O ensaio químico de reticulação BS3 revela expressão reduzida do receptor GABAA na superfície celular em cérebros de camundongos sob condições de estresse psicossocial crônico.
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Artigo de método
BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
A ansiedade é um estado de emoção que afeta variavelmente os comportamentos dos animais, incluindo as funções cognitivas. Sinais comportamentais de ansiedade são observados em todo o reino animal e podem ser reconhecidos como respostas adaptativas ou mal-adaptativas a uma ampla gama de modalidades de estresse. Roedores fornecem um modelo experimental comprovado para estudos translacionais abordando os mecanismos integrativos da ansiedade nos níveis molecular, celular e de circuito. Em particular, o paradigma do estresse psicossocial crônico provoca respostas desadaptativas mimetizando fenótipos comportamentais semelhantes aos da ansiedade/depressão que são análogos entre humanos e roedores. Enquanto estudos anteriores mostram efeitos significativos do estresse crônico no conteúdo de neurotransmissores no cérebro, o efeito do estresse nos níveis de receptores de neurotransmissores é pouco estudado. Neste artigo, apresentamos um método experimental para quantificar os níveis de superfície neuronal de receptores de neurotransmissores em camundongos sob estresse crônico, especialmente com foco nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA), que estão implicados na regulação da emoção e cognição. Usando o reticulador químico irreversível impermeável à membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), mostramos que o estresse crônico diminui significativamente a disponibilidade superficial dos receptores GABAA no córtex pré-frontal. Os níveis de superfície neuronal dos receptores GABAA são o processo limitante da taxa para a neurotransmissão GABA e poderiam, portanto, ser usados como um marcador molecular ou um proxy do grau de fenótipos ansiosos/depressivos em modelos animais experimentais. Esta abordagem de reticulação é aplicável a uma variedade de sistemas receptores para neurotransmissores ou neuromoduladores expressos em qualquer região do cérebro e espera-se que contribua para uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes à emoção e cognição.
Introdução
Os receptores de neurotransmissores estão localizados na superfície da membrana plasmática neuronal ou intracelularmente nas endomembranas (por exemplo, o endossomo, o retículo endoplasmático [RE] ou o aparelho trans-Golgi) e transitam dinamicamente entre esses dois compartimentos, dependendo de estados fisiológicos intrínsecos nos neurônios ou em resposta a atividades de redes neurais extrínsecas 1,2. Uma vez que os neurotransmissores recém-secretados provocam suas funções fisiológicas principalmente através do pool de receptores localizados na superfície, os níveis de receptores de superfície para um determi....
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Protocolo
Todo o trabalho com animais neste protocolo foi concluído de acordo com o Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, Capítulo A.22) e o Canadian Council on Animal Care (CCAC) e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.
1. Preparação dos animais
- Determinar o número de animais a serem usados nos experimentos e dividi-los em grupos apropriados ou coortes experimentais. Veja a seção de discussão para uma discussão sobre o tamanho do grupo, sexo e poder estatístico.
NOTA: Este protocolo é personalizado para camundongos (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de idade; tipicamente 20-30 g de peso corporal; n....
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Resultados
Para demonstrar a viabilidade do ensaio de reticulação BS3 para avaliar os níveis de superfície α5-GABAA R no PFC de camundongos, realizamos 10 μg de cada uma das amostras de proteína BS3-reticulada e não-reticulada em SDS-PAGE e analisamos as proteínas por western blot usando um anticorpo anti-α5-GABAAR (policlonal de coelho) (Figura 7). As amostras de proteína não-reticulada deram a quantidade total de α5-GABA A R em ~55 kDa, enquanto as amostras de proteína reticulad.......
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Discussão
Embora o impacto do estresse psicossocial crônico sobre comportamentos (i.e., emocionalidade e déficits cognitivos) e alterações moleculares (i.e., expressão reduzida de genes GABAérgicos e déficits associados na neurotransmissão GABAérgica) estejam bem documentados10, os mecanismos subjacentes a tais déficits precisam ser investigados mais adiante. Em particular, dado o estudo recente mostrando que o estresse crônico afeta significativamente o proteoma neuronal através da sobrecarga nas funções d.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem à equipe do biotério do CAMH pelos cuidados com os animais durante todo o estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), pelo Discovery Fund do CAMH (para T.P.), pela National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (prêmio NARSAD #25637 para E.S.) e pelo Campbell Family Mental Health Research Institute (para E.S.). E.S. é o fundador da Damona Pharmaceuticals, uma biofarmacêutica dedicada a trazer novos compostos gabaérgicos para a clínica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2,5 M (45%, p/v) Glicose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| 4x tampão de amostra SDS (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3) | Pierce | A39266 | Formato sem pesagem; 10 x 2 mg |
| Matriz cerebral | Ted Pella | 15003 | Para camundongo, 30 g adulto, coronal, 1 mm |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Sonda curva | Fine Science Tools | 10088-15 | Sonda de anatomia bruta; angular 45 |
| Água deionizada | milli-Q | EQ 7000 | Água ultrapura [resistividade 18.2 MΩ · cm @ 25 ° C; carbono orgânico total (COT) ≤ 5 ppb] |
| Ditiotreitol (DTT) | Papel | de filtro Sigma 10197777001 | |
| (3MM) | Fórceps Whatman | 3030-917 | |
| (grande) | Ferramentas de Ciências Finas | 11152-10 | Fórceps Graefe Extra Fino |
| (pequeno) | Ferramentas de Ciências Finas | 11251-10 | Dumont #5 Fórceps |
| GABA-A R alfa 5 anticorpo | Invitrogen | PA5-31163 | IgG policlonal de coelho; detectar sinal errôneo após a reticulação química |
| GABA-A R alfa 5 anticorpo C-terminal | R& D Systems | PPS027 | IgG policlonal de coelho; reage de forma cruzada com camundongo e rato |
| Glicina | Sigma | W328707 | |
| Cabra conjugada com peroxidase de rábano anti-coelho IgG (H + L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2< / sub>· 6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substituto (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Coquetel inibidor de protease | Membrana Sigma | P8340 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1620177 | |
| Tesoura (grande) | Ferramentas de Belas Ciências | 14007-14 | Tesoura Cirúrgica - Tesoura Serrilhada |
| (pequena) | Ferramentas de Ciência Fina | 14060-09 | Tesoura Fina - Cloreto de Sódio Afiado |
| (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Centrífuga refregenada de mesa | Eppendorf | 5425R | |
| Punção de tecido (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Punção de biópsia com êmbolo, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Buffer de transferência | Bio-Rad | 10026938 | |
| Rotador de tubo (LabRoller) | Labnet | H5000 |
Referências
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T.
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Reimpressões e permissões
