Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM

Resumo

A tomografia crio-STEM fornece um meio de visualizar organelas de células intactas sem incorporação, seccionamento ou outras preparações invasivas. A resolução 3D obtida está atualmente na faixa de poucos nanômetros, com um campo de visão de vários micrômetros e uma espessura acessível na ordem de 1 μm.

Resumo

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) baseia-se na obtenção de imagens de espécimes biológicos ou orgânicos embutidos em seu meio aquoso nativo; A água é solidificada em um vidro (ou seja, vitrificado) sem cristalização. O método crio-EM é amplamente utilizado para determinar a estrutura de macromoléculas biológicas recentemente em uma resolução quase atômica. A abordagem foi estendida para o estudo de organelas e células usando tomografia, mas o modo convencional de imagem EM de transmissão de campo largo sofre uma severa limitação na espessura da peça. Isso levou a uma prática de moagem de lamelas finas usando um feixe de íons focalizado; A alta resolução é obtida pela média do subtomograma das reconstruções, mas relações tridimensionais fora da camada restante são perdidas. A limitação de espessura pode ser contornada por imagens de sonda digitalizadas, semelhante ao EM de varredura ou ao microscópio confocal de varredura a laser. Enquanto a microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) em ciência dos materiais fornece resolução atômica em imagens únicas, a sensibilidade de espécimes biológicos criogênicos à irradiação eletrônica requer considerações especiais. Este protocolo apresenta um setup para criotomografia utilizando STEM. A configuração tópica básica do microscópio é descrita para sistemas de dois e três condensadores, enquanto a automação é fornecida pelo software não comercial SerialEM. Aprimoramentos para aquisição de lotes e alinhamento correlativo a mapas de fluorescência previamente adquiridos também são descritos. Como exemplo, mostramos a reconstrução de uma mitocôndria, apontando a membrana interna e externa e grânulos de fosfato de cálcio, bem como microtúbulos circundantes, filamentos de actina e ribossomos. A tomografia crio-STEM se destaca por revelar o teatro de organelas no citoplasma e, em alguns casos, até mesmo na periferia nuclear de células aderentes em cultura.

Introdução

A visualização tridimensional (3D) de organelas é uma tarefa primordial na biologia celular moderna. Dadas as escalas envolvidas, variando de dezenas de nanômetros para vesículas secretoras a muitos mícrons para o núcleo celular, é desafiador encontrar uma única técnica de microscopia para atender a todas as aplicações. Enquanto a microscopia de fluorescência moderna pode abranger grande parte do intervalo em termos de resolução, apenas as moléculas marcadas aparecem. O teatro celular continua sendo o reino da microscopia eletrônica. Os métodos convencionais de fixação química, incorporação plástica e coloração com metais pesados são fortemente invasivos, de modo que os resultados podem depender dos detalhes da preparação da amostra. O crio-EM, por outro lado, é limitado pela necessidade de vitrificação do meio aquoso; cristais de gelo que formam difratam a iluminação eletrônica, causando artefatos de contraste de maior contraste do que o material orgânico de interesse.

Na última década, proliferaram técnicas de imagem em ME desenvolvidas ou adaptadas para estudos^celulares1. O congelamento a alta pressão combinado com fresagem iterativa por feixe de íons focalizados (FIB) e imagens seriadas de superfície usando o microscópio eletrônico de varredura (i.e., FIB-SEM) é atualmente o método de escolha para grandes espécimes². A tomografia criogênica de raios X moles (crio-SXT) é adequada para amostras de vários mícrons de tamanho, limitado pelo comprimento característico de absorção dos raios X moles em água ^3,4,5. Essa escala inclui muitos tipos celulares intactos, e a natureza quantitativa do contraste de absorção de raios X adiciona um aspecto de medição de concentração⁶ ou espectroscopia⁷. Quando combinada com a média do subtomograma, a tomografia eletrônica de criotransmissão (crio-TE), baseada em microscopia eletrônica de transmissão por contraste de fase (MET), oferece a mais alta resolução para macromoléculas ou complexos ^8,9,10. No entanto, é raro que organelas intactas sejam tão regulares que possam ser médias inteiras. Além disso, o modo convencional de MET de campo largo é limitado para a espessura do espécime a algumas centenas de nanômetros pela combinação de espalhamento inelástico (envolvendo perda de energia) no espécime e aberração cromática na objetiva magnética^11,12. A grande dispersão de energia dita o uso de um filtro de energia para remover a névoa fora de foco resultante, mas o espécime sensível ainda sofre danos de radiação, enquanto o sinal de imagem se torna exponencialmente mais fraco com o aumento da espessura.

O modo alternativo de imagem, scanning transmission EM (STEM), contorna a necessidade de filtragem de energia e retém os elétrons espalhados inelasticamente para a formação da imagem, embora atualmente em uma resolução menor do que para a tomografia por TEM (Figura 1). Na verdade, nenhuma imagem real é formada. Em vez disso, como em um EM de varredura, as medições são feitas ponto a ponto, e a imagem é montada pelo computador. A ampliação é determinada apenas pelo tamanho das etapas de varredura sem alterar as correntes da lente. Quando bem configurada, a faixa útil de espessura da amostra para tomografia crio-STEM (CSTET) pode chegar a 1,5 ou até 2 μm, embora a zona de conforto, onde a intensidade útil do sinal permanece uma fração significativa da iluminação, esteja em torno de 600-900 nm^11,13. Isso é suficiente para ver uma grande fração do citoplasma e, ocasionalmente, uma borda do núcleo celular. Na prática, descobrimos que a vitrificação pelo método padrão de imersão em fluido criogênico impõe uma restrição mais severa na espessura do que a imagem STEM. O objetivo deste artigo em vídeo é facilitar a incorporação do CSTET no tórax de ferramentas para imagens de células e organelas em laboratórios de pesquisa e instalações de microscopia.

O primeiro desafio é que as operações de microscópio no CSTET ainda não estão padronizadas para aplicações em ciências da vida da mesma forma que têm sido para a tomografia por crio-TEM. O hardware STEM raramente (ou nunca) foi direcionado para o mercado de crio-EM. No entanto, isso está mudando com a mais nova geração de microscópios, e muitas ferramentas existentes podem ser adaptadas. A técnica STEM tem decolado e assumido largamente as ciências dos materiais, onde também há um crescente interesse em métodos criogênicos e de baixa dose^14,15. A literatura de ciência dos materiais é abundante com siglas BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., que aumentam a confusão. Oferecemos aqui um ponto de partida recomendado que, em nossa experiência coletiva no Instituto Weizmann de Ciências, fornece o protocolo mais geral para resultados úteis baseados em imagens STEM de campo brilhante (BF)¹⁶. De forma alguma esgota ou mesmo explora o leque de possibilidades, mas servirá de base para novos aprimoramentos. Embora enfatizemos a crio-STEM, a maior parte do protocolo é igualmente relevante para a tomografia STEM à temperatura ambiente de cortes embebidos em plástico.

A essência do STEM é escanear o espécime com uma sonda eletrônica focalizada (Figura 1), o cone de iluminação, e registrar sinais do plano de difração (espalhamento) em transmissão, pixel a pixel, para produzir imagens 2D^17,18. Espécimes amorfos, incluindo a maioria dos materiais celulares, produzirão um padrão de espalhamento difuso na transmissão. A configuração STEM prática mais simples é colocar um detector circular para registrar o disco central (ou seja, a iluminação da sonda que seria transmitida sem uma amostra). O espécime espalha elétrons para longe deste cone de iluminação na medida em que o sinal diminui. Isso produz uma imagem BF - o espécime aparece escuro em um fundo brilhante. Um detector anular também pode (ou em vez disso) ser usado para detectar o espalhamento do espécime fora do cone de iluminação. Com o espécime retirado, não há sinal. Quando um espécime está no lugar, os objetos aparecem brilhantes em um fundo escuro na imagem de campo escuro (DF). A nomenclatura para STEM (BF, campo escuro anular [ADF], campo escuro anular de alto ângulo [HAADF], etc.) refere-se principalmente às faixas de ângulos de coleta para os detectores.

