Otimização da tecnologia de processamento de óleo de carneiro Epimedii folium e teste de seu efeito no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra

Summary

Neste protocolo, a tecnologia de processamento de óleo de carneiro de Epimedii folium (EF) foi otimizada pela aplicação de uma metodologia experimental de superfície de resposta e delineamento Box-Behnken, e o efeito da FE bruta e otimizada extraída em água sobre o desenvolvimento embrionário do zebrafish foi preliminarmente investigado.

Abstract

Como uma medicina tradicional chinesa (MTC), Epimedii folium (EF) tem uma história na medicina e alimentos que é > 2.000 anos de idade. Clinicamente, EF processado com óleo de carneiro é frequentemente usado como um medicamento. Nos últimos anos, os relatos de riscos à segurança e reações adversas de produtos que utilizam EF como matéria-prima têm aumentado gradualmente. O processamento pode efetivamente melhorar a segurança da MTC. De acordo com a teoria TCM, o processamento de óleo de carneiro pode reduzir a toxicidade da FE e aumentar seu efeito tonificante nos rins. No entanto, há uma falta de pesquisa sistemática e avaliação da tecnologia de processamento de óleo de carneiro EF. Neste estudo, utilizou-se a metodologia experimental de superfície-resposta de Box-Behnken para otimizar os parâmetros-chave da tecnologia de processamento, avaliando o conteúdo de múltiplos componentes. Os resultados mostraram que a tecnologia ótima de processamento de óleo de carneiro da EF foi a seguinte: aquecer o óleo de carneiro a 120 °C ± 10 °C, adicionar o EF bruto, fritá-lo suavemente a 189 °C ± 10 °C até que esteja uniformemente brilhante e, em seguida, removê-lo e esfriar. Para cada 100 kg de EF, 15 kg de óleo de carneiro devem ser usados. As toxicidades e teratogenicidades de um extrato aquoso de FE processado em óleo bruto e óleo de carneiro foram comparadas em um modelo de desenvolvimento de embriões de peixe-zebra. Os resultados mostraram que o grupo de ervas brutas foi mais propenso a causar deformidades em peixe-zebra, e sua concentração de FE letal metade-máxima foi menor. Em conclusão, a tecnologia otimizada de processamento de óleo de carneiro mostrou-se estável e confiável, com boa repetibilidade. Em uma determinada dose, o extrato aquoso de EF foi tóxico para o desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, e a toxicidade foi mais forte para a droga bruta do que para a droga processada. Os resultados mostraram que o processamento de óleo de carneiro reduziu a toxicidade da FE bruta. Esses achados podem ser usados para melhorar a qualidade, uniformidade e segurança clínica da FE processada com óleo de carneiro.

Introduction

Epimedii folium (EF) é a folha seca de Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., ou Epimedium koreanum Nakai. A FE pode ser usada para tratar osteoporose, síndrome menopausal, nódulos mamários, hipertensão, doença coronariana e outras doenças¹. Como uma medicina tradicional chinesa (MTC), EF tem uma história na medicina e alimentação de mais de 2.000 anos. Devido ao seu baixo preço e notável efeito de tonificar os rins, é amplamente utilizado em medicamentos e alimentos saudáveis. EF é processado por meio de fritura com óleo de carneiro, um processo descrito pela primeira vez na Teoria de Processamento de Lei Gong escrita por Lei Xiao no período Liu Song². As eficácias do EF bruto e do EF frito são bem diferentes. A FE bruta dissipa principalmente o reumatismo, enquanto a FE frita aquece os rins para reforçar o yang³. Atualmente, a FE é amplamente utilizada como matéria-prima em medicamentos e alimentos saudáveis; há 399 medicamentos chineses patenteados listados, nove alimentos saudáveis importados e 455 alimentos saudáveis domésticos com FE como matéria-prima⁴. Este material medicinal tem grandes perspectivas de aplicação. No entanto, nos últimos anos, tem havido relatos crescentes de reações adversas e lesão hepática humana causadas por alimentos saudáveis e medicamentos patenteados na China que utilizam FE como matéria-prima, e estudos relacionados à toxicidade ^5,6,7 relataram que a FE como matéria-prima apresenta riscos potenciais à segurança.

