Este artigo apresenta um protocolo detalhado para dissecar ligamentos uterossacrais e outros tecidos do assoalho pélvico, incluindo colo uterino, reto e bexiga em camundongos, para expandir o estudo dos tecidos reprodutivos femininos.
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Artigo de método
Isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O prolapso de órgãos pélvicos (DPO) é uma condição que afeta a integridade, a estrutura e o suporte mecânico do assoalho pélvico. Os órgãos do assoalho pélvico são sustentados por diferentes estruturas anatômicas, incluindo músculos, ligamentos e fáscia pélvica. O ligamento uterossacro (USL) é uma estrutura crítica de suporte de carga, e a lesão da USL resulta em um risco maior de desenvolver POP. O presente protocolo descreve a dissecção de USLs murinos e dos órgãos do assoalho pélvico, juntamente com a aquisição de dados únicos sobre a composição bioquímica e função da USL usando espectroscopia Raman e a avaliação do comportamento mecânico. Camundongos são um modelo inestimável para pesquisa pré-clínica, mas dissecar a USL murina é um processo difícil e intrincado. Este procedimento apresenta uma abordagem para guiar a dissecção dos tecidos murinos do assoalho pélvico, incluindo o USL, para possibilitar múltiplas avaliações e caracterização. Este trabalho visa auxiliar a dissecção de tecidos do assoalho pélvico por cientistas e engenheiros básicos, ampliando assim a acessibilidade da pesquisa sobre as condições do USL e do assoalho pélvico e o estudo pré-clínico da saúde da mulher utilizando modelos de camundongos.
Introdução
Aproximadamente 50% das mulheres são acometidas pelo prolapso de órgãos pélvicos (POP)1,2. Cerca de 11% dessas mulheres enquadram-se nos critérios para serem submetidas ao reparo cirúrgico, que apresenta baixa taxa de sucesso (~30%)3,4. A DPO é caracterizada pela descida de algum ou de todos os órgãos pélvicos (bexiga, útero, colo uterino e reto) de sua posição natural devido à falha da USL e dos músculos do assoalho pélvico em fornecer suporte adequado5. Essa condição envolve disfunção anatômica e ruptura do tecido conjuntivo, ....
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Protocolo
Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo #2705, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Boulder. Camundongos C57BL/6J fêmeas com seis semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparo dos animais
- Eutanásia do animal seguindo o método aprovado institucionalmente.
NOTA: O presente estudo utilizou a inalação de CO 2 em alinhamento com as diretrizes da American Veterinary Medical Association (taxa de deslocamento de 30....
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Resultados
Cada passo da dissecção de um mouse selvagem é detalhado no vídeo associado e nas figuras relacionadas ao protocolo. Para este estudo, foram utilizados camundongos fêmeas C57BL/6J com 6 semanas de idade (Tabela Suplementar 1). Três grupos amostrais com USLs tratados com diferentes enzimas foram analisados: grupo controle (sem tratamento), grupo tratado com colagenase e tratado com condroitinase. O músculo liso, os nervos e os linfáticos da USL são circundados por uma MEC rica em colágenos fibrilares e gl.......
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Discussão
O efeito de danos estruturais nos tecidos reprodutivos femininos é pouco estudado, e um modelo animal de fácil acesso para pesquisa de POP é necessário. O camundongo é um modelo custo-efetivo que pode mimetizar estudos reprodutivos humanos16. Devido ao crescente interesse no estudo do aparelho reprodutor feminino, há necessidade de métodos que auxiliem o estudo desses tecidos. Para suprir essa necessidade, neste trabalho, estabeleceu-se um método para dissecar e preparar tecidos murinos do assoalh.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), pela NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), pela Schmidt Science Fellowship (C.L.), pela University of Colorado Research and Innovation Seed Grant Program (prêmio de 2020 para V.F., S.C. e K.C.), e pela Anschutz Boulder Nexus Seed Grant da Universidade do Colorado (para V.F. e K.C.). Agradecimento especial vai para o Dr. Tyler Tuttle para ajudar com o projeto da câmara de carregamento, bem como para os membros do laboratório Calve para discussões úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 11 Lâminas | Fisher | 3120030 | Lâmina removível |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluído a partir de concentração 10x |
| Condroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| LS004194 | Bioquímica Worthington | Tipo I de Colgenase | |
| Microscópio Confocal | Leica | STELLARIS 5 | Configuração vertical |
| Microscópio de dissecação | Leica | S9E | Com câmera |
| Dumont #5 Fórceps | Fisher | NC9626652 | Ponta fina |
| Camundongos fêmeas C57BL/6J | Jackson Cepa de laboratório | #: 000664 | |
| Micromanipulador | FemtoTools FemtoTools | FT-RS1002 Célula de | carga de 100 mN |
| Fórceps Curvado | FST Fisher | NC9639443 | Ponta Curva |
| FST Sharp 9 mm Tesoura | de | Dissecção | Fisher |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Mancha de amina livre |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Caixa de 50 toalhetes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Usado para preservação de tecidos |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Siga as instruções do fabricante |
| Placas de Petri 35 mm | Fisher | FB0875711A | Usado para tecido dissecado |
| Poliglactina Sutura 5-0 | Veter.Sut | VS385VL | Com agulha |
| Microscópio Renishaw InVia Raman | Renishaw | PN192(EN)-02-A | Com objetivas confocais |
| Plataforma de balanço | VWR | 10127-876 | plataforma de 2 camadas |
| Fisher | 52818 | Para dissecção | |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Mancha nuclear |
| Pinos T | Fisher | S99385 | Para dissecação |
| Pipetas de transferência | Fisher | 13-711-7M | Para dissecção |
| Underpads | Fisher | 22037950 | Para cobrir a almofada de dissecação |
Referências
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-in....
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Reimpressões e permissões
