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Ferritinofagia: Avaliação da Degradação Seletiva do Ferro por Autofagia em Fibroblastos Humanos

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DOI:

10.3791/65110

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23 de fevereiro de 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece instruções detalhadas para realizar avaliações de ferritinofagia baseadas em imunofluorescência de alto rendimento em fibroblastos humanos primários derivados da pele.

Resumo

Mutações no gene da autofagia WDR45 / WIPI4 são a causa da neurodegeneração associada à hélice beta (BPAN), um subtipo de doenças humanas conhecidas como neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro (NBIA) devido à presença de depósitos de ferro no cérebro dos pacientes. Os níveis intracelulares de ferro são rigidamente regulados por vários mecanismos celulares, incluindo o mecanismo crítico da ferritinofagia. Este artigo descreve como a ferritinofagia pode ser avaliada em fibroblastos humanos primários derivados da pele. Neste protocolo, utilizamos condições moduladoras de ferro para induzir ou inibir a ferritinofagia em nível celular, como a administração de bafilomicina A1 para inibir a função dos lisossomos e tratamentos com citrato férrico de amônio (FAC) ou deferasiox (DFX) para sobrecarregar ou esgotar o ferro, respectivamente. Esses fibroblastos tratados são então submetidos a imagens de alto rendimento e análise de localização quantitativa baseada em CellProfiler de ferritina endógena e marcadores autofagossômicos/lisossômicos, aqui LAMP2. Com base no nível de ferritina autofagossômica/lisossômica, conclusões podem ser tiradas sobre o nível de ferritinofagia. Este protocolo pode ser usado para avaliar a ferritinofagia em fibroblastos primários derivados de pacientes com BPAN ou outros tipos de células de mamíferos.

Introdução

As proteínas WIPI (WD-repeat interagindo com fosfoinositídeos) são efetores PI3P evolutivamente conservados com papéis distintos na autofagia1. As quatro proteínas WIPI humanas (WIPI1 a WIPI4) se dobram em hélices β de sete pás com duas regiões evolutivamente conservadas nas quais aminoácidos homólogos e invariantes se agrupam em locais opostos da hélice. Um local está alinhado com a região de ligação ao fosfoinositídeo na pá da hélice 5 e na pá 6. O outro local está alinhado com a região de interação proteína-proteína, onde os WIPIs se associam a membros distintos da maquinaria da autofagia ou fatores reguladores da autofagia2.

O WIPI4 funciona no controle da regulação da autofagia acionada por energia e no nível de controle do tamanho do autofagossomo nascente em crescimento3. Uma mutação no gene WIPI4 , conhecida como WDR45, é causadora da neurodegeneração associada à hélice beta (BPAN), uma neurodegeneração com subtipo de acúmulo de ferro cerebral (NBIA) em pacientes humanos que é caracterizada por um halo de ferro hipointenso na substância negra e globo pálido4. A presença de depósitos anormais de ferro em pacientes com BPAN provoca danos neuronais que se traduzem em encefalopatia, atraso global do desenvolvimento, convulsões e, finalmente, parkinsonismo, demência e espasticidade5.

A homeostase do ferro é rigidamente regulada por múltiplos mecanismos celulares, com a concentração de ferro citosólico sendo controlada pelos níveis de expressão e funcionalidade de transportadores de ferro, transportadores de ferro e proteínas de armazenamento de ferro6 . A concentração de ferro citosólico, por sua vez, determina se vias de degradação como a ferritinofagia7 ou a depuração proteassômica da ferritina oxidada8 estão envolvidas.

Durante a ferritinofagia, a ferritina é recrutada seletivamente para autofagossomos pelo receptor de carga NCOA4 e direcionada para degradação lisossômica em resposta a baixos níveis intracelularesde ferro 7. Dado o papel do WIPI4 na regulação do tamanho das membranas autofagossômicas3, é razoável prever que a perda dessa função específica pode afetar o sequestro seletivo de ferritina em autofagossomos e, portanto, a ferritinofagia. Estudar esta etapa fundamental no metabolismo do ferro pode abrir portas para opções terapêuticas para pacientes com BPAN; No entanto, protocolos comumente usados para estudar ferritinofagia em células humanas só agora estão sendo desenvolvidos.

