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Artigo de método

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

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DOI:

10.3791/65056

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30 de junho de 2023

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1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.

Resumo

Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.

Introdução

A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvores polinizadoras adequadas com genótipos distintos de SI para taxas de frutificação confiáveis e altas produtividades. Atualmente, existem dois tipos principais de SI, a autoincompatibilidade esporofítica (ISC), representada por Brassicaceae, e a autoincompatibilidade gametofítica (IGS), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.

A citricultura é uma das culturas frutíferas mais importantes do mundo. O sistema GSI à base de S-RNase é encontrado em muitos acessos de citros e influencia negativamente a taxa de frutificação9. Nesse sistema, o SI é controlado pelo locus S, um único locus polimórfico com dois alelos complexos que carregam determinantes do pistilo S e determinantes do pólen S 7. O determinante feminino é a ribonuclease S (S-RNase), e o masculino é o locus S F-box (SLF)7. As células do pistilo secretam proteínas S-RNase. As RNAs-S não-auto são reconhecidas pelas proteínas SLF, o que leva à ubiquitinação e degradação das S-RNases não-auto pela via do proteassoma 26S. Em contrapartida, as auto-S-RNases são capazes de acumular e inibir o crescimento do tubo polínico (TP), pois escapam das proteínas SLF e, portanto, são impedidas de ubiquitinzação10,11,12,13.

Aqui, relatamos uma técnica in vivo que é útil para identificar genótipos S e graus de compatibilidade e incompatibilidade polínica. O protocolo envolve a extração de DNA total das folhas e a predição do genótipo S por meio de primers S-específicos. Além disso, a coloração com azul de anilina e a microscopia de fluorescência seguida de polinização manual fornecem evidências do grau de compatibilidade e incompatibilidade. O procedimento de polinização semi in vivo, que envolve a polinização manual das flores em laboratório14,15, também foi adaptado para avaliar os graus de autocompatibilidade e incompatibilidade. No entanto, também utilizamos a polinização a campo seguida do ensacamento das flores para evitar a contaminação por pólen indesejado para permitir que os tubos polínicos se desenvolvam em condições naturais. Este protocolo é simples e direto e fornece as informações necessárias para a seleção bem-sucedida de árvores polinizadoras adequadas.

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Protocolo

1. Preparação para coloração de azul de anilina

  1. Prepare os seguintes reagentes e ferramentas para o experimento: escova polinizadora, pinça, lápis, papel sulfato, saco de polinização, sacos zip lock, clipes de papel, formaldeído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinças, conta-gotas de cola, lâminas de vidro, lamínulas, bisturis e polietilenoglicol.
  2. Preparar meio de germinação in vitro contendo 0,02% de MgSO4, 0,01% de KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% de H 3 de BO 3, 20% de PEG-4000 e 15% de sacarose. Ajuste o pH para 6,0-6,2 com KOH. Use um agitador magnético, pois o PEG-4.000 é difícil de dissolver.
  3. Prepare a solução fixadora de Carnoy, que é etanol absoluto e ácido acético glacial misturados na proporção de 3:1. Preparar solução de fixação de FAA, que é formaldeído a 40%, etanol a 80% e ácido acético glacial (1:8:1). Preparar solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4 M e azul de anilina, que é 0,1% de azul de anilina em 0,1 M K3PO4. Use um frasco de âmbar para armazenar a solução de azul de anilina porque é sensível à luz.

2. Coleta de pólen

  1. Conhecer antecipadamente o período de floração das árvores experimentais (Ma jia pummelo neste estudo). Colete flores maduras fechadas desde o início do período de floração até o estágio de pico de floração e coloque-as em um saco zip lock. As flores podem ser armazenadas a 4 °C na geladeira por 24 h.
  2. Leve as flores para o laboratório. Use uma pinça para coletar as anteras e coloque-as em uma placa de Petri contendo papel de filtro. Colete anteras de 20 a 30 flores.
  3. Colocar a placa de Petri contendo as anteras em estufa a 28 °C durante 24 h até os grãos de pólen secarem. Para a organização detalhada das flores, ver Hu et al.9.
  4. Coloque o pólen seco em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Guarde o pólen em um saco zip lock hermético contendo sílica gel (dessecante) que muda de cor. Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. O pólen seco pode ser armazenado em geladeira a −20 °C por 96 semanas16.

