negativos (Quadro 8).
   NOTA: Espera-se ver enriquecimentos de ≥ a 10-20 vezes com amostras bem-sucedidas.

14. Sequenciamento

1. Envie as bibliotecas ATAC-seq para sequenciamento. Use sequenciamento de extremidade emparelhada (2 x 34 pb, 2 x 50 pb ou mais) com números médios de leitura de 10 a 30 milhões de leituras por amostra.

Resultados

Para analisar o tecido adiposo usando este protocolo ATAC-seq, geramos camundongos Adipoq-NuTRAP que foram alimentados com dietas de ração; em seguida, foram isolados núcleos de adipócitos do tecido adiposo branco epididimal (eWAT), tecido adiposo branco inguinal (TABi) e tecido adiposo marrom (BAT) por citometria de fluxo. Os núcleos isolados foram utilizados para marcação, seguida de purificação do DNA, amplificação por PCR, etapas de verificação de qualidade, sequenciamento e análise dos dados, conforme descrito acima...

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo ATAC-seq otimizado para avaliar a acessibilidade da cromatina específica para adipócitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq usando o camundongo Adipoq-NuTRAP gerou com sucesso perfis de acessibilidade à cromatina específica para adipócitos. O fator mais crítico para experimentos ATAC-seq bem-sucedidos e reprodutíveis é a qualidade do núcleo. É fundamental congelar imediatamente os tecidos adiposos dissecados em nitrogênio líquido e armazená-los com segurança a -80 °C sem des...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
< camundongo > animais < / forte >
adiponectina-Cre	O Laboratório Jackson	28020
Camundongo NuTRAP	O Laboratório Jackson	29899
Reagentes e Materiais
1.5 mL Tubos DNA-LoBind	Eppendorf	86-923
100 µ filtro de células m	Falcon	352-360
tubos de 15 mL	VWR	525-1071
2x tampão TD	Illumina	15027866
placa PCR de 384 poços	Aplicado biossistema	4483285
40 µ filtro de células m	Falcon	352-340
tubos de 50 mL	VWR	525-1077
Reagente AMPure XP (esferas SPRI)	Beckman Coulter	A63881
	Agilent Technologies	5067-4626
Filme adesivo transparente	Biossistema aplicado	4306311
Água destilada livre de DNase/RNase	Invitrogen	10977015
Dounce	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 com saia lateral	Thermo Fishers	12027
tubos FACS	Falcon
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Rack de separação magnética para PCR 8 tiras de tubos	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
Kit de purificação de PCR MinElute	Qiagen	28004
NEBPróximo de alta fidelidade 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8 tubos tira	EUA científico	1402-4708
Coquetel de inibidor de protease (100x)	Thermo Fishers	78439
Qubit dsDNA HS kit de ensaio	Invitrogen	Q32851
Sacarose	Sigma	S0389-1KG
SYBR Verde I (10.000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzima	Illumina	15027865
Instrumentos
fluxo	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Fluorômetro Qubit	Invitrogen	Q33226
Sistema de PCR em Tempo Real	Thermo Fishers	QuantStudio?5