Ferritinofagia: Avaliação da Degradação Seletiva do Ferro por Autofagia em Fibroblastos Humanos

As proteínas WIPI (WD-repeat interagindo com fosfoinositídeos) são efetores PI3P evolutivamente conservados com papéis distintos na autofagia¹. As quatro proteínas WIPI humanas (WIPI1 a WIPI4) se dobram em hélices β de sete pás com duas regiões evolutivamente conservadas nas quais aminoácidos homólogos e invariantes se agrupam em locais opostos da hélice. Um local está alinhado com a região de ligação ao fosfoinositídeo na pá da hélice 5 e na pá 6. O outro local está alinhado com a região de interação proteína-proteína, onde os WIPIs se associam a membros distintos da maquinaria da autofagia ou fatores reguladores da autofagia².

O WIPI4 funciona no controle da regulação da autofagia acionada por energia e no nível de controle do tamanho do autofagossomo nascente em crescimento³. Uma mutação no gene WIPI4 , conhecida como WDR45, é causadora da neurodegeneração associada à hélice beta (BPAN), uma neurodegeneração com subtipo de acúmulo de ferro cerebral (NBIA) em pacientes humanos que é caracterizada por um halo de ferro hipointenso na substância negra e globo pálido⁴. A presença de depósitos anormais de ferro em pacientes com BPAN provoca danos neuronais que se traduzem em encefalopatia, atraso global do desenvolvimento, convulsões e, finalmente, parkinsonismo, demência e espasticidade⁵.

A homeostase do ferro é rigidamente regulada por múltiplos mecanismos celulares, com a concentração de ferro citosólico sendo controlada pelos níveis de expressão e funcionalidade de transportadores de ferro, transportadores de ferro e proteínas de armazenamento de ferro⁶ . A concentração de ferro citosólico, por sua vez, determina se vias de degradação como a ferritinofagia⁷ ou a depuração proteassômica da ferritina oxidada⁸ estão envolvidas.

Durante a ferritinofagia, a ferritina é recrutada seletivamente para autofagossomos pelo receptor de carga NCOA4 e direcionada para degradação lisossômica em resposta a baixos níveis intracelulares^{de ferro 7}. Dado o papel do WIPI4 na regulação do tamanho das membranas autofagossômicas³, é razoável prever que a perda dessa função específica pode afetar o sequestro seletivo de ferritina em autofagossomos e, portanto, a ferritinofagia. Estudar esta etapa fundamental no metabolismo do ferro pode abrir portas para opções terapêuticas para pacientes com BPAN; No entanto, protocolos comumente usados para estudar ferritinofagia em células humanas só agora estão sendo desenvolvidos.

Este artigo descreve um método baseado em fluorescência de alto rendimento para avaliar a ferritinofagia em células humanas. A aplicação deste ensaio a células BPAN derivadas de pacientes pode fornecer informações valiosas sobre como a ferritinofagia difere em comparação com células humanas saudáveis e pode servir como referência para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a essa doença humana rara.

1. Cultura e semeadura de células primárias

1. Pegue o frasco com células congeladas do tanque de nitrogênio líquido e mantenha-o no gelo até chegar à sala de cultura de células. Em um capuz previamente esterilizado, segure o frasco na mão para que a suspensão celular descongele. Ressuspenda as células e transfira-as para uma placa de cultura de células de 10 cm com 9 mL de DMEM pré-aquecido com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Agitar suavemente para que as células se distribuam uniformemente na placa e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂
2. Na manhã seguinte, olhe para as células para confirmar se elas estão presas. Mude o meio para DMEM fresco + 10% FCS + 1%P/S e deixe as células crescerem até atingirem 80% de confluência.
3. Remova o meio de cultura, lave 2x com DPBS, adicione 1 mL de tripsina à placa e incube-o a 37 ° C e 5% de CO₂ por 10 min. Adicione 9 mL de DMEM + 10% de FCS à placa e ressuspenda as células.
4. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL. Determine a contagem de células manualmente usando uma câmara de Neubauer e dilua a suspensão celular em DMEM + 10% FCS até que uma concentração celular de 40.000 células / mL seja alcançada.
5. Em uma placa de 96 poços com fundo de vidro, semeie 100 μL / poço da suspensão celular. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 16 h.