O ângulo de convergência da iluminação representa uma adaptação essencial do STEM à tomografia celular. Quando a prioridade máxima é alta resolução, o ângulo de convergência deve ser o maior possível. (Isso é semelhante à microscopia confocal de varredura a laser; a resolução é determinada pelo diâmetro da sonda, que escala como o comprimento de onda dividido pela abertura numérica. Note que nos referimos ao ângulo de meio-ângulo ou semi-convergência para EM.) Quando a prioridade é a profundidade de campo, por outro lado, um comprometimento na resolução oferece uma grande vantagem, pois o feixe focalizado permanece aproximadamente paralelo por uma distância igual ao dobro do comprimento de onda dividido pelo semiângulo quadrado. O ideal é que todo o volume celular permaneça em^foco19. Por exemplo, a 300 keV, o comprimento de onda do elétron deBroglie é de 0,002 nm, então uma convergência de 1 mrad produz uma resolução de 2 nm e uma profundidade de campo de 4 mícrons. Nessas condições, a tomografia pode ser realizada mesmo sem foco durante o processo de coleta de dados, mas apenas uma vez no início da aquisição. Um STEM convencional capaz de tomografia pode atingir um ângulo de semiconvergência de 7 ou 8 mrad; Portanto, em princípio, poderíamos chegar a uma resolução da ordem de 0,25 nm, mas então com uma profundidade focal de apenas 62 nm. Isso é claramente muito fino para imagens celulares. Microscópios mais avançados com três lentes condensadoras oferecem ajuste contínuo do ângulo de semiconvergência em uma faixa considerável. Com a configuração mais tradicional de dois condensadores, a convergência é fixada discretamente pela abertura do condensador (C2).

Para amostras robustas embutidas em plástico, pode-se gravar uma série focal em cada inclinação e combiná-las para alta resolução²⁰, mas para amostras criogênicas, o orçamento de radiação é muito restrito. Finalmente, na ponderação das vantagens da imagem de FS ou FD, para espécimes espessos, deve-se considerar os efeitos do espalhamento elástico múltiplo no espécime. O sinal do FS é menos corrompido por espalhamento múltiplo e apresenta maior resolução para espécimes espessos^16,21.

Uma regra prática útil tem sido definir ângulos de coleta várias vezes maiores do que a convergência. Quanto mais espesso o espécime, maior deve ser o disco de coleta. Um disco muito pequeno fornecerá uma baixa intensidade de sinal; Um disco muito grande resultará em contraste de imagem ruim, pois apenas a dispersão de ângulo mais alto contribuirá. Os ângulos de coleta devem ser otimizados para uma determinada amostra. Os ângulos do detector em função do comprimento da câmera (difração) devem ser calibrados independentemente. Eles podem ser exibidos convenientemente pelo software do microscópio. Na prática, um fator de dois a cinco na razão entre os semiângulos de coleta e iluminação, θ e α, respectivamente (Figura 1), é um ponto de partida recomendado para o CSTET de espécimes celulares.

O protocolo a seguir descreve a operação da tomografia STEM utilizando o popular software SerialEM para controle microscópico^22,23. SerialEM não está vinculado a um fabricante específico, e é amplamente utilizado em tomografia de TEM. A maioria das operações de montagem para tomografia pode ser realizada diretamente do TEM. A estratégia do SerialEM é modelar o sistema de digitalização como uma câmera. Isso permite o cruzamento simples de TEM para STEM. Deve-se ter em mente, no entanto, que parâmetros como ampliação e binning são totalmente artificiais. Os parâmetros importantes são o campo de visão em mícrons, o número de pixels no campo de visão e o tempo de exposição. O espaçamento entre pixels, ou amostragem, é o campo linear dividido pelo número de pixels, enquanto o tempo de permanência é o número de pixels dividido pelo tempo de exposição.

A configuração mínima para STEM e CSTET envolve três recursos no microscópio: um gerador de varredura, um detector STEM e um software de controle de tomografia. O protocolo refere-se à nomenclatura da FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), mas os conceitos são genéricos. O software proprietário do TFS foi descrito no JoVE para TEM²⁴, e a operação STEM é muito semelhante.

Assumimos que o microscópio foi alinhado com antecedência pela equipe de serviço ou equipe experiente e que um alinhamento de coluna pode ser chamado carregando um arquivo. Pequenos ajustes são chamados de alinhamentos diretos e podem ser armazenados nos chamados registradores FEG (microscópios TFS). Os alinhamentos diretos incluem centro de rotação, pontos de pivô, alinhamento de difração e compensação para o astigmatismo do condensador. Os ajustes devem ser realizados de forma iterativa. Observe que os microscópios TFS implementam modos distintos de nanossonda (nP) e microssonda (μP); para uma dada abertura do condensador, estes fornecem um campo de visão relativamente estreito ou largo com iluminação paralela em MET e um feixe de elétrons mais ou menos convergente (fortemente focado) em STEM, respectivamente. Outros fabricantes utilizam esquemas diferentes para cobrir a gama de ângulos de convergência.

Antes de iniciar, deve-se escolher o campo de visão, L, e a amostragem (largura do pixel), l, dependendo da amostra em estudo. Por exemplo, para l = 1 nm/pixel, uma imagem de 4.000 x 4.000 pixels que cobrirá um campo de visão de 4 μm² deve ser escolhida. A resolução será, na melhor das hipóteses, o dobro da amostragem espacial, então 2 nm, e o diâmetro da sonda, d, deve corresponder a isso. A calibração do ângulo da sonda está além do escopo deste protocolo, então assumimos que uma tabela ou uma leitura de tela está disponível. O diâmetro da sonda é aproximadamente o comprimento de onda do elétron dividido pelo ângulo de semiconvergência (em radianos): d = λ/θ. O comprimento de onda, λ, é de 0,002 nm para 300 keV e 0,0025 nm para elétrons de 200 keV, então θ de 1 mrad fornecerá um diâmetro de ponto de 2 ou 2,5 nm, respectivamente.

O protocolo apresenta-se numa progressão de complexidade crescente. A primeira tarefa é produzir uma imagem STEM, que depende do software do fabricante do microscópio, e depois uma série de inclinação, para a qual usamos o SerialEM. Muitos leitores, sem dúvida, estarão familiarizados com o SerialEM, então as tarefas mais complicadas virão naturalmente. Não há necessidade de seguir os procedimentos rigorosamente. Desenvolvimentos relacionados à automação podem ser implementados diretamente para STEM e TEM. Usuários experientes provavelmente inverterão o protocolo, começando com o registro correlativo de mapas de fluorescência e continuando a configurar a tomografia em lote. Mais detalhes podem ser encontrados na extensa documentação e bibliotecas de tutoriais do próprio SerialEM, incluindo um artigo recente do JoVE sobre os últimos desenvolvimentos em automação²⁵.

