Method Article

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

DOI:

10.3791/65056

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June 30th, 2023

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1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In This Article

Summary

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Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.

Abstract

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Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.

Introduction

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A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvore....

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Protocol

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1. Preparação para coloração de azul de anilina

  1. Prepare os seguintes reagentes e ferramentas para o experimento: escova polinizadora, pinça, lápis, papel sulfato, saco de polinização, sacos zip lock, clipes de papel, formaldeído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinças, conta-gotas de cola, lâminas de vidro, lamínulas, bisturis e polietilenoglicol.
  2. Preparar meio de germinação in vitro contendo 0,02% de MgSO4, 0,01% de KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% de H 3 de BO 3, 20% de PEG-4000 e 15% de sacarose. Ajuste o pH para 6,0-6,2 com K....

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Results

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Para os experimentos realizados foram selecionadas flores maduras, coletadas as anteras, secas em estufa e o pólen germinado a 28°C por 12 h. A viabilidade polínica e as taxas de germinação foram quantificadas como mostra a Figura 1.

Os citros foram polinizados manualmente, e a compatibilidade e incompatibilidade polínica foram avaliadas pela coloração com azul de anilina e microscopia de fluorescência. O pólen compatível poderia germinar na superfície do estigma .......

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Discussion

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Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes - uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificação, diminui a.......

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

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Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
etanol absolutoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
Anilina azulSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
Ácido bórico, H3< / sub>BO3< / sub>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
garrafa marromLabgic Technology Co., Ltd
Nitrato de cálcio tetrahidratado, Ca (NO3) 2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
Tubo centrífugoLabgic Technology Co., Ltd
de centrífugaLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0 (CAS)
Deixando cairJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ácido etilenodiaminotetracético, EDTASinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009617
FórcepsLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
formaldeídoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10010018
Moedor rápido de amostra totalmente automáticoShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdÁcido
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
Tubo de moagemShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
Álcool isoamílicoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10003218
Álcool isopropílicoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80109218
rótuloM & Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co., Ltd21903797
sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCÓPIO Vidro de coberturaZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318
clipes de papelM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
lápisM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
escova polinizadoraShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polietilenoglicol, PEG 6000Pequim Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polietilenoglicol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Hidróxido de potássio, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
Nitrato de potássio, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
bisturiJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Hidróxido de sódio, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
SacaroseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd
fábricasulfato
10021418 Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichloromethaneSinopharm, Ltd10006818
Trihydrate tribásico do fosfato tripotássico, K3PO4Shanghai Lingfeng O reagente químico Co., Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
fecha sacosM& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-MercaptoetanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)
tubos acético glacial Tissuelyser-96 Banho maria do termostato da da malha de Taizhou Jinnong do papel do de Reagente químico Co. de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al.

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Citrus Self IncompatibilityS Genotype AnalysisManual PollinationPollen CompatibilityAniline Blue StainingAgarose Gel ElectrophoresisFluorescence MicroscopyPollen Tube GrowthPCR GenotypingPollinizer Selection

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