Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.
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Artigo de método
Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O distúrbio cardíaco pró-arrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal. O coração de camundongo é uma espécie amplamente difundida para a modelagem de doenças arrítmicas cardíacas hereditárias, incluindo o CPVT. O mapeamento óptico simultâneo de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio (CaT) de corações de camundongos perfundidos por Langendorff tem o potencial de elucidar mecanismos subjacentes à arritmogênese. Comparada com a investigação em nível celular, a técnica de mapeamento óptico pode testar alguns parâmetros eletrofisiológicos, como a determinação da ativação, velocidade de condução, duração do potencial de ação e duração do CaT. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento óptico de alto rendimento de CaT e Vm em corações murinos selvagens e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e durante o desafio com isoproterenol. Esta abordagem demonstrou um método viável e confiável para estudar mecanisticamente a doença por CPVT em uma preparação ex vivo do coração de camundongos.
Introdução
O distúrbio cardíaco hereditário taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica (TVPo) após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal 1,2,3,4 . Evidências recentes após seu primeiro relato como síndrome clínica em 1995 implicaram mutações em sete genes, todos envolvidos na liberação de Ca 2+ no armazenamento reticular sarcoplasmático (SR) nessa condição: o RYR2 mais frequente....
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Protocolo
Camundongos selvagens machos de 10 a 14 semanas de idade ou camundongos RyR2-R2474S/+ (fundo C57BL/6) pesando 20-25 g são usados para os experimentos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais da Southwest Medical University, Sichuan, China (aprovação NO:20160930) em conformidade com as diretrizes nacionais sob as quais a instituição opera.
1. Preparo
- Soluções em estoque
- Solução-mãe de blebbistatina: Adicionar 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 100% no balão original contendo 2,924 mg de (-) blebistatina em pó para atingir uma concentração de 10 mM.
- S....
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Resultados
O mapeamento óptico tem sido uma abordagem popular no estudo de arritmias cardíacas complexas na última década. A configuração de mapeamento óptico consiste em uma câmera EMCCD, fornecendo uma taxa de amostragem de até 1.000 Hz e uma resolução espacial de 74 x 74 μm para cada pixel. Ele permite uma relação sinal-ruído bastante alta durante a amostragem do sinal (Figura 1). Uma vez que o coração perfundido por Langendorff atinge um estado estável e a carga do corante termina, o coração é colo.......
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Discussão
Com base em nossa experiência, as chaves para um mapeamento óptico de corante duplo bem-sucedido de um coração de mouse incluem uma solução e coração bem preparados, carregamento de corante, alcançar a melhor relação sinal-ruído e reduzir o artefato de movimento.
Preparação da solução
A solução de Krebs é essencial para um experimento cardíaco bem-sucedido. As soluções-mãe de MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) são preparadas com antecedência considerando sua abs.......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81700308 para XO e 31871181 para ML, e 82270334 para XT), Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (CN) (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT, e 2022NSFSC1602 a TC) e Laboratório Chave Estadual para Química e Engenharia Molecular de Recursos Medicinais (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 a XO), Bolsas MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE em Oxford (ML).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ | Fábrica de equipamentos médicos da Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N / A | Para filtrar a solução |
| tubo de centrífuga de 15 mL | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL de pipeta Pasteur | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| Seringa de 1 mL | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μ L Tubo de PCR | Sangon Biotech Co., Ltd. Xangai. China | F611541-0010 | Alicote as soluções de estoque para evitar o congelamento repetido e descongelamento do |
| tubo de centrífuga de 50 mL | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Armazene a solução de Tyrode em 4 & C para isolamento cardíaco de acompanhamento |
| Filtro de 585/40 nm | Tecnologia Chroma | N/A | Filtro para sinal de cálcio |
| Filtro passa-longo de 630 nm | Tecnologia Chroma | G15604AJ | para sinal de tensão |
| Avertin (2,2,2-tribromoetanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Reino Unido | T48402-100G | Para minimizar o sofrimento e o reflexo da dor |
| Blebistatina | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Estados Unidos | SLBV5564 | Desacoplador de excitação-contração para eliminar artefato de movimento durante o mapeamento |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | SLBK1794V | Para a solução de Tyrode |
| Banho termostático feito sob medida | MappingLab, Reino Unido | TBC-2.1 | Para manter a temperatura da solução |
| de perfusãoDimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvente para corantes |
| Pinça Dumont | Fábrica de equipamentos médicos de Xangai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China | YAF030 | |
| Software ElectroMap | Universidade de Birmingham | N / A | Quantificação de parâmetros elétricos |
| Câmera EMCCD | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Estados Unidos | A18G150001 | Adquirir imagens para sinais ópticos |
| ET525 / 36 filtro revestido por pulverização catódica | Tecnologia Chroma 319106 | Filtro de excitação | |
| Glicose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | SLBT4811V | Para a solução de Tyrode | |
| Heparina Sódica | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | Para evitar coágulos sanguíneos na artéria coronária |
| Fábrica | de equipamentos médicos de pinça de íris de Xangai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, Estados Unidos | HY-B0468 / CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | SLBS5003 | Para a solução de Tyrode |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, Reino Unido | 7355/7356 | A luz de excitação das sondas de fluorescência |
| Fonte de luz MacroLED Cairn | Research, Faversham, Reino Unido | 7352 | Controle os LEDs |
| Tesoura Mayo | Fábrica de equipamentos médicos da Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N / A | Amostragem de sinais ópticos |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | BCBS6841V | Para a solução da Tyrode |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido | M5337 | Conecte o estimulador elétrico e o software Spike2 |
| Estimulador de campo MyoPacer EP | Ion Optix Co, Milton, MA, Estados Unidos | S006152 | Estimulador elétrico |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | SLBS2340V | Para a solução de Tyrode |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | BCBW9042 | Para a solução de Tyrode |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos | SLBX3605 | Para a solução de Tyrode |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | Para amplificador de ECG |
| OmapScope5 | MappingLab, Reino Unido | N/A | Calcium alternans e análise de arritmia |
| Tesoura oftálmica | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, Reino Unido | 6970 | Dividir a luz de emissão para detectar Ca2+ e Vm simultaneamente |
| Bomba peristálica | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | Para bombear a solução |
| Placa de Petri | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos | 1899021 | Para aumentar a carga com Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Estados Unidos | 1971387 | Corante sensível à voltagem |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos | 1890519 | Indicador de cálcio |
| Tubo de sílica gel | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Conecte-se com a bomba peristáltica |
| Sutura de seda | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, China | 20172650032 | Para fixar a aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido | N/A | Para registrar e analisar dados de ECG |
| Estimulação MappingLab de eletrodo | , Reino Unido | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | para fonte de luz |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | Para fonte de luz |
Referências
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
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Reimpressões e permissões