Protocolo

1. Configuração STEM

1. Alinhamentos preliminares: carregue o arquivo de alinhamento de coluna e abra Válvulas de coluna. Se estiver usando um suporte criogênico de entrada lateral, abra o Cryo-shield. Inicie no modo TEM. O feixe deve aparecer na tela. Caso contrário, diminua a ampliação.
2. Coloque o microscópio em foco eucêntrico pressionando o botão no painel de controle.
3. Defina o tamanho do ponto para um valor conveniente (por exemplo, 6) para visualizar a tela fluorescente, diretamente ou com a câmera embutida (dependendo do modelo do microscópio).
4. Ajuste o microscópio para o modo STEM e verifique se o foco usa as lentes condensadoras (intensidade) em vez da objetiva. Defina o foco eucêntrico. Em seguida, saia do modo de difração para os ajustes iniciais.
5. Certifique-se de que a viga não está em branco. Reduza a ampliação até que o feixe apareça na tela. Ajuste o deslocamento do feixe para o centro e aumente a ampliação em etapas até cerca de 70kx, mantendo o feixe no centro.
6. Insira a abertura do condensador desejada, normalmente 50 μm. Verifique a centralização da abertura. Ao girar o botão de foco ligeiramente para frente e para trás, o ponto deve se expandir e contrair, mas permanecer no lugar, como se um plano cortasse uma ampulheta vertical imaginária. Se a abertura não estiver centralizada, a iluminação se deslocará lateralmente, como se a ampulheta estivesse inclinada.
7. Coloque o feixe para focar e pressione Foco da Lista de Intensidade (se disponível) na guia Alinhamentos ou retorne ao foco eucêntrico como em 1.2. Reajuste a posição do feixe para o centro.
8. Ajuste o centro de rotação. Gire a roda do degrau de foco para o mínimo ou um degrau acima, para que o feixe pulse suavemente, e certifique-se de que ele permaneça estacionário à medida que o foco se move para cima e para baixo.
9. Selecione os pontos dinâmicos e junte os dois pontos com ajustes X e Y.
   NOTA: Se uma placa de fase estiver instalada em um instrumento TFS, somente o ajuste X deve ser usado.
10. Desfoque ligeiramente o feixe e ajuste os estigmatizadores do condensador para tornar o disco redondo. Suba e desça através do foco para otimizar; Não deve haver tendência a alongar em uma direção ou outra ao passar o foco.
11. Normalize as lentes. Em seguida, aumente a ampliação progressivamente para cerca de 240kx usando o deslocamento do feixe para manter o ponto centralizado e repita os ajustes do centro de rotação e do ponto de pivô (passos 1.6-1.8).
12. Retorne ao modo de difração. O feixe deve aparecer como um disco uniforme na tela fluorescente. O comprimento da câmera (CL) agora controla efetivamente a distância óptica ao detector, como na cristalografia de raios-X. Mude-o e observe como o disco se contrai e aumenta, como se a localização da tela se movesse em direção ou para longe da amostra. Este cone representa a iluminação BF.
    OBS: Para cada CL, há um alinhamento de difração a ser ajustado de forma a trazer a viga projetada para o eixo central. Normalmente, não há necessidade de refiná-los todos, apenas um (ou poucos) a ser usado para detecção.
13. Ative o modo STEM em alta ampliação.
    1. Se um detector BF STEM estiver disponível, comece com isso. Leve o palco para uma área com um furo vazio e ajuste o alinhamento da difração para centralizar a viga usando o CL desejado.
    2. Muitos microscópios são equipados apenas com um detector HAADF; há um truque para usar isso como um detector de BF. Primeiro, retraia o detector, centralize o feixe como acima nos alinhamentos diretos, insira uma abertura objetiva, tipicamente pequena, como 20 μm, e ajuste sua posição para circundar o feixe uniformemente. (A maneira mais fácil de fazer isso é inserindo uma amostra ou uma grade de teste para ver um halo ao redor da iluminação). Em seguida, use o alinhamento de difração para mover o feixe para fora do eixo e para a área do detector. Insira e retraia o detector enquanto observa o feixe na tela para confirmar se o feixe está bloqueado pelo detector.
    3. Inicie uma varredura no software do microscópio e ajuste as configurações de brilho e contraste (B/C) para que o sinal fique próximo de 0 quando o feixe estiver vazio e próximo da saturação quando a iluminação total cair sobre o detector. Use a exibição do escopo para ajudar. As configurações podem ser acopladas de maneiras inesperadas, portanto, o ajuste deve ser iterado várias vezes.
14. Retorne o microscópio a uma magnificação relativamente baixa no registro de alta magnificação (modo SA), sem entrar no modo de baixa magnificação (LM).
15. Observe a corrente da tela para referência posterior (consulte a etapa 3.1.1). A corrente pode ser alterada com as configurações de lente da arma e tamanho do ponto, como no TEM, com números crescentes correspondentes a uma corrente reduzida.
16. Neste ponto, salve um registro FEG para facilitar um retorno aos valores padrão.
    NOTA: O recurso pode preparar um conjunto padrão de registros FEG para que os usuários possam iniciar a partir de uma configuração de trabalho.

2. Colocação do espécime

1. No modo LM TEM, verifique se a grade não é opaca. Encontre um quadrado de grade para fazer os ajustes iniciais. É conveniente encontrar alguma área vazia, um buraco ou um quadrado de grade rasgado. Registre as posições do palco para retornar a elas convenientemente.
2. Leve a amostra à altura eucêntrica. Existem vários métodos para fazer isso. Por exemplo, use o oscilador de palco para inclinar a grade enquanto move a altura da amostra ao longo do eixo Z até que a imagem pare de se deslocar lateralmente. Como alternativa, marque alguns recursos na tela de visualização e incline o palco para 30°. O recurso se moverá lateralmente. Ajuste a altura do espécime para trazê-lo de volta à posição original. Aumente a ampliação ou a inclinação do estágio para refinar. Volte para 0° de inclinação.
3. Retorne ao modo STEM e insira o detector STEM. Vá para o modo de ampliação alta (SA) mais baixo. Certifique-se de que uma imagem seja observada na tela do computador. Digitalize rapidamente para evitar exposição desnecessária; 1 μs/pixel ou menos seria típico. Observe que a imagem pode aparecer distorcida na borda esquerda quando a varredura é excessivamente rápida (consulte a Figura 2).
4. Pressione Foco Eucêntrico, aumente a ampliação e refine o foco durante a digitalização. É conveniente usar a lupa de foco fornecida pelo software do microscópio.
5. Sintonize o astigmatismo do condensador. Isso pode ser feito mais precisamente pelo método Ronchigram. Com o feixe sobre uma área de amostra fina, concentre-se no ponto onde o feixe transmitido explode, entre as imagens de sombra da amostra de ambos os lados. Em seguida, ajuste o ajuste do condensador para tornar o disco central redondo. Isso requer alguma prática, especialmente para amostras criogênicas.
   NOTA: Uma alternativa é encontrar algumas partículas de ouro (frequentemente usadas como marcadores fiduciais para alinhamento em tomografia). Aumente a ampliação e foque para cima e para baixo, ajustando o astigmatismo para que as partículas permaneçam redondas sem alongamento em nenhuma das direções.
6. Vá para o modo LM STEM e continue a varredura para encontrar uma área interessante. Reajuste as configurações B/C do detector, se necessário (passo 1.13.3), aproximadamente neste ponto.