Processamento medicinal chinês refere-se a técnicas farmacêuticas que podem efetivamente reduzir ou eliminar a toxicidade e melhorar a segurança dos MTCs. O método tradicional de processamento de EF é a fritura com óleo de carneiro, que reduz a toxicidade da EF e aumenta seu efeito de aquecimento dos rins e promoção do yang⁸. Este método de processamento está incluído na Farmacopeia Chinesa e em várias especificações de processamento¹. O processo de FE só é especificado da seguinte forma: para cada 100 kg de FE, 20 kg de óleo amniótico (refinado) é adicionado, e é de queima leve até ficar uniforme e brilhante¹. Não há parâmetros rigorosos do método de processamento EF nos padrões acima, portanto, as especificações de processamento local não foram unificadas para fornecer consistência. Portanto, seria útil realizar um estudo sistemático do processo de FE. Neste trabalho, o método experimental de superfície de resposta e delineamento Box-Behnken foi utilizado para otimizar a tecnologia de processamento de FE.

O planejamento experimental Box-Behnken é um método tipicamente usado para otimizar os fatores em um processo. Os parâmetros de extração podem ser otimizados estabelecendo-se a relação funcional entre fatores de ajuste de equações de regressão múltipla e valores de efeito. Recentemente, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar a extração da MTC ^5,6,7 e o processamento^9,10,11. Vários estudos relataram métodos de preparação de MTC envolvendo processamento de sal, processamento de vinho e fritura seguindo um projeto Box-Behnken, como para Psoraleae fructus ¹² processado com sal, Cnidii fructus¹³ processado em vinho e Cinnamomi ramulus^{torrado 14}. Este método tem tempo de teste reduzido, alta precisão de teste e é adequado para testes multifatoriais e multiníveis. O método é mais simples do que o método de ensaio de desenho ortogonal e mais abrangente do que o método de concepção uniforme¹⁵. As relações obtidas podem determinar o valor previsto de qualquer ponto de teste dentro da faixa de teste, o que é uma grande vantagem. Um modelo de peixe-zebra pode ser usado para testar se a FE é menos tóxica após o processamento.

Em estudos de toxicidade de MTC, o modelo do peixe-zebra tem a dupla vantagem do alto rendimento dos experimentos celulares e as semelhanças com os experimentos com^roedores16. Este modelo é caracterizado por seu pequeno tamanho, alta taxa de desova, ciclo reprodutivo curto e facilidade de reprodução. O modelo pode ser utilizado em experimentos sincrônicos em larga escala em placas de cultura celular, sendo a dosagem experimental do fármaco pequena, o ciclo experimental curto, o custo baixo e todo o processo experimental de fácil observação e^operação17. Os embriões de peixe-zebra são transparentes e se desenvolvem rapidamente. Portanto, a toxicidade e os efeitos teratogênicos de drogas sobre os tecidos viscerais em diferentes estágios de desenvolvimento podem ser observados diretamente ao microscópio¹⁸. A homologia gênica entre zebrafish e humanos chega a 85%¹⁸. A via de transdução de sinal do peixe-zebra é semelhante à do ser humano¹⁸. A estrutura biológica e a função fisiológica do zebrafish são muito semelhantes às dos mamíferos¹⁸. Portanto, um modelo de peixe-zebra para testes de fármacos pode fornecer animais experimentais confiáveis e totalmente aplicáveis a humanos¹⁹.

Neste estudo, utilizou-se a metodologia Box-Behnken design-response surface para otimizar a quantidade e a temperatura do óleo de carneiro e a temperatura de fritura utilizada na tecnologia de processamento EF, tendo como índices de avaliação os teores de icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C e baohuosídeo I. O modelo de zebrafish foi usado para explorar preliminarmente o efeito de um extrato de água EF sobre o desenvolvimento embrionário de zebrafish antes e após o processamento para avaliar o efeito de atenuação do processamento sobre a FE.

Protocol

Todos os experimentos relacionados a animais foram conduzidos com aprovação do Comitê de Ética em Experimentos do Instituto Chongqing de TCM (número do certificado de revisão ética em animais de laboratório: ZJS2022-03).