Este artigo descreve um método baseado em fluorescência de alto rendimento para avaliar a ferritinofagia em células humanas. A aplicação deste ensaio a células BPAN derivadas de pacientes pode fornecer informações valiosas sobre como a ferritinofagia difere em comparação com células humanas saudáveis e pode servir como referência para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a essa doença humana rara.

Protocolo

1. Cultura e semeadura de células primárias

  1. Pegue o frasco com células congeladas do tanque de nitrogênio líquido e mantenha-o no gelo até chegar à sala de cultura de células. Em um capuz previamente esterilizado, segure o frasco na mão para que a suspensão celular descongele. Ressuspenda as células e transfira-as para uma placa de cultura de células de 10 cm com 9 mL de DMEM pré-aquecido com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Agitar suavemente para que as células se distribuam uniformemente na placa e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO2
  2. Na manhã seguinte, olhe para as células para confirmar se elas estão presas. Mude o meio para DMEM fresco + 10% FCS + 1%P/S e deixe as células crescerem até atingirem 80% de confluência.
  3. Remova o meio de cultura, lave 2x com DPBS, adicione 1 mL de tripsina à placa e incube-o a 37 ° C e 5% de CO2 por 10 min. Adicione 9 mL de DMEM + 10% de FCS à placa e ressuspenda as células.
  4. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL. Determine a contagem de células manualmente usando uma câmara de Neubauer e dilua a suspensão celular em DMEM + 10% FCS até que uma concentração celular de 40.000 células / mL seja alcançada.
  5. Em uma placa de 96 poços com fundo de vidro, semeie 100 μL / poço da suspensão celular. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 16 h.

2. Tratamentos

  1. Preparar os seguintes tratamentos de acordo com a Tabela de Materiais: meio de controlo, meio de controlo mais deferasiox (DFX) para quelação de ferro ou meio de controlo mais citrato de amónio férrico (FAC) para carregamento de ferro. Prepare todos os tratamentos na presença e ausência de um inibidor lisossômico (bafilomicina A1) para a avaliação do fluxo de ferritinofagia.
  2. Retirar o meio de cultura da placa e substituí-lo pelo tratamento correspondente (100 μL/alvéolo).
  3. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 6 h.

3. Fixação e coloração

  1. Aspire o meio de tratamento e lave 2x com DPBS (Tabela de Materiais).
  2. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 3,7% (PFA, Tabela de Materiais) por poço. Fixe as células por 20 min em temperatura ambiente no escuro.
  3. Remova o PFA e lave as células 2x com PBS/T (Tabela de Materiais).
  4. Bloqueio em PBS/T contendo albumina de soro bovino (BSA) a 1% por 1 h a 4 °C.
  5. Prepare a mistura de anticorpos primários (Tabela de Materiais) em PBS/T (anticorpo de ferritina 1:50, anticorpo LAMP2 1:50).
  6. Lave as células 2x com PBS/T e aplique 50 μL da mistura de anticorpos por poço. Envolva as placas com parafilme e incube durante a noite a 4 °C.
  7. Na manhã seguinte, prepare a mistura de anticorpos secundários (Tabela de Materiais) (1:200) em PBS/T.
  8. Lave as células 2x com PBS/T e aplique 50 μL da mistura de anticorpos secundários por poço. Incubar a 4 °C durante 1 h no escuro.
  9. Preparar 5 μg/μL de solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Tabela de Materiais) em PBS à temperatura ambiente.
  10. Lave as células 2x com PBS/T e adicione 100 μL/poço de coloração DAPI. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
  11. Lave as células 2x com PBS e adicione 50 μL de PBS a cada poço. Embrulhar as placas com parafilme e conservar a 4 °C na obscuridade.