2. Tratamentos

1. Preparar os seguintes tratamentos de acordo com a Tabela de Materiais: meio de controlo, meio de controlo mais deferasiox (DFX) para quelação de ferro ou meio de controlo mais citrato de amónio férrico (FAC) para carregamento de ferro. Prepare todos os tratamentos na presença e ausência de um inibidor lisossômico (bafilomicina A1) para a avaliação do fluxo de ferritinofagia.
2. Retirar o meio de cultura da placa e substituí-lo pelo tratamento correspondente (100 μL/alvéolo).
3. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 6 h.

3. Fixação e coloração

1. Aspire o meio de tratamento e lave 2x com DPBS (Tabela de Materiais).
2. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 3,7% (PFA, Tabela de Materiais) por poço. Fixe as células por 20 min em temperatura ambiente no escuro.
3. Remova o PFA e lave as células 2x com PBS/T (Tabela de Materiais).
4. Bloqueio em PBS/T contendo albumina de soro bovino (BSA) a 1% por 1 h a 4 °C.
5. Prepare a mistura de anticorpos primários (Tabela de Materiais) em PBS/T (anticorpo de ferritina 1:50, anticorpo LAMP2 1:50).
6. Lave as células 2x com PBS/T e aplique 50 μL da mistura de anticorpos por poço. Envolva as placas com parafilme e incube durante a noite a 4 °C.
7. Na manhã seguinte, prepare a mistura de anticorpos secundários (Tabela de Materiais) (1:200) em PBS/T.
8. Lave as células 2x com PBS/T e aplique 50 μL da mistura de anticorpos secundários por poço. Incubar a 4 °C durante 1 h no escuro.
9. Preparar 5 μg/μL de solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Tabela de Materiais) em PBS à temperatura ambiente.
10. Lave as células 2x com PBS/T e adicione 100 μL/poço de coloração DAPI. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
11. Lave as células 2x com PBS e adicione 50 μL de PBS a cada poço. Embrulhar as placas com parafilme e conservar a 4 °C na obscuridade.

4. Imagem automatizada usando microscopia confocal de varredura a laser

1. Troque o PBS na placa por 50 μL de PBS fresco à temperatura ambiente.
2. Cubra a placa com papel alumínio e leve-a para a sala de microscopia.
3. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser, defina um suporte de amostra para placas de 96 poços na mesa do microscópio e selecione uma objetiva apropriada (aqui: 40x). Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
4. Ajuste as configurações de imagem (Tabela 1).
   1. No Smart Setup, selecione os lasers e filtros e atribua-os a faixas (Faixas 1-3) para obter qualidade e velocidade de imagem ideais (Tabela 1).
   2. Ao selecionar o tipo de experimento, clique em Tiles para habilitar a opção de selecionar e salvar as posições X,Y determinadas na placa.
   3. No módulo Imaging Setup , visualize os canais de aquisição, as trilhas atribuídas a eles e seus comprimentos de onda de excitação e emissão (Tabela 1).
   4. No módulo Modo de aquisição, selecione o seguinte: Velocidade de digitalização: 6; Direção: bidirecional; Média: 2x; Bits por pixel: 8.
   5. No módulo Canais , ajuste a potência do laser, o orifício e o ganho mestre para cada canal individualmente (Tabela 2). Ajuste esses parâmetros para obter imagens expostas corretamente sem saturá-las demais.
   6. Clique no módulo Estratégia de foco .
      1. Selecione Combinar foco automático de software e foco definido.
      2. Em Canal de referência e deslocamentos, selecione o canal mais estável/mais brilhante como referência (normalmente DAPI ou 488 nm).
      3. Em Repetições e frequência de eventos de estabilização, selecione Padrão.
   7. No módulo Foco automático do software , selecione o seguinte: Modo | Intensidade; Pesquisar | Inteligente; Amostragem | Multa; Intervalo relativo.
   8. Clique no módulo Blocos .
      1. Selecione Posições | posições únicas.
      2. Em Configuração avançada, navegue pela placa, identifique uma posição para geração de imagens e clique no botão + na guia Configuração de posição .
      3. Rotule cada posição com informações adicionais que serão registradas nos metadados da imagem. Para fazer isso, abra a guia Propriedades , clique no ícone de roda ao lado do menu suspenso Categoria e clique em Novo para abrir uma nova caixa de diálogo onde o novo nome da categoria deve ser inserido. Para atribuir uma categoria a uma determinada posição, selecione a posição, clique na guia Propriedades , vá para o menu suspenso Categorias e selecione o rótulo correspondente.
         NOTA: Recomenda-se criar uma categoria para cada tratamento para rotular cada posição com o tratamento a que as células foram submetidas.
      4. Em Sample Carrier, selecione Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0. Clique em Calibrar para calibrar o microscópio para a superfície da placa. Escolha entre calibração de 1 ou 7 pontos , dependendo das especificações do sistema.
      5. Em Opções, selecione uma sobreposição de bloco de 10%. Em Viajar em regiões de blocos, selecione Pente. Marque o seguinte: use a velocidade do estágio do controle do estágio, use a aceleração do estágio do controle do estágio e a pirâmide de imagens durante a aquisição.
5. Execute a aquisição de imagens e salve os resultados da imagem (arquivos czi) e os metadados da imagem (arquivos csv) em um disco rígido portátil.
6. Exporte as imagens como arquivos TIFF.