1. Determinação dos componentes bioativos

NOTA: A espécie utilizada nesta pesquisa foi Epimedium sagittatum, e as amostras foram coletadas no Condado de Fengdu, Chongqing. A amostra foi identificada como uma parte seca acima do solo de E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Máxima. por pesquisadores do Instituto de Medicina Biológica, Instituto Chongqing de Medicina Tradicional Chinesa.

1. Preparar a solução do produto de controlo pesando com precisão a quantidade adequada de cada substância de referência, a saber, icariina, epimedina A (EA), epimedina B (EB), epimedina C (CE) e baohuosídeo I (BI), utilizando uma balança analítica electrónica, e dissolver-se em metanol. Com eles, prepare uma solução-estoque de referência mista contendo 381,61 μg/mL de icariina, 124,14 μg/mL EA, 110,24 μg/mL EB, 1091,75 μg/mL EC e 184,98 μg/mL BI.
2. Prepare a solução do produto de teste esmagando o EF através de uma peneira nº 3. Colocar aproximadamente 0,2 g (utilizando uma balança analítica electrónica) de EF triturado num balão de Erlenmeyer com tampa, adicionar 20 ml de etanol diluído e, em seguida, ultra-onicar a 400 W de potência e 50 kHz de frequência durante 1 h. Agitar bem e passar por um filtro de membrana de 0,22 μm para obter a solução de ensaio.
3. Execute a cromatografia da seguinte forma. Utilizar cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com uma coluna C₁₈ com dimensões de 4,6 mm x 250 mm e um diâmetro interno de 5 μm. Use acetonitrila como fase móvel A e água ultrapura como fase móvel B. Use os seguintes parâmetros de eluição de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Use um comprimento de onda de detecção de 220 nm (para o detector usado, consulte Tabela de Materiais). Manter a temperatura da coluna em 30 °C e a velocidade da corrente em 1,0 mL/min e usar um tamanho de amostra de 10 μL.
4. Para investigar a relação linear, use a solução de referência mista como na etapa 1.1 diluída 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes e 32 vezes, para icariin, EA, EB, EC e BI, respectivamente. Use acetonitrila como fase A móvel e água ultrapura como fase B móvel.
5. Use os seguintes parâmetros de eluição de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Use um comprimento de onda de detecção de 220 nm (para o detector usado, consulte Tabela de Materiais). Manter a temperatura da coluna em 30 °C e a velocidade da corrente em 1,0 mL/min e usar um tamanho de amostra de 10 μL. Por fim, registre as áreas de pico. Plote a regressão linear com a concentração de referência (eixo x, μg/mL) como a abscissa e a área do pico (eixo y) como a ordenada usando software profissional (ver Tabela de Materiais).
6. Efectuar o ensaio de precisão medindo a solução de controlo mista seis vezes consecutivas por HPLC, utilizando as condições cromatográficas indicadas no passo 1.3. Registre o tempo de detecção e as áreas de pico de cada composição química e calcule os desvios padrão relativos (RSD) das áreas de pico para avaliar a precisão (reprodutibilidade) usando a fórmula abaixo:
   RSD% = desvio padrão (DP)/média aritmética dos resultados calculados (X) x 100 %
7. Para efectuar o ensaio de reprodutibilidade, pesar com precisão o pó EF e preparar seis partes da solução do produto de ensaio em paralelo, de acordo com o método do passo 1.2. Submeter as soluções preparadas a HPLC nas condições cromatográficas apresentadas no passo 1.3. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule as quantidades de cada composto a partir de uma curva padrão (áreas de pico versus concentrações). Calcule o RSD% como acima.
8. Para realizar o teste de estabilidade, armazenar as soluções de teste à temperatura ambiente e medir seu conteúdo pelo método HPLC descrito na etapa 1.3 em 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h após a preparação para avaliar a estabilidade. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule o RSD% das áreas de pico como acima.
9. Para realizar o teste de recuperação da amostra, pesar 0,2 g de pó EF em um frasco de Erlenmeyer com tampa para seis repetições. Adicionar uma quantidade adequada da solução de referência (a quantidade de substância de referência adicionada à amostra é equivalente a 100% do teor conhecido da amostra) e preparar a solução de ensaio de acordo com o método apresentado no ponto 1.2.
10. Injectar as amostras no cromatógrafo e analisar de acordo com as condições cromatográficas da etapa 1.3. Registre as áreas de pico e calcule os valores médios de recuperação e RSD% conforme abaixo:
    Taxa de recuperação de amostra com pico = (conteúdo da amostra com pico − conteúdo da amostra)/quantidade de amostra x 100%