4. Imagem automatizada usando microscopia confocal de varredura a laser

  1. Troque o PBS na placa por 50 μL de PBS fresco à temperatura ambiente.
  2. Cubra a placa com papel alumínio e leve-a para a sala de microscopia.
  3. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser, defina um suporte de amostra para placas de 96 poços na mesa do microscópio e selecione uma objetiva apropriada (aqui: 40x). Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
  4. Ajuste as configurações de imagem (Tabela 1).
    1. No Smart Setup, selecione os lasers e filtros e atribua-os a faixas (Faixas 1-3) para obter qualidade e velocidade de imagem ideais (Tabela 1).
    2. Ao selecionar o tipo de experimento, clique em Tiles para habilitar a opção de selecionar e salvar as posições X,Y determinadas na placa.
    3. No módulo Imaging Setup , visualize os canais de aquisição, as trilhas atribuídas a eles e seus comprimentos de onda de excitação e emissão (Tabela 1).
    4. No módulo Modo de aquisição, selecione o seguinte: Velocidade de digitalização: 6; Direção: bidirecional; Média: 2x; Bits por pixel: 8.
    5. No módulo Canais , ajuste a potência do laser, o orifício e o ganho mestre para cada canal individualmente (Tabela 2). Ajuste esses parâmetros para obter imagens expostas corretamente sem saturá-las demais.
    6. Clique no módulo Estratégia de foco .
      1. Selecione Combinar foco automático de software e foco definido.
      2. Em Canal de referência e deslocamentos, selecione o canal mais estável/mais brilhante como referência (normalmente DAPI ou 488 nm).
      3. Em Repetições e frequência de eventos de estabilização, selecione Padrão.
    7. No módulo Foco automático do software , selecione o seguinte: Modo | Intensidade; Pesquisar | Inteligente; Amostragem | Multa; Intervalo relativo.
    8. Clique no módulo Blocos .
      1. Selecione Posições | posições únicas.
      2. Em Configuração avançada, navegue pela placa, identifique uma posição para geração de imagens e clique no botão + na guia Configuração de posição .
      3. Rotule cada posição com informações adicionais que serão registradas nos metadados da imagem. Para fazer isso, abra a guia Propriedades , clique no ícone de roda ao lado do menu suspenso Categoria e clique em Novo para abrir uma nova caixa de diálogo onde o novo nome da categoria deve ser inserido. Para atribuir uma categoria a uma determinada posição, selecione a posição, clique na guia Propriedades , vá para o menu suspenso Categorias e selecione o rótulo correspondente.
        NOTA: Recomenda-se criar uma categoria para cada tratamento para rotular cada posição com o tratamento a que as células foram submetidas.
      4. Em Sample Carrier, selecione Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0. Clique em Calibrar para calibrar o microscópio para a superfície da placa. Escolha entre calibração de 1 ou 7 pontos , dependendo das especificações do sistema.
      5. Em Opções, selecione uma sobreposição de bloco de 10%. Em Viajar em regiões de blocos, selecione Pente. Marque o seguinte: use a velocidade do estágio do controle do estágio, use a aceleração do estágio do controle do estágio e a pirâmide de imagens durante a aquisição.
  5. Execute a aquisição de imagens e salve os resultados da imagem (arquivos czi) e os metadados da imagem (arquivos csv) em um disco rígido portátil.
  6. Exporte as imagens como arquivos TIFF.