5. Análise de imagem de alto rendimento

1. Crie um arquivo de planilha de metadados separado com as seguintes colunas: Posição, Poço, Condição, Série e Conjunto. Os dados apropriados para preencher essas colunas são recuperados do arquivo de metadados original que vem da microscopia confocal de varredura a laser.
2. Baixe o software de código aberto CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
3. Inicie o CellProfiler 4.2.4 clicando duas vezes e importe o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1) arrastando e soltando.
   NOTA: Encontre abaixo as etapas para compilar o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1) para o reconhecimento automatizado de fibroblastos usando coloração DAPI (Módulo 1, reconhecimento de núcleos, consulte a Tabela 2) e fluorescência de fundo em células únicas derivadas de AF488 (Módulo 2, reconhecimento de células, consulte a Tabela 2). O reconhecimento de pontos (denominados objetos) é determinado pelo tamanho do ponto e pela intensidade de fluorescência do ponto sobre o fundo (Módulo 3, reconhecimento de pontos, consulte a Tabela 2). Finalmente, de acordo com os limites das células, os pontos reconhecidos pelo software são atribuídos às células correspondentes (Atribuir relações). Uma descrição detalhada de como implementar um pipeline CellProfiler para estudos de autofagia foi publicada anteriormente⁹. Além disso, a Tabela 2 contém as configurações do CellProfiler usadas neste estudo. Além disso, o Supplemental File 2 exibe o pipeline do CellProfiler (Supplemental File 1) com capturas de tela tiradas em ordem consecutiva e referentes aos módulos detalhados na Tabela 2.
4. Antes de adaptar o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1), arraste e solte arquivos de imagem .czi individuais ou uma pasta que contenha vários arquivos de imagem .czi no módulo Imagem .
5. Personalize o pipeline de reconhecimento de imagem. No módulo Nomes e Tipos , substitua o código c1-c3 por um código que permita ao software identificar e classificar as imagens de canal único a serem analisadas.
6. Ajuste as configurações de pipeline para os módulos IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects otimizando as entradas numéricas nos módulos. Os valores utilizados neste estudo são apresentados na Tabela 2.
7. Para acompanhar os ajustes, selecione a opção Modo de teste clicando no botão Iniciar modo de teste . Em seguida, clique no botão Etapa entre os módulos. Aguarde as janelas pop-up (a imagem de entrada original, os contornos de reconhecimento desenhados sobre a imagem original e o resultado da análise) mostrando como uma imagem seria analisada com as configurações que acabaram de ser inseridas.
8. Depois que o pipeline estiver otimizado, encerre o modo de teste. Execute a análise ativando o Modo de Teste de Saída, seguido de clicar no botão Analisar Imagens .
9. Após a conclusão da análise, verifique a precisão da detecção de células e pontos comparando as imagens de entrada com as saídas de sobreposição (limites de células, pontos) geradas pelo CellProfiler. Se não for satisfatório, ajustar os valores numéricos nos diferentes módulos (Tabela 2) até que o resultado da análise seja suficientemente preciso.