3. Gravar uma imagem

1. Estimar a dose para gravação. Como regra geral, aponte para 100-150 e^-/Ų para todo o tomograma. Verifique a tolerância à dose por amostra. A corrente em Ampere (A) dividida pela carga por elétron representa uma contagem de e^-/s, que é multiplicada pelo tempo de exposição, T, em segundos e dividida pelo campo de visão em Ų. Por conveniência, expresse a corrente em nanoamperes (conforme lido da tela), a largura do campo de visão em micrômetros e o tempo de exposição do quadro em segundos, com fatores adequados:
   
   Esse número deve ser multiplicado pelo número de inclinações para obter a exposição total na série. Por exemplo, com uma corrente I = 0,04 nA, um campo L = 4 μm e um tempo de exposição de 12 s, obtemos 1,9 e-/Å 2 por inclinação, ou cerca de 110 e^-/Ų para uma série de 61 projeções.
2. Retorne o estágio para um orifício (ou retraia a grade) e ajuste a corrente do feixe usando o tamanho do ponto e/ou as configurações da lente da pistola para alcançar a corrente de tela desejada. Se a medição for 0, insira uma abertura C2 maior para aumentar a corrente. Em seguida, corrija dividindo a medida pelo quadrado da razão dos diâmetros e, finalmente, retorne à abertura menor.
3. Refine as configurações de B/C de acordo com a etapa 1.13.3 e, finalmente, retorne o estágio para uma área de interesse e verifique novamente os alinhamentos diretos e o astigmatismo sob as condições de imagem.
4. Adquira uma imagem de teste.

4. Tomografia com SerialEM

1. Inicie o servidor SerialEM no computador do microscópio (o SerialEM é normalmente instalado em um computador diferente). Em seguida, abra SerialEM. STEM aparece no SerialEM como uma câmera, com a mesma interface. Verifique se as comunicações estão sendo executadas adequadamente para a instalação. Por exemplo, a guia do microscópio deve exibir a ampliação correta. Se isso não funcionar, pare por aqui e solucione problemas.
2. Localize a guia câmera e script e abra Configuração. Certifique-se de que a câmera STEM esteja selecionada e, para cada modo, escolha os tempos de binning e de permanência adequados. Certifique-se de que o detector (ou detectores) apropriado apareça na caixa "canais a adquirir" no canto inferior esquerdo. Pressione Adquirir na parte inferior para testar. Novamente, não continue se nada acontecer, ou se a viga não desmanchar. Pare e verifique as comunicações.
   NOTA: Os modos são usados de forma semelhante à tomografia de TEM. Binning é um artifício para compatibilidade com TEM. O parâmetro importante é a contagem de pixels; diferentes sistemas de microscópio usam binning diferentes para atingir a mesma contagem.
   1. Visualizar e Pesquisar devem ser varreduras rápidas com relativamente poucos pixels (por exemplo, 512 x 512 pixels a 1 s).
   2. O foco é geralmente uma pequena área com gravação rápida. Assim, no modo de baixa dose, escolha Foco para estar em uma ampliação diferente do modo Gravar, o que pode ajudar na precisão. Deixe o tamanho do spot inalterado.
   3. Para o modo Registro, use os parâmetros escolhidos acima na estimativa de exposição. Se disponível, selecione também Foco Dinâmico, que corrige o foco linha por linha em uma imagem inclinada.
   4. Para conveniência posterior, escolha o binning para visualização para ser idêntico ao de View (consulte Aprimoramento #1, etapa 5.5). O tamanho da imagem (número de pixels) não precisa ser o mesmo.
   5. Use o modo de avaliação para manter a área Registro centralizada durante a aquisição. Ele pode ser semelhante ao View, mas tome cuidado para que não haja distorções de varredura aparentes no lado esquerdo do quadro (consulte a Figura 2 para obter um exemplo). Novamente, no modo de Baixa Dose, o Teste pode ter uma ampliação diferente do modo Registro.
   6. Use o modo de montagem imediatamente para a varredura de grade. Deve ser suficientemente denso em pixels para encontrar áreas de interesse; Recomendação: 512 x 512 ou 1024 x 1024. Certifique-se de que a imagem é boa, com um alcance dinâmico decente (visto nos controles de exibição de imagem), pois esse modo é usado para encontrar as áreas de amostragem.
   7. Salve o arquivo de configurações para que essas opções sejam mantidas como padrão para a próxima sessão (o que pode ocorrer em breve caso o programa trave).
3. Teste as calibrações de mudança de imagem e mudança de estágio. No modo de microssonda (ou nanossonda), clique em Exibir imagem, passe o mouse sobre ela, mantenha o botão pressionado e arraste diagonalmente por cerca de um quarto do campo de visão. Em seguida, tome outra vista. As imagens devem sobrepor-se perfeitamente. Repita arrastando novamente enquanto mantém a tecla Shift pressionada (para impor um movimento de palco). As imagens devem se sobrepor bem, embora talvez com menos precisão.
4. Vá para o modo LM e teste a mudança de estágio. Se esses testes falharem, pare e solucione problemas. O resto não vai funcionar.
5. Faça um mapa LM de montagem de toda a grade. Isso também pode ser feito no TEM.
   1. Vá para o modo STEM de ampliação mais baixa, onde a imagem não é bloqueada por aberturas, normalmente em torno de 185x.
   2. Clique no menu Navegador > Abrir. Em seguida, clique no menu Navegador > Opções de navegação > desmarque Converter mapas em bytes.
   3. Selecione o menu Navegador > Montagem e Grades > Configurar Montagem Completa. Um menu será aberto. As opções a serem verificadas são: Mover estágio em vez de alterar imagem, Fazer mapa de cada montagem se o Navegador abrir e Usar mapeamento de montagem, não Registrar parâmetros. A grade de imagem deve ser aproximadamente 6 x 6 ou 7 x 7. Procure a área total a ser registrada. Se forem necessárias muitas imagens, a magnificação pode não ser lida corretamente a partir do microscópio (Figura 3). Pare e verifique.
   4. Para iniciar a aquisição de Montagem, pressione Iniciar nos Controles de Montagem ou Montagem em Câmera & Script. Outro menu será aberto para escolher os Parâmetros do arquivo : mrc, armazenar como inteiros e, em outra caixa de diálogo, escolher o nome do arquivo para armazenamento. Certifique-se de armazenar dados na área de dados adequada e não nas próprias configurações de usuário do SerialEM. Recomenda-se não armazenar dados grandes no disco C onde o sistema reside.
   5. Quando a aquisição for concluída, a montagem aparecerá na janela principal (Figura 4). Agora pode-se navegar pela grade usando o marcador e pontos no Navigator, assim como no TEM.
6. Verifique novamente a correção do astigmatismo. Normalmente, é suficiente escanear uma pequena área rapidamente e ajustar junto com o foco para que características pontuais, como nanopartículas de ouro, permaneçam completamente redondas à medida que entram e saem do foco (como em um MEV) em alta ampliação. De forma mais conservadora, pode-se repetir os alinhamentos diretos dos passos 1,5-1,8 antes de fixar o astigmatismo.
7. Alinhe a imagem de alta ampliação à montagem LM.