5. Análise de imagem de alto rendimento

  1. Crie um arquivo de planilha de metadados separado com as seguintes colunas: Posição, Poço, Condição, Série e Conjunto. Os dados apropriados para preencher essas colunas são recuperados do arquivo de metadados original que vem da microscopia confocal de varredura a laser.
  2. Baixe o software de código aberto CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Inicie o CellProfiler 4.2.4 clicando duas vezes e importe o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1) arrastando e soltando.
    NOTA: Encontre abaixo as etapas para compilar o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1) para o reconhecimento automatizado de fibroblastos usando coloração DAPI (Módulo 1, reconhecimento de núcleos, consulte a Tabela 2) e fluorescência de fundo em células únicas derivadas de AF488 (Módulo 2, reconhecimento de células, consulte a Tabela 2). O reconhecimento de pontos (denominados objetos) é determinado pelo tamanho do ponto e pela intensidade de fluorescência do ponto sobre o fundo (Módulo 3, reconhecimento de pontos, consulte a Tabela 2). Finalmente, de acordo com os limites das células, os pontos reconhecidos pelo software são atribuídos às células correspondentes (Atribuir relações). Uma descrição detalhada de como implementar um pipeline CellProfiler para estudos de autofagia foi publicada anteriormente9. Além disso, a Tabela 2 contém as configurações do CellProfiler usadas neste estudo. Além disso, o Supplemental File 2 exibe o pipeline do CellProfiler (Supplemental File 1) com capturas de tela tiradas em ordem consecutiva e referentes aos módulos detalhados na Tabela 2.
  4. Antes de adaptar o pipeline do CellProfiler (Arquivo Suplementar 1), arraste e solte arquivos de imagem .czi individuais ou uma pasta que contenha vários arquivos de imagem .czi no módulo Imagem .
  5. Personalize o pipeline de reconhecimento de imagem. No módulo Nomes e Tipos , substitua o código c1-c3 por um código que permita ao software identificar e classificar as imagens de canal único a serem analisadas.
  6. Ajuste as configurações de pipeline para os módulos IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects otimizando as entradas numéricas nos módulos. Os valores utilizados neste estudo são apresentados na Tabela 2.
  7. Para acompanhar os ajustes, selecione a opção Modo de teste clicando no botão Iniciar modo de teste . Em seguida, clique no botão Etapa entre os módulos. Aguarde as janelas pop-up (a imagem de entrada original, os contornos de reconhecimento desenhados sobre a imagem original e o resultado da análise) mostrando como uma imagem seria analisada com as configurações que acabaram de ser inseridas.
  8. Depois que o pipeline estiver otimizado, encerre o modo de teste. Execute a análise ativando o Modo de Teste de Saída, seguido de clicar no botão Analisar Imagens .
  9. Após a conclusão da análise, verifique a precisão da detecção de células e pontos comparando as imagens de entrada com as saídas de sobreposição (limites de células, pontos) geradas pelo CellProfiler. Se não for satisfatório, ajustar os valores numéricos nos diferentes módulos (Tabela 2) até que o resultado da análise seja suficientemente preciso.

6. Análise dos dados

  1. Depois de executar a análise, aguarde até que o software crie um conjunto de arquivos de texto tabulares com os resultados. Se estiver usando o pipeline CellProfiler fornecido (Arquivo Suplementar 1), procure os seguintes arquivos de saída:
    1. O arquivo CellProfilerOutputCells , que lista o número da imagem atribuído pelo software, o número da célula atribuída a células únicas, o nome do arquivo original e o caminho que indica onde os arquivos estão armazenados, o número de pontos (ferritina, LAMP2) por célula e a área média de pontos (ferritina, LAMP2) por célula.
    2. O arquivo CellProfilerOutputExperiment , que fornece informações sobre os detalhes técnicos relacionados ao experimento (por exemplo, a versão do software, os canais de imagem, as tags de metadados).
  2. Abra esses arquivos como planilhas.
  3. Prossiga para realizar a análise estatística das contagens de pontos e números de co-localização de pontos usando o software estatístico preferido (Tabela de Materiais).

Resultados

Fibroblastos primários derivados da pele humana (F-CO-60) de doadores saudáveis (Figura 1A) foram preparados para avaliações de ferritinofagia usando tratamento com baflomicina A1 seguido de imunomarcação de ferritina endógena e LAMP2, análise automatizada de imagens e análise baseada em CellProfiler (Figura 1B).