3. Teste de germinação in vitro de pólen

  1. Despeje 300 μL de meio líquido em uma placa de cultura celular ou na tampa de um tubo de centrífuga de 2 mL e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Incubar o pólen a 28 °C em ambiente escuro umedecido por 12 h.
  2. Remova o 1 mm superior da ponta de uma pipeta de 1.000 μL. Use a pipeta para absorver o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura e mova-o para o centro da lâmina do microscópio. Cubra-o com uma lamínula. Observe o espécime com microscópio invertido com objetiva de 10x.
  3. Realizar três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade polínica para cada réplica17. Gerencie visualmente a quantidade de pólen, certificando-se de que toda a placa de Petri esteja coberta com pólen e que cada placa de Petri tenha uma quantidade quase igual de pólen.
  4. O pólen germinado produz um tubo polínico com comprimento aproximadamente duas vezes maior que o seu diâmetro. Calcular a taxa de germinação a partir de 20 campos visuais, que dá a porcentagem de pólen germinado em todos os campos de pólen.

4. Polinização

  1. Escolha um dia ensolarado sem vento para polinização. Selecione 10 botões totalmente desenvolvidos prestes a abrir, descasque as pétalas com cuidado e tome cuidado para não machucá-las.
  2. Use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma e tome cuidado para não danificar o pistilo. Para a autopolinização, utilizar o pólen da mesma planta/cultivar. Para a polinização cruzada, utilizar o pólen de uma planta com genótipo diferente.
  3. Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato. Use um clipe de papel para selar o saco e evitar a polinização por pólenes genotipicamente distintos.
  4. Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas.

5. Amostragem, fixação e preservação

  1. Retirar os sacos de polinização aproximadamente 3-4 dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.
  2. Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe os estigmas fundidos em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incubar os estigmas e estilos na solução fixadora durante a noite a 4 °C.
  3. No dia seguinte, descarte a solução fixadora e lave os estigmas e estilos de duas a três vezes em etanol 95%.
  4. Transfira os estilos para uma solução de etanol a 70%. Certifique-se de que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 meses.

6. Coloração azul de anilina

  1. Lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada três a quatro vezes. Imergir em solução de NaOH 4 M, selar e incubar em banho-maria a 65 °C por 60 min. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho.
  2. Mergulhe os estilos em água destilada por 30 min. Descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela.
  3. Colocar a amostra num tubo de 10 ml, adicionar o azul de anilina até à imersão da amostra e corar durante 12 h no escuro.
  4. Observe o crescimento do tubo polínico com um microscópio de fluorescência.

7. Microscopia de fluorescência

  1. Antes de observar os espécimes, coloque a lâmina sobre uma mesa plana e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.
  2. Lave o estilo a ser observado com água destilada. Use um bisturi para dividi-lo em duas metades ao longo do eixo longitudinal. Coloque metade do estilo na lâmina de vidro e cubra com uma tampa.
  3. Coloque a lâmina no palco do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10x. Use o filtro DAPI (excitação: 325-375 nm; emissão: 435-485 nm). Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. Observe o crescimento do tubo polínico.