   1. Vá para uma posição na montagem LM com algum recurso facilmente reconhecível. Adicione um ponto, clique na janela Navegador > Adicionar Pontos e clique no recurso. Pressione novamente (pare de adicionar) para desativar.
   2. Pegue uma imagem View ou Trial na menor ampliação de mag (HM) e encontre o item indicado. Coloque o marcador lá (cruz verde) e, com o ponto correspondente realçado na janela Navegador, no menu Navegador > Shift to Marker..., na caixa de diálogo que se abre, escolha All Maps e Save Shift, como mostra a Figura 5.
   3. Teste movendo o palco para outras posições e verificando se a imagem HM está centralizada nos mesmos locais selecionados na montagem do LM. Se o recurso não estiver visível na imagem HM, a mudança entre os modos LM e HM pode ser muito grande. Nesse caso, faça uma montagem de polígono sobre uma área maior. Clique na janela Navegador > Adicionar Polígono, escolha alguns pontos e clique em Adicionar Polígono novamente para fechar. Clique no menu Navegador > Montagem e Grades > Configurar Montagem de Polígono e Controles de Montagem > Iniciar. Em seguida, localize os pontos correspondentes como acima e clique em Shift to Marker....
8. Configure o modo de dose baixa.
   1. Abra a guia Controle de Dose Baixa e marque a caixa Modo de Dose Baixa .
   2. Marque Atualização contínua e vá para Exibir. Escolha a ampliação do microscópio para este modo, normalmente o mais baixo ou próximo ao mais baixo. Escolha cada um dos próximos modos e defina a ampliação apropriada. O registro deve ser definido para atingir o tamanho de pixel desejado e a ampliação do foco deve ser alta o suficiente para que os marcadores fiduciais ou outros recursos de alto contraste para foco sejam claramente resolvidos. Em seguida, desmarque imediatamente a opção Atualização contínua.
      NOTA: O modo de avaliação pode ser definido de forma semelhante ao Record, caso em que a área de rastreamento terá que ser deslocada da área Record para minimizar a exposição, ou para baixa ampliação, abrangendo grande parte do entorno.
   3. Pegue uma imagem View e defina a posição Trial usando Definir posição da área: Trial.
      NOTA: Recomendação #1: Dada a mudança na área e no tempo amostrados, a exposição adicionada para um ensaio de baixa mag pode ser mínima. Contanto que a barra de grade não entre no campo de visão, esse método de rastreamento normalmente é mais confiável. Recomendação #2: Também é possível atualizar o tamanho do spot para ajustar a dose para diferentes modos, como o Focus. Para estabilidade nas configurações ópticas do microscópio, recomendamos não fazer isso, mas deixar o tamanho do ponto como é apropriado para o Record e, em seguida, ajustar o tempo de exposição, se necessário, para os modos de varredura mais rápidos.
   4. Clique na guia Controle de Baixa Dose > Vá para: Rec., em seguida, clique no menu Navegador > Abrir Estados de Imagem > Adicionar Estado Atual. Dê-lhe um nome para que possa ser lembrado facilmente (por exemplo, μP STEM para microssonda STEM). Vários estados podem ser definidos para diferentes tarefas.
9. Mova o palco para um local de interesse para a tomografia (mais sobre o uso do Navigator abaixo).
   1. Adicione um ponto no Navegador clicando na janela Navegador > Adicionar Pontos.
   2. Refine a altura eucêntrica selecionando Tarefas > Eucentricidade > Áspero. Janela Navegador > Atualização Z.
   3. Defina as áreas para Foco e Avaliação. Primeiro, tire uma imagem de exibição. Em seguida, na guia Controle de Baixa Dose , em Definir posição da área, selecione Foco ou Avaliação. Ajuste as posições para as duas áreas ao longo do eixo de inclinação. O foco não deve se sobrepor à área Registro.
      Observação : lembre-se de que há alguma ultrapassagem, especialmente na borda esquerda, portanto, nenhum deles deve ser definido imediatamente adjacente à área de registro. A extensão da sobrecarga pode ser avaliada em uma área de teste examinando repetidamente a ampliação do Registro e, em seguida, reduzindo a ampliação para obter uma visão mais ampla.
10. Para uma boa medida (opcional com experiência), incline o palco para +60° e, em seguida, -60°, cada vez que tirar uma imagem Exibir ou Visualizar para garantir que a barra de grade não entre no campo de visão da área de registro mostrado em verde.
11. Configure a série de inclinação.
    1. Abra um novo arquivo para salvar os dados clicando em Arquivo > Abrir Novo e escolha um nome de arquivo. Selecione o menu Série Tilt > Configuração da Série Tilt (Figura 6). Solução de problemas: se o botão Abrir Novo estiver cinza, verifique se a série de inclinação anterior foi encerrada. Caso contrário, encerre clicando em Tilt Series > em Encerrar.
    2. Defina os ângulos de inclinação extremos na inclinação para e Fim em caixas, normalmente -60° e +60°, respectivamente, bem como o incremento, normalmente 2°.
    3. Para o modo simétrico de dose (recomendado - certifique-se de que o modo de Dose Baixa ainda esteja ativo), marque Executar série em duas direções a partir de ___. O branco é normalmente 0, mas pode ser usado para compensar lamelas FIB pré-inclinadas (por exemplo, a 20°).
    4. Para simplificar, marque Manter o tempo de exposição constante. Alterar isso requer algum retrabalho do cálculo de exposição e também pode interferir em reconstruções algébricas (por exemplo, ART/SART/SIRT), que comparam as intensidades projetadas com os dados originais (ver etapa 7.1).
    5. Marque Ignorar foco automático. Um pequeno ângulo de semiconvergência, como 1 mrad, implica uma profundidade de campo tão longa que pode ser desnecessário focar. Como teste, concentre-se em 0°, incline para 60° ou -60° e pressione Record. Manter o foco é principalmente uma questão de altura eucêntrica precisa. Para uma maior convergência, pode ser necessário focar durante a série. Nesse caso, dê uma olhada e, na guia Controle de Baixa Dose, defina a posição da área e do foco e ajuste a área de foco.
    6. Ações iniciais e finais: Se o ajuste de altura eucêntrico foi realizado com precisão, não há necessidade de repeti-lo. Desmarque Fechar válvulas de coluna no final da série , a menos que haja boas razões para não fazê-lo.
    7. Para rastrear os parâmetros de controle, há muitas opções. Para coleta autônoma de dados, a principal prioridade é evitar que o programa pare para entrada do usuário. Use as configurações recomendadas: repita Registrar se a porcentagem de campo perdido for maior que 5. Em seguida, acompanhe e marque Alinhar com visualização antes de obter nova referência de faixa e Obter nova referência de faixa se o alinhamento de registro for diferente em 2%. Para a coleta de dados assistida, aplicar parâmetros mais rigorosos para evitar o risco de perda de horas de tempo do instrumento.
    8. Quando estiver pronto para começar, pressione GO na parte inferior da janela. No final, selecione Tilt Series > Terminate.