A colocalização da ferritina endógena e do LAMP2 aumentou após o bloqueio da degradação lisossômica da ferritina pela adição de bafilomicina A1, compatível com sua capacidade de inibir as enzimas lisossômicas V-ATPase e, assim, bloquear a ferritinofagia7 (Figura 2). Além disso, o reconhecimento celular baseado em software, bem como o reconhecimento de ferritina e LAMP2, são mostrados como exemplo (Figura 2).

A este respeito, deve-se notar que o pipeline do CellProfiler descrito aqui é extremamente versátil e pode ser adaptado a leituras adicionais e/ou alternativas, como para avaliar os efeitos de certas mutações BPAN no crescimento celular, mitocôndrias ou outras organelas no contexto de sistemas funcionais de marcadores de célula única.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral experimental. Representação gráfica de (A) o processo de ferritinofagia e (B) o fluxo de trabalho experimental para avaliar a ferritinofagia em fibroblastos humanos primários derivados da pele, conforme descrito neste protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagens representativas. Fibroblastos humanos primários derivados da pele em meio de controle (condições alimentadas) na ausência (A) ou (B) presença de bafilomicina A1 foram submetidos a uma análise de imunofluorescência indireta usando anticorpos anti-ferritina e anti-LAMP2, enquanto os núcleos celulares foram corados com DAPI. Imagens de fluorescência exemplares adquiridas com automação de microscopia confocal de varredura a laser são apresentadas (barras de escala: 10 μm). Alterações na abundância e colocalização de ferritina e LAMP2 podem ser observadas após a inibição lisossômica após a administração de bafilomicina A1. A análise baseada no CellProfiler também é exibida, mostrando as sobreposições de imagem derivadas de software de reconhecimento de células (roxo), núcleos (azul), ferritina (verde), LAMP2 (vermelho) e pontos de ferritina/LAMP2 (amarelo) de colocalização. (C) Seções de imagem ampliadas (barra de escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: As configurações de microscopia confocal de varredura a laser usadas neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: As configurações numéricas do CellProfiler usadas neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: O pipeline do CellProfiler usado neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Exibição do pipeline do CellProfiler (consulte Arquivo Suplementar 1) com capturas de tela tiradas em ordem consecutiva (consulte a Tabela 2). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este método, que usa microscopia de fluorescência automatizada combinada com análise de imagem baseada em CellProfiler de acesso aberto9 para avaliar a localização intracelular dos principais fatores de ferritinofagia, foi projetado para fornecer informações valiosas sobre a eficácia da depuração de ferritina lisossômica por meio de autofagia seletiva, conhecida como ferritinofagia7. Este protocolo permite o manuseio de grandes conjuntos de amostras com várias linhagens celulares e tratamentos simultaneamente e a avaliação das leituras desejadas, como números de pontos de ferritina e números de pontos de ferritina colocalizando com LAMP2, que é um marcador lisossômico típico para avaliar o fluxo de ferritinofagia. No entanto, deve-se enfatizar aqui que a análise de imagem precisa e automatizada depende da qualidade da imagem, que, por sua vez, depende da especificidade do anticorpo e da imagem ideal. Portanto, a análise de imagem baseada em software só deve ser realizada com imagens de alta qualidade.

A modulação dos níveis de ferro nas células pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos que são ativados para regular a homeostase do ferro no contexto da doença. Este artigo descreve um método para estudar doenças BPAN em células derivadas de pacientes tratadas com agentes de carga de ferro e quelantes de ferro. O deferasiox (DFX) é um quelante de ferro conhecido e amplamente utilizado no campo10. Após a aplicação, ele aprisiona o ferro livre no citoplasma e desencadeia uma resposta celular à falta de ferro. Como o objetivo deste estudo era avaliar a ferritinofagia, privar as células de ferro foi uma maneira direta de promover a degradação da ferritina por meio da autofagia como um mecanismo de compensação para reabastecer o pool de ferro celular. O citrato de amônio férrico (FAC), ao contrário, é usado para carregar células com ferro. As células ativam a síntese de ferritina como resposta a concentrações excessivas e, portanto, tóxicas de ferro citosólico11. O citrato de amônio férrico, portanto, promove a síntese de ferritina e o aprisionamento de ferro dentro dos heteropolímeros de ferritina, que podem, por sua vez, ativar a ferritinofagia.

