A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.
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Artigo de método
Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os adipócitos armazenam energia na forma de triglicerídeos em gotículas lipídicas. Essa energia pode ser mobilizada via lipólise, onde as cadeias laterais dos ácidos graxos são sequencialmente clivadas da espinha dorsal do glicerol, resultando na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Devido à baixa expressão de glicerol quinase em adipócitos brancos, as taxas de recaptação de glicerol são desprezíveis, enquanto a recaptação de ácidos graxos é ditada pela capacidade de ligação de ácidos graxos de componentes do meio, como a albumina. Tanto a liberação de glicerol quanto de ácidos graxos em meios pode ser quantificada por ensaios colorimétricos para determinar a taxa lipolítica. Medindo esses fatores em vários momentos, pode-se determinar a taxa linear de lipólise com alta confiança. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a mensuração da lipólise em adipócitos diferenciados in vitro e tecido adiposo ex vivo de camundongos. Este protocolo também pode ser otimizado para outras linhagens celulares de pré-adipócitos ou tecido adiposo de outros organismos; considerações e parâmetros de otimização são discutidos. Este protocolo foi projetado para ser útil na determinação e comparação da taxa de lipólise de adipócitos entre modelos e tratamentos em camundongos.
Introdução
Os nutrientes em excesso são armazenados no tecido adiposo branco na forma de triglicerídeos no núcleo lipídico neutro das gotículas lipídicas. Os estoques de triglicérides são mobilizados via lipólise, processo pelo qual as cadeias laterais de ácidos graxos são sequencialmente clivadas por lipase triglicérides do tecido adiposo (ATGL), lipase hormônio-sensível (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL), resultando na liberação de ácidos graxos livres (AGL) e da espinha dorsal do glicerol 1,2. A lipólise é ativada pela sinalização de catecolaminas no tecido adiposo. Os terminais nervosos simpáticos liberam ....
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Protocolo
O uso de todos os animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Weill Cornell Medical College da Cornell University.
1. Preparação de tampões e placas coletoras
- Produzir albumina de soro bovino (BSA) a 5% dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol. Mexa suavemente o BSA para dissolver (agitar é contraproducente). Uma vez que a BSA esteja totalmente dissolvida, filtre-esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm. Conservar o suporte BSA a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
- Fazer concentrações de trabalho de me....
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Resultados
Medimos a taxa lipolítica basal e estimulada de adipócitos diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos primários do tecido adiposo branco inguinal foram diferenciados em adipócitos pelo tratamento de células confluentes com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de IBMX, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de troglitazona por 4 dias, seguidos por um tratamento adicional de 3 dias com 1 μg/mL de insulina. As células foram incubadas em meio sem insulina por 24 h antes do ensaio de lipólise. No tempo = 0h, as células foram lavadas uma .......
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Discussão
Aqui, fornecemos um protocolo básico para medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo ex vivo . Para quantificar a lipólise, é importante medir a taxa lipolítica na fase linear. Usamos uma técnica de amostragem seriada, onde uma grande fração de meios é coletada e substituída por meios frescos em intervalos regulares. Este método semiconservador permite a adição de BSA fresco com capacidade tamponante de AGL e retarda a inibição do feedback, estendendo a duração da lipólise linear. Este desenho exper.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo US National Institutes of Health grant R01DK126944 para S.M.R.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa tratada com cultura de tecidos de 24 poços | Corning Inc | 3527 | Deve ser tratada com cultura de tecidos para diferenciação de adipócitos |
| Placa de fundo plano de 48 poços com tampa | Corning Inc | 353078 | Pode ser tratada com cultura de tecidos |
| Placa de fundo plano de 6 poços com tampa | Corning Inc | 353046 | Pode ser tratada com cultura de tecidos |
| Placa PCR de 96 poços | EUA sceintific | 1402-9100 | Qualquer placa PCR cônica de 0,2 mL será conveniente |
| Albumina de soro bovino | Sigma Aldrich | A9418 | FFA livre BSA, como A8806, também é comumente usado. O BSA não deve ter FFA detectável, também variações de lote para lote no BSA podem afetar a taxa observada de lipólise |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 disponível de outros fornecedores |
| Incubadora de CO2 | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 deve idealmente ser definido como 10% para tecido adiposo, no entanto, 5% de CO2 também funcionará |
| DMEM, baixa glicose, sem vermelho de fenol | Thermofischer | 11054020 | Qualquer meio livre de vermelho de fenol deve funcionar, DMEM/F12, RPMI, mas deve conter capacidade tampão volátil, ou seja, |
| albumina de soro bovino livre de FFA | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Reagente de Glicerol Livre | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Solução Padrão de Glicerol | Sigma Aldrich | G7793 | Isso também pode ser feito diluindo o glicerol até a concentração desejada |
| HR Series NEFA Standard Solution | Fujifilm | 276-76491 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Reagente de cor A | Fujifilm | 999-34691 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Reagente de cor B | Fujifilm | 991-34891 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Solvente A | Fujifilm | 995-34791 | |
| Série HR NEFA-HR (2) Solvente B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Incubadora Microbiológica | Fischer Scientific | S28668 | Qualquer incubadora a 37C pode ser usada |
| Placas Nunc MicroWell de 96 Poços | Thermo Scientific | 269620 | Qualquer placa de 96 poços opticamente transparente, de fundo plano funciona |
| Tapete de Bancada de Laboratório de Silicone | VWR | 76045-300 | A placa de vidro também pode ser usada. Superfícies absorventes não são recomendadas |
| Espectrofotômetro/Leitor de Microplacas | Dispositivos moleculares | SpectraMax i3x | Qualquer leitor de placas que possa ler em 540, 550 e 660 mm funcionará |
| V Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Wipers | Kimberly-Clark | 41200 | Qualquer toalha de papel de alta qualidade funcionará |
Referências
- Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
- Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tiss....
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Reimpressões e permissões