5. Aquisição em lote em vários pontos usando o Navigator (Enhancement #1)

NOTA: O protocolo é rudimentar porque a) é idêntico ao TEM e b) novas ferramentas estão se tornando disponíveis que provavelmente tornarão uma descrição completa obsoleta.

1. Carregue a montagem de grade completa na janela principal.
2. Escolha uma série de áreas que parecem promissoras. Clique em Adicionar pontos e adicione aos centros dos quadrados de grade selecionados. Clique em Adicionar pontos novamente para desativar o modo.
3. Com o estado de imagem de baixa dose ativado, selecione a janela Navegador > marque Adquirir e Novo arquivo no item para cada um dos quadrados selecionados. Para o primeiro, uma caixa de diálogo será aberta para as propriedades do arquivo (Figura 7) e, em seguida, o nome do arquivo. Escolha Montaged images e, na caixa de diálogo Montage Setup (Figura 8), marque Usar parâmetros View no modo Low Dose e crie uma grade grande o suficiente para cobrir o quadrado (aproximadamente 100 x 100 μm).
4. Clique no menu Navegador > Adquirir em itens e selecione os parâmetros para mapeamento. Mais importante, em Ações primárias, marque Criar mapa do navegador, depois Eucentricidade aproximada e Eucentricidade fina e pressione Go (Figura 9). Para uma grade de 200 malhas, isso resultará em um mapa de aproximadamente todo o quadrado (Figura 10)
5. Prepare-se para as seleções de posição do tomograma. Abra um novo arquivo clicando em Arquivo > Abrir Novo. Dê a ele um nome de arquivo (por exemplo, AnchorMaps.mrc).
   1. Com o modo de Baixa Dose ativo, insira Camera & Script > Setup e verifique se View e Preview estão no mesmo binning (caso contrário, eles não podem ser salvos no mesmo arquivo).
   2. Pontos de visita nos mapas quadrados clicando na janela Navegador > Ir para XYZ.
   3. Escolha uma posição para o primeiro tomograma com o marcador. Pegue uma imagem de visualização e refine a posição arrastando com o botão direito do mouse. Em seguida, selecione a janela Navegador > Novo Mapa e clique em sim para a caixa de diálogo a ser salva. Em seguida, pegue uma imagem View da mesma área e salve novamente como um novo mapa. Verifique se o mapa Exibir está realçado e verifique o estado da âncora na janela Navegador no canto superior direito.
   4. Escolha a segunda posição, novamente faça uma Visualização e refine o local como acima e, desta vez, pressione o Mapa Âncora na janela Navegador. Isso salvará a visualização e a exibição como novos mapas no navegador.
   5. Repita a etapa 5.5.4 para todos os locais desejados. Mova de um quadrado de grade para outro selecionando o ponto e pressionando Ir para XYZ na janela Navegador.
6. Para foco de referência, escolha uma área clara da grade e concentre-se cuidadosamente, à mão ou por foco automático. Pressione Redefinir desfoco no painel do microscópio. Crie um script no SerialEM clicando em Script > Editar > Editar 15 (ou outro número livre) e insira duas linhas: ScriptName SetDefocus e SetDefocus 0.
7. Na janela Navegador, realce o primeiro local (Visualizar ou Exibir). Pressione Shift-T e, em seguida, realce o último local e pressione novamente Shift-T. A caixa de diálogo Propriedades do arquivo será aberta. Escolha imagens de quadro único e parâmetros para salvar, incluindo o nome do arquivo. Edite o nome do arquivo, mas deixe o rótulo do item no final.
   NOTA: Os nomes de arquivos terminados em números serão atualizados automaticamente para séries de inclinação sucessivas. É conveniente usar a opção Navegador menu > Nav. Opções > Usar rótulos de item em nomes de arquivos.
8. Em seguida, o menu Configuração da Série Tilt será aberto automaticamente. Preencha como antes (Figura 6), mas não escolha Refinar eucentricidade. Os pontos de visualização no Navegador agora serão marcados como TS. Pode-se retornar a este menu usando o botão na janela Navegador acima da lista de itens.
9. Escolha o menu Navegador > Adquirir em itens. Desta vez, selecione parâmetros para Dados Finais. Selecione Ação Principal: Adquira a série de inclinação e escolha Gerenciar Dewars/Vácuo, Realinhar ao Item, Eucentricidade Fina e Executar Script antes da Ação, com Script para executar: SetDefocus. Selecione as opções gerais: nenhuma caixa de mensagem quando ocorrer um erro e feche as válvulas de coluna no final e pressione GO (Figura 11). O SerialEM agora visitará todos os mapas Anchor e registrará uma série de inclinação em cada posição (Figura 12).

6. Registro do mapa CLEM (Aprimoramento #2)

1. Se ainda não tiver sido feito, carregue a montagem de grade completa na janela principal e, em seguida, crie uma nova janela clicando em Janela > Nova Janela e dê um nome a ela. Observe que a montagem completa da grade aparece no Registro 1.
2. Importe a imagem do mapa CLEM clicando no menu Navegador > Importar mapa. Deve entrar no Registro 2. Também pode ser atribuída uma nova janela como acima.
3. Inspecione o mapa CLEM para determinar a rotação relativa em relação à montagem completa da grade. É mais fácil fazer isso em um mapa no qual as barras de grade aparecem. Observe que o mapa também pode ser invertido. Alinhe-o aproximadamente usando o menu Navegador > Girar mapa, com Inverter, se necessário.
   NOTA: O passo seguinte também pode acomodar uma inversão, mas fazê-lo com antecedência torna o seguinte muito mais fácil. Essa etapa pode ser repetida até que o alinhamento pareça satisfatório, mas não é necessário ser preciso.
4. Introduza pontos de registro para um alinhamento preciso. Coloque um número de pontos correspondentes em uma janela e, em seguida, na outra. Para cada ponto, marque Ponto de registro na parte superior da janela Navegador. Os pontos correspondentes serão rotulados com um índice ascendente, seguido de R1 ou R2 para a montagem da grade ou mapa importado, respectivamente.
   NOTA: O uso de grades do localizador torna esta etapa muito simples. Caso contrário, escolha recursos sólidos, como o marcador central ou os cantos dos quadrados da grade. Em princípio, três pontos são suficientes para um alinhamento bruto, mas mais pontos ajudam a compensar pequenos descompassos nas construções de montagem.
5. Se vários canais de um mapa CLEM forem desejados, por exemplo, cores fluorescentes diferentes ou fluorescência sem um fundo de campo brilhante, importe-os como na etapa 6.2 acima e altere os registros para 2. Dessa forma, eles herdarão os pontos de registro do primeiro mapa.
6. Imponha o registro pelo menu Navegador > Transformar itens. Os pontos de inscrição correspondentes passarão a constar em todos os mapas, que serão listados na Matrícula 1. Para alinhar visualmente, clique no menu Navegador > Girar Mapa. Observe que quando um mapa é carregado a partir da janela Navegador, ele não é girado automaticamente, a menos que a caixa Girar ao carregar esteja marcada. Ele sempre pode ser girado a partir da janela Navegador.
7. Agora deve ser possível colocar o marcador ou um ponto no mapa de fluorescência e mover o palco para o local correspondente na grade (Figura 13).

7.3D reconstrução

1. Isso envolve os mesmos passos básicos da tomografia de TEM: alinhamento da série de inclinação seguido tipicamente por retroprojeção. Várias plataformas de software estão disponíveis, e os dados podem ser tratados de forma semelhante aos dados de TEM, com a exceção de que a correção de CTF deve ser ignorada.
2. Aplicar normalizações de intensidade para aumentar a contribuição de projeções de alta inclinação ou para equilibrar uma mudança na iluminação durante a série, com a ressalva de que a informação quantitativa é afetada. O IMOD²⁶ funciona bem, por exemplo, enquanto o AreTomo²⁷ é muito útil para alinhamento sem fiduciário; onde partículas fiduciais estão presentes, o ClusterAlign²⁸ pode segui-las como aglomerados em vez de pontos individuais; isso é particularmente útil para dados STEM onde os pontos podem ser perdidos ou ocultos por recursos de alto contraste.
3. Seguir reconstrução com deconvolução 3D²⁹ para realce e denoising. Uma vez reconstruídos, representem os dados de volume STEM por qualquer um dos métodos padrão, como órteses ou segmentação isosuperficial. Notadamente, a distribuição da intensidade é unipolar, sem inversões de contraste ou franjas de Fourier que aparecem no ETM convencional de contraste de fase. Um meio interessante de representação dos tomogramas STEM, em geral, é inverter o campo brilhante (Figura 14). O efeito é o de "olhos de raios-X", vendo os objetos densos de interesse através da célula esclarecida³⁰.