Para estudar o fluxo ferritinógico, neste protocolo, coramos seletivamente os principais atores do processo - ferritina e lisossomos (aqui marcados por LAMP2) - e avaliamos sua colocalização. Uma alta porcentagem de pontos de colocalização é indicativa de degradação lisossômica efetiva da ferritina. Para maximizar as informações recuperadas de tais experimentos, corantes adicionais ou anticorpos marcadores podem ser usados.

É importante observar que existem desafios técnicos inerentes a esse método. Fibroblastos primários derivados de diferentes doadores humanos podem proliferar e crescer de forma diferente in vitro. Portanto, para resultados comparáveis, células diferentes devem ser semeadas na mesma passagem. Portanto, é aconselhável realizar um experimento de teste antes de prosseguir com este protocolo para examinar os tempos de duplicação das células ou linhagens celulares que serão usadas.

Este método não se restringe ao estudo da ferritinofagia; simplesmente alterando os tratamentos e anticorpos usados, ele pode ser reaproveitado para avaliar várias outras vias de autofagia seletiva; por exemplo, a mitofagia pode ser examinada usando CCCP como indutor de estresse mitocondrial e anticorpos optineurina, LC3 e LAMP2 para a coloração12.

No geral, a combinação de aquisição automatizada de imagens e análise CellProfiler constitui uma ferramenta poderosa para a avaliação funcional de alto rendimento de fibroblastos humanos individuais. Isso é especialmente relevante para o estudo de doenças humanas, para as quais a análise e comparação de grandes coortes de células derivadas de pacientes e células derivadas de doadores saudáveis são de grande interesse.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (projeto E03). A Figura 1 foi criada usando BioRender.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linhas celulares
Fibroblastos humanos primários derivados da pele Biópsia de pele, doador humano saudável, Biobank University Clinic Tü bingen, Aprovação ética 389/2019BO2F-CO-60, passagem 9
Tratamentos de cultura celularConcentração final (composto)
Meio de controleDMEM 10%FCS(somente DMSO)
Meio de controle + bafilomicinaA1DMEM 10%FCS100 nM bafilomicina A1
Meio de controle + deferasiox (DFX)DMEM 10% FCS30 e micro; M DFX
Meio de controle + DFX + bafilomicinaA1DMEM 10% FCS30 µ M DFX, 100 nM bafilomicina A1
Meio de controle + citrato de amônio férrico (FAC)DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC
Meio de controle + FAC + bafilomicinaA1DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1
Material
Albumina [BSA] Fração VAppliChemA1391
Alexa 488 cabra a-coelhoLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 cabra um ratoLife TechnologiesA-11003
Bafilomicina A1Sigma Aldrich196000
BioLite Cell Culture tratado pratos de 10cmThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS sem cálcio nem magnésioGibco14190094
Soro bovino fetal (FCS)Gibco10437-028
Citrato de amônio férrico (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITIN (Baço Humano)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina)Life Technologies15140-122
Tripsina-EDTA (0,05%) com vermelho de fenolGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 placas de fundo de vidro de 96 poços # 0CellvisP96-0-N
< forte > Solução< / forte>
3,7% de paraformaldeído (PFA)PFA dissolvido em PBS, pH 7,5;
Bafilomicina A1 estoque 100 mMA1 diluída em DMSO
Citrato férrico de amônio (FAC) 100 mg/mL estoqueFAC diluído em água autodestilada dupla
PBS/TPBS, suplementado com 10% de Tween20 
PBS/T + BSAPBS, suplementado com 10% de Tween20, 1% de BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel Versão 16.50Microsoft Office Plus 365
Bafilomicina

Referências

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
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  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

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