Este protocolo descreve o processo de transdução de células T humanas primárias com um gene de interesse, garantindo a compatibilidade com as normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF).
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Artigo de método
Um procedimento compatível com GMP para a geração de células T modificadas por genes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O campo da Terapia Celular Adotiva (TCA) foi revolucionado pelo desenvolvimento de células geneticamente modificadas, especificamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR). Essas células modificadas têm mostrado respostas clínicas notáveis em pacientes com neoplasias hematológicas. No entanto, o alto custo de produção dessas terapias e a realização de extensas avaliações de controle de qualidade limitaram seu acesso a uma gama mais ampla de pacientes. Para abordar essa questão, muitas instituições acadêmicas estão explorando a viabilidade da fabricação interna de células geneticamente modificadas, ao mesmo tempo em que seguem diretrizes estabelecidas por agências reguladoras nacionais e internacionais.
A fabricação de produtos de células T geneticamente modificadas em larga escala apresenta vários desafios, particularmente em termos da capacidade de produção da instituição e da necessidade de atender às necessidades de quantidade de infusão. Um grande desafio envolve a produção de vetores virais em larga escala sob as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF), que muitas vezes são terceirizados para empresas externas. Além disso, a simplificação do processo de transdução de células T pode ajudar a minimizar a variabilidade entre os lotes de produção, reduzir custos e facilitar o treinamento de pessoal. Neste estudo, descrevemos um processo simplificado para transdução lentiviral de células T humanas primárias com um marcador fluorescente como gene de interesse. Todo o processo segue os padrões em conformidade com as BPF e é implementado dentro da nossa instituição acadêmica.
Introdução
O surgimento das Terapias Celulares Adotivas (ACT) e das células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) trouxe uma mudança revolucionária na prática clínica moderna, estabelecendo um novo paradigma de medicina personalizada. Particularmente, as células CAR-T direcionadas para CD19 têm demonstrado respostas clínicas excepcionais e representam a terapia de células T mais avançada para neoplasias malignas de células B 1,2,3,4,5. No entanto, as atuais terapias de células T modificadas por genes comercializad....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Patras e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Geral Universitário de Patras. Antes da obtenção dos espécimes biológicos, o consentimento informado foi obtido de indivíduos saudáveis. A avaliação da elegibilidade dos participantes foi conduzida de acordo com os procedimentos institucionais e em conformidade com as normas JACIE para leucaférese. Se este protocolo deve ser implementado em um ambiente clínico de ACT, todos os procedimentos devem seguir as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF) e ser realizados em salas limpas compatíveis com BPF. Precauções especiais de segurança são necessá....
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Resultados
Avaliação da eficiência de transdução
As células transduzidas foram avaliadas quanto à expressão do gene de interesse (GFP) por citometria de fluxo. Resultados representativos estão representados na Figura 1. No Dia 14, mais de 95% das células estavam CD3+, indicando ativação e expansão bem-sucedidas de células T. A eficiência de transdução dentro da população CD3+ foi medida em 58,7% (DT, Figura 1C) em compar.......
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Discussão
Os vetores lentivirais como veículos de liberação gênica são ferramentas importantes no campo da terapia celular e gênica devido à sua capacidade de transduzir células em divisão e não em divisão12. No entanto, a produção em larga escala de vetores lentivirais usando métodos compatíveis com GMP ainda é um desafio devido a vários parâmetros, como métodos de transfecção e etapas de purificação, que podem resultar em variabilidade nos lotes de lentivírus. Os centros acadêmicos frequentemente obtêm es.......
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Divulgações
N.S. elaborou o protocolo e escreveu o manuscrito que foi revisado e supervisionado por A.S.; K.S., G.A. realizou experimentos adicionais; D.K., M.L. forneceu valioso apoio nos experimentos e junto com V.Z., N.T. no processo de revisão. N.T. é membro da ProtATonce Ltd. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Esta investigação foi co-financiada pela União Europeia e fundos nacionais gregos através do Programa Operacional Competitividade, Empreendedorismo e Inovação, no âmbito da chamada RESEARCH - CREATE - INNOVATE (código do projeto: T2EDK - 00474). Também gostaríamos de expressar nossa gratidão à Choose Life Foundation por fornecer apoio contínuo ao GMP Lab "Dimitris Lois" do Instituto de Terapia Celular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa tratada com TC de 24 poços | Corning | 353047 | |
| tubo FACS de 5 mL | Corning | 352054 | |
| tubos Falcon de 50 mL | Greiner biomedica | 227261 | |
| placa tratada com TC de 6 poços | Corning | 353046 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| BD FACS CANTO II | BD Biosciences | V96300084 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Contador de Células | Corning Cell Cytosmart | J21E0081 | |
| Cryovials | Greiner biomedica | 122263 | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco' s Tampão com Fosfato Salino (D-PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA) | - | - | |
| Software FlowJo v10.6.2 | TreeStar | Inc-Gibco | |
| CTS Opti-MEM I Médio | ThermoFisher Scientific | A4124801 | |
| GMP rhIL-15 | Miltenyi Biotec | 170-076-114 | |
| GMP rhIL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-146 | |
| GMP rhIL-7 | Miltenyi Biotec | 170-076-111 | |
| Hanks' s Solução Salina Balanceada (HBSS) | Life Technologies | 14175 | |
| HEPA Whitley H35 Hypoxystation | Don Whitley Scientific | HA0315172H | |
| Albumina de Soro Humano (HSA) | Baxter | B05AA01 | |
| Junior LB 9509 Luminômetro | Portátil Berthold Technologies | 6506 | |
| Kit de Quantificação de Provírus Lenti-X | Takara Bio | 631239 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7811 | |
| MACS GMP T cell TransAct | Miltenyi Biotec | 170-076-156 | |
| Mouse Anti-Humano CD3 (Clone: UCHT-1) | BD Biosciences | 557706 | |
| MycoAlert Plus Kit de detecção | Lonza Bioscience | LT07-703 | |
| Fita de filme de fechamento ultra-expansível Parafilm 5 cm x 75 m | D.Dutscher | 90261 | |
| PeriStem PS-650-DB (bolsa de aférese) | Dispositivo Biomed | SC00816 | |
| Plaina Kryo10 Série III | Plaina | ||
| T75 frascos | Greiner biomedica | 658175 | |
| Trypan blue, solução a 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Vectofusin-1 GMP | Miltenyi Biotec | 170-076-165 | |
| X-VIVOTM 15 Meio de células hematopoiéticas sem soro | Lonza Bioscience | A1048501 |
Referências
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Brentjens, R., et al.
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Reimpressões e permissões