6. Análise dos dados

1. Depois de executar a análise, aguarde até que o software crie um conjunto de arquivos de texto tabulares com os resultados. Se estiver usando o pipeline CellProfiler fornecido (Arquivo Suplementar 1), procure os seguintes arquivos de saída:
   1. O arquivo CellProfilerOutputCells , que lista o número da imagem atribuído pelo software, o número da célula atribuída a células únicas, o nome do arquivo original e o caminho que indica onde os arquivos estão armazenados, o número de pontos (ferritina, LAMP2) por célula e a área média de pontos (ferritina, LAMP2) por célula.
   2. O arquivo CellProfilerOutputExperiment , que fornece informações sobre os detalhes técnicos relacionados ao experimento (por exemplo, a versão do software, os canais de imagem, as tags de metadados).
2. Abra esses arquivos como planilhas.
3. Prossiga para realizar a análise estatística das contagens de pontos e números de co-localização de pontos usando o software estatístico preferido (Tabela de Materiais).

Fibroblastos primários derivados da pele humana (F-CO-60) de doadores saudáveis (Figura 1A) foram preparados para avaliações de ferritinofagia usando tratamento com baflomicina A1 seguido de imunomarcação de ferritina endógena e LAMP2, análise automatizada de imagens e análise baseada em CellProfiler (Figura 1B).

A colocalização da ferritina endógena e do LAMP2 aumentou após o bloqueio da degradação lisossômica da ferritina pela adição de bafilomicina A1, compatível com sua capacidade de inibir as enzimas lisossômicas V-ATPase e, assim, bloquear a ferritinofagia7 (Figura 2). Além disso, o reconhecimento celular baseado em software, bem como o reconhecimento de ferritina e LAMP2, são mostrados como exemplo (Figura 2).

A este respeito, deve-se notar que o pipeline do CellProfiler descrito aqui é extremamente versátil e pode ser adaptado a leituras adicionais e/ou alternativas, como para avaliar os efeitos de certas mutações BPAN no crescimento celular, mitocôndrias ou outras organelas no contexto de sistemas funcionais de marcadores de célula única.

Figura 1: Visão geral experimental. Representação gráfica de (A) o processo de ferritinofagia e (B) o fluxo de trabalho experimental para avaliar a ferritinofagia em fibroblastos humanos primários derivados da pele, conforme descrito neste protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas. Fibroblastos humanos primários derivados da pele em meio de controle (condições alimentadas) na ausência (A) ou (B) presença de bafilomicina A1 foram submetidos a uma análise de imunofluorescência indireta usando anticorpos anti-ferritina e anti-LAMP2, enquanto os núcleos celulares foram corados com DAPI. Imagens de fluorescência exemplares adquiridas com automação de microscopia confocal de varredura a laser são apresentadas (barras de escala: 10 μm). Alterações na abundância e colocalização de ferritina e LAMP2 podem ser observadas após a inibição lisossômica após a administração de bafilomicina A1. A análise baseada no CellProfiler também é exibida, mostrando as sobreposições de imagem derivadas de software de reconhecimento de células (roxo), núcleos (azul), ferritina (verde), LAMP2 (vermelho) e pontos de ferritina/LAMP2 (amarelo) de colocalização. (C) Seções de imagem ampliadas (barra de escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: As configurações de microscopia confocal de varredura a laser usadas neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: As configurações numéricas do CellProfiler usadas neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: O pipeline do CellProfiler usado neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Exibição do pipeline do CellProfiler (consulte Arquivo Suplementar 1) com capturas de tela tiradas em ordem consecutiva (consulte a Tabela 2). Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.