Resultados

Uma montagem de grade completa preparada em STEM mostra as áreas com células de interesse (Figura 4). Observe que a imagem está em campo escuro, então buracos vazios parecem escuros. As células aparecem parcialmente brilhantes, onde os elétrons são espalhados em direção ao detector HAADF. Nas partes mais grossas, normalmente os centros ou perto das barras de grade, o contraste fica escuro novamente. Isso se deve ao espalhamento múltiplo, pelo qual os elétrons atingem ângulos não captados pelo detector. Na prática, essas áreas serão muito espessas para a tomografia.

A próxima etapa envolve mapas de magnificação intermediária (Figura 10). Estes são muitas vezes chamados de mapas de montagem média, ou mapas quadrados, referindo-se aos quadrados da grade em vez da forma. Mesmo no modo STEM de microssonda mais baixo, eles também serão adquiridos como imagens de montagem. Clicar no item na janela Navegador carrega a imagem do mapa na janela principal. Pontos específicos para aquisição de tomograma são escolhidos dentro desta área. Use o modo de visualização para localizar a área na ampliação da gravação. Lembre-se de que pode haver uma mudança lateral entre Visualizar e Gravar, dependendo das velocidades de varredura. Uma única série de inclinação pode ser gravada aqui. As mitocôndrias, por exemplo, muitas vezes podem ser identificadas na imagem Preview and Record (Figura 12).

Para a tomografia em lote, o palco percorrerá a grade e poderá não retornar exatamente ao mesmo local. Os mapas âncora são usados para garantir que as áreas desejadas do Registro sejam reidentificadas de forma confiável, combinando a imagem de visualização com uma exibição de ampliação inferior, mesmo que o movimento do palco tenha mudado. O PyEM^23,24 oferece uma alternativa mais rápida que certamente é recomendada^, mas ainda não faz parte da instalação padrão.

Na abordagem CLEM, um mapa de fluorescência pode ser usado para identificar as áreas de interesse para a tomografia. A fluorescência é adquirida externamente e deve ser registrada na montagem completa da grade. É útil ter as barras de grade e os furos visíveis, para que um composto de fluorescência mesclada + campo brilhante possa ser preparado antes da importação, por exemplo, no software GIMP (https://www.gimp.org) ou ImageJ³¹ (tome cuidado para que o ImageJ inverta o eixo vertical). Quando a faixa dinâmica da fluorescência é grande, pode ser difícil criar essa fusão sem saturação. Nesse caso, os dois mapas podem ser importados separadamente e, em seguida, registrados juntos, conforme descrito (Figura 13). Dessa forma, um ponto no mapa de fluorescência na janela Navegador, seguido de "Go To XY", traz o palco para a posição correspondente na grade montada no MET. Tome cuidado para que pequenas inconsistências na criação da montagem (ou do mapa de fluorescência, se também for uma montagem) levem a pequenos deslocamentos; portanto, para uma precisão ótima, a fluorescência deve ser re-registrada especificamente para o mapa quadrado. Muitas vezes é suficiente fazer esse registro a olho, com base em furos na película de suporte ou características compartilhadas com a imagem de luz de campo brilhante.

A reconstrução da série de inclinação resulta em um volume 3D (Figura 14). Este exemplo tem um tamanho de pixel de 2,042 nm, o que resulta em um campo de visão de ~4 μm. Destacam-se os depósitos de fosfato de cálcio (pontas de seta alaranjadas), devido ao maior número atômico em relação ao entorno. Os microtúbulos (pontas de setas vermelhas) podem ser traçados em todo o campo de visão. Além disso, as membranas mitocondriais interna e externa (pontas de setas verdes) podem ser claramente vistas. A actina pode ser observada como feixes ou como filamentos individuais. Para obter uma resolução mais isotrópica, a reconstrução pode ser processada por deconvolução.

Figura 1: Comparação entre ETM e STEM. No MET, o campo de visão é iluminado por um feixe quase paralelo, e a lente objetiva forma uma imagem ampliada na câmera. Para o crio-TEM, a abertura objetiva é aberta para passar as ondas de elétrons espalhadas (linha vermelha tracejada), que, com o desfoco, produzem contraste de fase por interferência com as ondas não espalhadas (verdes). STEM, por outro lado, rasticula um feixe focado através do espécime e coleta os elétrons espalhados de maneira pixel a pixel. Múltiplos detectores podem coletar elétrons espalhados em diferentes ângulos. Este número foi modificado de³⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de distorção da imagem no lado esquerdo devido à alta taxa de varredura. Observe a distorção marcada por pontas de seta amarelas, bem como, os orifícios ovais distorcidos no Quantifoil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diálogo de configuração de montagem para toda a montagem de grade. Escolha a ampliação e o número de peças em X e Y para que a área total atinja cerca de 2.000 μm para obter um mapa para a maior parte da grade. Escolha também Mover estágio em vez de deslocar imagem e Usar mapeamento de montagem, não Parâmetros de registro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: GridMap de baixa ampliação total gravado no modo STEM. As áreas quebradas aparecem completamente pretas na imagem de campo escuro. Áreas cinza escuras são provavelmente muito espessas e mal vitrificadas. Boas áreas candidatas para tomografia são brancas ou cinza claro neste exame. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Mudança para o processo de marcação. Um objeto reconhecível é marcado no mapa de baixa resolução por Adicionar pontos (38 nesta imagem). Observe a mudança entre o mapa de baixa resolução (círculo verde) e o mapa de média resolução (círculo laranja). Em seguida, o objeto é marcado pelo marcador (cruz verde, círculo vermelho) e a caixa de diálogo Deslocar para marcador é iniciada. A opção escolhida move todos os mapas em 245x pela mesma quantidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Diálogo de configuração da série Tilt para uma série de inclinação STEM. O esquema dose-simétrico é usado de -60° a +60° em passos de 2°. O foco automático é ignorado devido à alta profundidade de foco ao usar um ângulo de convergência baixo. Não há necessidade de refinar a eucentricidade como isso já foi feito antes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Caixa de diálogo de propriedades do arquivo para mapas de resolução média. Salve como um arquivo de pilha MRC, escolha inteiros e salve informações extras em um arquivo de metadados .mdoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Diálogo de configuração de montagem para salvar mapas de resolução média. Para um quadrado em uma grade de 200 malhas, que tem 90 μm de largura, uma área total de pelo menos 90 μm x 90 μm é aconselhável. Escolha Mover estágio em vez de deslocar imagem e Usar parâmetros de exibição no modo de baixa dose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Gravação do mapa de média resolução. Adquira na caixa de diálogo Itens para gravar mapas de média resolução. Escolha Mapeamento, Adquirir e salvar imagem ou montagem e marque Criar mapa do navegador. Em Tarefas antes ou depois da Primária, escolha Eucentricidade Bruta e Fina. Quando estiver sem assistência, escolha opcionalmente Nenhuma caixa de mensagem quando ocorrer um erro e Fechar válvulas de coluna no final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Imagem do mapa de média resolução. Mapa de média resolução (Square Map) gravado no modo STEM por uma montagem de 3 x 3. Os dois Mapas Âncora de média resolução para coleta de dados são indicados pelos quadrados azuis. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Dados da série de inclinação do lote. Adquira na caixa de diálogo Itens para coletar séries de inclinação em lote. Para coleta de dados de séries de inclinação, escolha Dados finais e Adquirir série de inclinação. Em Tarefas antes ou depois da Primária, marque Gerenciar Dewars/Vácuo (escolha as configurações apropriadas no menu Configuração), Realinhar ao Item, Eucentricidade Fina e Executar Script antes da Ação. Nas opções Geral, marque Nenhuma caixa de mensagem quando ocorrer um erro e Fechar válvulas de coluna no final (consulte 5.14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Inclinação de 0° de uma série de inclinação STEM de uma mitocôndria. As pontas de seta alaranjadas apontam para depósitos de fosfato de cálcio (grânulos matriciais), pontas de seta verdes para cristas e pontas de seta vermelhas para marcadores fiduciais de ouro de 15 nm. Barra de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Mapas crio-CLEM registrados. (A) O mapa STEM de média resolução (mapa quadrado, 26-A) é registrado no mapa STEM de baixa resolução (B), no mapa crio-FM do canal BF e no mapa crio-FM do canal GFP (D). Os nove pontos de registo (etiquetas 4-21) são apresentados no (E) Navigator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14: Renderização de volume. Renderização volumétrica de seções de (A) 60 nm e a (B) 40 nm de espessura através de um tomograma filtrado tipo SIRT (30 ciclos) em diferentes profundidades. O tamanho do pixel é de 2,048 nm, o que resulta em um campo de visão de aproximadamente 4 μm. Observe a densidade invertida em comparação com a Figura 12, o que significa que os recursos de alta intensidade são brilhantes. As pontas de seta laranja, branca, vermelha, verde e azul clara apontam para depósitos de fosfato de cálcio, ribossomos, microtúbulos, membrana mitocondrial interna e externa e filamentos de actina, respectivamente. Barra de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo deve auxiliar microscopistas de ciências da vida interessados em obter uma visão 3D de organelas intracelulares em regiões da célula que não são acessíveis à tomografia convencional de TEM. O mesmo protocolo também pode ser usado para tomografia STEM de cortes plásticos, com restrições relaxadas na exposição. O protocolo deve ser considerado como um ponto de partida e não como um conjunto de regras rígidas. De fato, o poder do STEM é sua flexibilidade; não há uma maneira certa de operá-lo.