2. Otimização da tecnologia de processamento de óleo de carneiro EF usando a metodologia Box-Behnken design-response surface

1. Selecione os parâmetros-chave no processamento de EF, como a quantidade de óleo de carneiro (A; 15%-35%), a temperatura do óleo de carneiro (B; 50-120 °C) e a temperatura de fritura (C; 80-300 °C), como fatores influentes. Use as pontuações abrangentes do conteúdo de icariin, EA, EB, EC e BI como índices de avaliação. A porcentagem de óleo de carneiro aqui é a porcentagem de massa.
2. Use o software de análise de superfície de resposta (consulte Tabela de Materiais) para projetar os experimentos de superfície de resposta Box-Behnken, explorar a superfície de resposta quadrática e construir um modelo polinomial de segunda ordem. Selecione o novo design Box-Behnken e defina a opção Fatores numéricos como 3; definir fatores A, B e C. Clique em Continuar. Defina a opção Respostas como 1 (que foi a pontuação abrangente). Clique em Continuar para concluir o design. Foram planejados 17 experimentos (Tabela 1).
   NOTA: Para as variáveis independentes e dependentes, juntamente com seus níveis baixo, médio e alto, consulte a Tabela 2.
3. Processar a FE de acordo com os parâmetros específicos da Tabela 1; por exemplo, para o número de ordem 1, pesar o óleo de carneiro refinado como 15% v/v e, em seguida, aquecer a 50 °C para derretê-lo. Adicione o EF bruto ao carneiro derretido, refogue em fogo brando (190 °C) até ficar uniformemente brilhante e, em seguida, retire e arrefeça. Realizou 17 operações experimentais. Um total de 17 grupos de produtos processados por EF foi obtido neste trabalho.
   NOTA: O óleo de carneiro é sólido à temperatura ambiente (25 °C) e derrete em líquido quando aquecido. O óleo de carneiro em estado líquido pode ser usado como excipiente.
4. Preparar as soluções de ensaio dos produtos transformados de acordo com o método descrito no ponto 1.2. Em seguida, analisá-los por HPLC de acordo com as condições cromatográficas descritas no passo 1.3. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule os teores de icariin, EA, EB, EC e BI em cada solução de teste em relação a uma curva padrão externa. Use a fórmula de cálculo de pontuação abrangente abaixo para calcular os escores abrangentes dos 17 grupos experimentais:
   Escore abrangente = Z/Z máx × 0,5 + BI/BI_máx × 0,5
   onde Z é a soma dos teores icariin, EA, EB e EC; Z_max é o valor máximo da soma dos teores de icariin, EA, EB e EC nos 17 grupos experimentais; BI é o conteúdo de BI; e BI_max é o valor máximo do conteúdo de IB nos 17 grupos experimentais.
5. Importe os resultados de pontuação abrangentes para os 17 grupos de experimentos para o software de análise de dados (consulte Tabela de Materiais) para analisar os dados experimentais. Nos itens de avaliação, selecione a opção de ordem de processo quadrática e a opção de tipo de modelo polinomial.