8. Identificação do genótipo S baseada em PCR

  1. Extrair o DNA genômico da amostra de estigma usando o método CTAB18.
    1. Coloque as folhas coletadas em um tubo de centrífuga de 2 mL e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Preparar HCl:EDTA:NaCl:H2O tampão na proporção de 1:1:3:5 e uma mistura de clorofórmio isoamílico na proporção de 24:1
    2. Adicionar 10 ml do tampão preparado, 0,2 g de CTAB e 200 μL de mercaptoetanol a um tubo de centrífuga de 50 ml e colocá-los em banho-maria a 65 °C durante 5 minutos até que a solução se torne límpida e transparente.
    3. Coloque as lâminas em uma argamassa, adicione as amostras congeladas, adicione nitrogênio líquido e triture. Colocar a amostra moída num tubo de centrifugação de 2 ml, adicionar 600 μL de mistura de CTAB, colocá-la em banho-maria a 65 °C durante 60 minutos e misturá-la de cabeça para baixo a cada 30 minutos.
    4. Adicionar 700 μL da mistura de álcool clorofórmio isoamílico (24:1) e misturar de cabeça para baixo durante 10 minutos. Centrifugar a 24 °C a 12.000 x g por 10 min, pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
    5. Adicionar 60 μL de solução de NaCl 5 M e 1 mL de etanol absoluto e misturar de cabeça para baixo. Congelar a -20 °C por 30 min e centrifugar a 24 °C e 9.000 x g por 5 min.
    6. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de solução de etanol a 70% e deixe em temperatura ambiente por 1-2 h. Centrifugar a 24 °C, 9.000 x g por 5 min, descartar o sobrenadante, aspirar o excesso de solução de etanol e secar ao ar por 5 min.
    7. Adicionar 100 μL de água estéril para dissolver, medir a concentração de ADN com um espectrofotómetro e congelar num congelador a -4 °C para armazenamento a longo prazo.
    8. Configure o sistema de reação RT-PCR. Preparar a seguinte mistura de reacção para 10 μL contendo 5 μL de 2x PCRMix, 0,25 μL cada de primer para a frente e para a reviravolta, 1 μL de ADN (100 ng/ μL) e 3,5 μL de H2O.
  2. Configure o programa PCR de acordo com a Tabela 1. O programa de PCR para todas as isoformas foi de 95 °C por 5 min 32x (95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 1 min) e 72 °C por 5 min. Separe os produtos em géis TAE-agarose 1,5% e fotografe9. Verifique o genótipo S especificado usando DNA genômico.

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Resultados

Para os experimentos realizados foram selecionadas flores maduras, coletadas as anteras, secas em estufa e o pólen germinado a 28°C por 12 h. A viabilidade polínica e as taxas de germinação foram quantificadas como mostra a Figura 1.

Os citros foram polinizados manualmente, e a compatibilidade e incompatibilidade polínica foram avaliadas pela coloração com azul de anilina e microscopia de fluorescência. O pólen compatível poderia germinar na superfície do estigma ...

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Discussão

Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes - uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificação, diminui a...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
etanol absolutoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
Anilina azulSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
Ácido bórico, H3< / sub>BO3< / sub>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
garrafa marromLabgic Technology Co., Ltd
Nitrato de cálcio tetrahidratado, Ca (NO3) 2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
Tubo centrífugoLabgic Technology Co., Ltd
de centrífugaLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0 (CAS)
Deixando cairJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ácido etilenodiaminotetracético, EDTASinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009617
FórcepsLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
formaldeídoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10010018
Moedor rápido de amostra totalmente automáticoShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdÁcido
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
Tubo de moagemShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
Álcool isoamílicoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10003218
Álcool isopropílicoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80109218
rótuloM & Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co., Ltd21903797
sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCÓPIO Vidro de coberturaZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318
clipes de papelM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
lápisM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
escova polinizadoraShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polietilenoglicol, PEG 6000Pequim Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polietilenoglicol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Hidróxido de potássio, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
Nitrato de potássio, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
bisturiJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Hidróxido de sódio, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
SacaroseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd
fábricasulfato
10021418 Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichloromethaneSinopharm, Ltd10006818
Trihydrate tribásico do fosfato tripotássico, K3PO4Shanghai Lingfeng O reagente químico Co., Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
fecha sacosM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-MercaptoetanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
tubos acético glacial Tissuelyser-96 Banho maria do termostato da da malha de Taizhou Jinnong do papel do de Reagente químico Co. de

Referências

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