Ressaltamos que STEM, por si só, refere-se apenas à sonda digitalizada e não define a formação da imagem. O contraste depende principalmente da configuração dos detectores. Os métodos mais simples empregam detectores com simetria axial, seja um disco centrado no eixo óptico ou um anel ao seu redor. Em geral, quando a iluminação incide diretamente sobre o detector, registramos uma imagem BF onde o espécime (espalhamento de elétrons) aparece escuro; por outro lado, quando o detector coleta apenas elétrons espalhados, registramos uma imagem DF onde o espécime denso parece brilhante. Quando o hardware adequado está disponível, o SerialEM pode adquirir e gravar esses dois sinais simultaneamente. Configurações ainda mais sofisticadas estão disponíveis, variando de detectores com vários segmentos a câmeras totalmente pixeladas. A imagem com contraste de fase pode ser obtida, por exemplo, avaliando-se a diferença entre os elementos detectores fora do eixo^32,33. A coleta de todo o padrão de espalhamento 2D (difração) por pixel define o método conhecido como 4D STEM³⁴, que permite a reconstrução de múltiplos contrastes de imagem a partir dos mesmos dados originais. O STEM quadridimensional permite a pticografia eletrônica, que fornece outro meio para obter contraste de fase³⁵.

Nós nos concentramos na modalidade STEM particular que consideramos ser mais útil para o estudo de organelas e células intactas ou cortes celulares de mícron grosso. Isso implica especificamente o uso de imagens BF com um pequeno ângulo de semiconvergência na iluminação e um ângulo de coleta relativamente grande no detector. A pequena convergência fornece uma grande profundidade de campo para que toda a amostra permaneça em foco durante toda a série de inclinação¹⁹. Na prática, com um bom estágio do microscópio, também pode eliminar a necessidade de ajuste do foco durante a aquisição. O preço é um compromisso na resolução, conforme descrito na seção 3 do protocolo. Sugerimos imagens 4k com uma sonda de ~2 nm, que com espaçamento de pixel de 1 nm atinge um campo de visão de 4 μm. No entanto, o leitor é fortemente encorajado a experimentar. A segunda consideração está na lateral do detector. Quando o disco de iluminação preenche o detector BF no eixo, o contraste de fase é suprimido e o contraste de espalhamento (amplitude) domina; Essa condição tem sido chamada de contraste incoerente de campo brilhante³⁶. A questão é por qual fração preencher, e a resposta depende da amostra. Uma amostra muito fina mostrará melhor contraste com o detector completamente preenchido (ou seja, o ângulo de coleta correspondente ao da iluminação), mas uma amostra mais espessa espalhará toda a intensidade, deixando um sinal ruidoso com contraste fraco. Uma regra prática útil é que quanto mais espessa a amostra, maior deve ser o ângulo de corte externo do detector de BF²¹. O tamanho e a posição do detector são, naturalmente, fixos, de modo que o tamanho do disco de difração é ajustado usando o comprimento da câmera, conforme descrito na seção 1. Se as configurações do amplificador do detector forem tais que o sinal preencha a faixa dinâmica, mas não satura sob iluminação direta (1.12.3), então o comprimento da câmera pode ser aumentado até que uma intensidade de sinal e contraste razoáveis sejam alcançados. Mais uma vez, o leitor é encorajado a experimentar. A arte, por assim dizer, está nos ângulos.

Outro parâmetro, não discutido no protocolo, é a tensão de aceleração do microscópio. A interação dos elétrons iluminantes com o espécime será mais forte em uma tensão mais baixa. Com tudo o mais igual, podemos esperar maior contraste em tensão mais baixa. Por outro lado, é o início de múltiplos espalhamentos dentro do corpo de prova que limita a espessura do corpo de prova utilizável, de modo que uma tensão mais alta permite o uso de amostras mais espessas. Esses efeitos são bastante sutis, no entanto. Nossas experiências até o momento com acelerações de 200 kV e 300 kV são semelhantes.

Considerando o que se pode esperar de STEM em termos de resolução, isso novamente depende da amostra e da configuração do detector. Usando uma abordagem de análise de partícula única, íons metálicos sobre ferritina poderiam ser localizados por STEM de campo escuro anular com uma precisão de alguns angstrom³⁷. Mais recentemente, a resolução subnanométrica foi obtida para amostras de vírus e proteínas usando imagens obtidas por contraste de fase diferencial integrado (iDPC) STEM³² , bem como pticografia³⁵. Para objetos únicos em espécimes celulares espessos, e com os métodos descritos aqui, essa alta resolução não é realista. A resolução ótima é o diâmetro da sonda, que se relaciona com o ângulo de semiconvergência como descrito. Outros fatores degradarão a resolução, particularmente uma amostragem de pixel grosso para alcançar um grande campo de visão, desalinhamentos na série de inclinação e espalhamento do feixe de sonda na transmissão. As imagens se comparam bem com a tomografia de corte plástico. Com a configuração descrita aqui, por exemplo, deve ser fácil ver o núcleo oco dos microtúbulos, mas não os protofilamentos individuais.

Para resumir, os métodos STEM e o hardware estão em fase de desenvolvimento. Podemos esperar que as inovações em imagem também impactem a tomografia, levando STEM a domínios que não foram acessíveis por outras técnicas. Esperamos que uma convergência com imagens de fluorescência criogênica correlativa baseada em métodos modernos de super-resolução óptica seja especialmente frutífera. A escala de organelas, 100-1.000 nm, é um alvo ideal para esses métodos emergentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM é uma plataforma de software livre para controle de microscópio e aquisição de dados.
		eletrônico de transmissão com capacidade STEM	O protocolo foi escrito com base na experiência com vários microscópios da Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica e Tecnai T20-F. Em princípio, deve ser aplicável também a outros fabricantes.

Microscópio