3. Testando o efeito do processamento no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra

1. Preparo da amostra
   1. Triture o EF bruto e processado através de uma peneira nº 3 (consulte a Tabela de Materiais). A 100 g de cada amostra EF, adicionar 1.000 mL de água ultrapura. Deixe o EF de molho por 0,5 h, ferva a água duas vezes por 30 min cada e, em seguida, filtre com papel de filtro.
   2. Combinar os filtrados e concentrar a amostra por aquecimento. Adicionar água ultrapura a um volume final de 100 mL para obter as soluções-estoque EF processadas (PEF, 1 g/mL) e EF bruta (CEF, 1 g/mL). Meça a quantidade de droga crua em cada solução de estoque.
   3. Coloque alíquotas de 1 mL, 1,5 mL, 2,5 mL, 5 mL e 7,5 mL em balões volumétricos de 10 mL e, em seguida, adicione água ultrapura ao volume para preparar as soluções de teste com concentrações de 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL e 750 mg/mL para o estudo de embriotoxicidade do peixe-zebra.
      NOTA: As concentrações das soluções de ensaio foram preparadas consultando a literatura pertinente ^20,21 e a realização de experiências preliminares para obter o gradiente de concentração de¹⁰ vezes utilizado na toxicologia normal. O CEF foi uma amostra não processada e o PFE foi uma amostra preparada com a melhor tecnologia de processamento descrita na seção 2.
2. Criação de peixes-zebra e tratamento de embriões²¹
   1. Adapte peixes-zebra selvagens (ver Tabela de Materiais) a uma temperatura controlada por 2 dias, mantenha-os em um aquário de fluxo em pH 7,0-7,4 e alimente-os duas vezes ao dia.
      NOTA: A inibição da formação de melanina em zebrafish foi obtida pela adição de 1-fenil-2-tiouréia em uma concentração de 0,003% (massa/volume) ao meio de cultura, o que manteve seus corpos transparentes para observação morfológica.
   2. Selecione peixes-zebra adultos férteis selvagens à noite e separe-os usando defletores em caixas de acasalamento. Retire os defletores na manhã seguinte e deixe o peixe desovar por 30 min. Coletados os óvulos fertilizados com um conta-gotas a cada 15 min. No total, foram coletados 520 embriões silvestres saudáveis. Manter os embriões de peixe-zebra em estufa a 28,5 °C por 24 h.
   3. Atribuir aleatoriamente os embriões saudáveis 24 h após a fertilização (hpf) a 13 grupos e, juntamente com um grupo controle, mergulhar separadamente em 10 mL de cada uma das seguintes soluções em uma placa de cultura: PFE: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL . Trate o grupo controle em branco com o meio como solução. Cada grupo continha 40 embriões neste estudo.
      NOTA: A composição média é de 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4,0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO 4 e ₄ mM NaHCO₃.
   4. Cultivar o peixe-zebra em uma incubadora de temperatura constante para até 120 hpf. Contar o número de larvas mortas todos os dias, observar a morfologia do órgão principal das larvas em cada grupo experimental sob um estereomicroscópio (barra de escala = 500 μm, ver Tabela de Materiais) e calcular a concentração de meia-morte (LC₅₀) do peixe-zebra a 72 hpf usando um software de análise de dados (ver Tabela de Materiais).

Results

Resultados da investigação metodológica
Foi observada uma relação linear entre a concentração de icariin, EA, EB, EC, BI e áreas cromatográficas dos picos (ver Tabela 3). Os valores de RSD% (n = 6) das áreas cromatográficas dos picos de icariin, EA, EB, EC e BI foram 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% e 1,06%, respectivamente, indicando que a precisão das medidas por CLAE foi boa. Os valores de RSD% (n = 6) dos teores de icariin, EA, EB, EC e BI foram 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% e 0,98%, respe...

Discussion

Variáveis independentes e determinação de seus níveis
A tecnologia de processamento EF só é descrita na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa e nas especificações locais de processamento de medicamentos chineses publicadas por 26 províncias, municípios e regiões autônomas em todo o país¹. A descrição envolve os seguintes passos: pegar óleo de carneiro e aquecê-lo para derreter, adicionar pedaços de EF, fritar com fogo lento até que fique uniforme e brilhante, retirá-lo e deixá-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrila	Fisher	197164
Baohuoside (B )	Fornecedor verificado - Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20042402
Coluna cromatográfica	Waters Corporation	Simetria C18
Design Software especializado	Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN	Versão de teste8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Desintegrador	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
Balança analítica eletrônica	Mettler-Toledo International Inc.
Epimedin A (EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
Epimedin C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
Etanol	Chongqing Chuandong Chemical (Grupo) Co., Ltd.
Software	GraphPad GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA	6.02
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.
Metanol	Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.
Membrana microporosa	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22μ m
Óleo de carneiro	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel software de escritório	Microsoft	Office Excel 2021
Peneira da farmacopeia	Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
Máquina de água pura	Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.	NO Sro 10A
Papel de filtro qualitativo	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	de 18cm
	, Oberkochen, Alemanha	de Stemi 2000
	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
Peixe-zebra	China Centro de Recursos de Peixe-Zebra (CZRC)	A cepa