Oligonucleotídeos Antisense como Ferramenta para Nocaute Prolongado de lncRNAs Nucleares em Linhagens Celulares Humanas

Resumo

Para analisar a função dos lncRNAs em processos dependentes do tempo, como instabilidade cromossômica, um efeito de knockdown prolongado deve ser alcançado. Para esse fim, é apresentado um protocolo que utiliza oligonucleotídeos antisense modificados para obter knockdown efetivo em linhagens celulares por 21 dias.

Resumo

Os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) desempenham papéis regulatórios importantes na expressão gênica no nível transcricional. Evidências experimentais estabeleceram que uma fração substancial de lncRNA se acumula preferencialmente no núcleo. Para a análise da função dos lncRNAs nucleares, é importante obter um knockdown eficiente desses transcritos dentro do núcleo. Em contraste com o uso de interferência de RNA, uma tecnologia que depende da maquinaria de silenciamento citoplasmático, uma tecnologia de oligonucleotídeo antisense (ASO) pode atingir o knockdown de RNA recrutando RNase H para os duplexes de RNA-DNA para clivagem de RNA nuclear. Ao contrário do uso de ferramentas CRISPR-Cas para engenharia genômica, onde podem ocorrer possíveis alterações no estado da cromatina, os ASOs permitem o knockdown eficiente de transcritos nucleares sem modificar o genoma. No entanto, um dos principais obstáculos ao knockdown mediado por ASO é seu efeito transitório. Para o estudo dos efeitos duradouros do silenciamento do lncRNA, é necessário manter o knockdown eficiente por um longo tempo. Neste estudo, foi desenvolvido um protocolo para obter um efeito knockdown por mais de 21 dias. O objetivo foi avaliar os efeitos cis-regulatórios do knockdown do lncRNA no gene codificador adjacente RFC4, que está relacionado à instabilidade cromossômica, uma condição que é observada apenas com o tempo e o envelhecimento celular. Duas linhagens celulares humanas diferentes foram usadas: PrEC, células epiteliais primárias normais da próstata, e HCT116, uma linhagem celular epitelial isolada de carcinoma colorretal, alcançando knockdown bem-sucedido nas linhagens celulares testadas.

Introdução

A grande maioria do genoma humano é transcrita, dando origem a uma grande variedade de transcritos, incluindo lncRNAs, que, em número, excedem o número de genes codificantes anotados no transcriptoma humano¹. LncRNAs são transcritos com mais de 200 nucleotídeos que não codificam proteínas ^2,3 e foram recentemente examinados por suas importantes funções regulatórias na célula⁴. Suas funções têm se mostrado dependentes de sua localização subcelular⁵, como o núcleo onde uma fração significativa de lncRNAs se ....

Protocolo

NOTA: Este protocolo destina-se a ser realizado apenas por pessoal de laboratório com experiência em procedimentos de segurança de laboratório. É essencial ler corretamente as fichas de dados de segurança de todos os reagentes e materiais utilizados neste protocolo antes de começar a manusear materiais e equipamentos perigosos. É essencial ler, compreender e cumprir todos os requisitos de segurança indicados no manual de segurança do laboratório da sua instituição ao longo de todo o protocolo. O descarte de todos os resíduos biológicos e químicos deve ser realizado de acordo com o manual de gerenciamento e descarte de resíduos da inst....

Resultados

No presente protocolo, o uso de ASOs foi adaptado ao KD de um lncRNA nuclear por um tempo prolongado nas linhagens celulares humanas PrEC e HCT116.

Certamente, o experimento KD foi bem-sucedido na linhagem celular PrEC por 21 dias do experimento, conforme observado na Figura 4. Para confirmar essa afirmação, além de analisar a expressão nos dias de passagem celular (Figura 4 A-C), analisamos os pontos de verificação e.......

Discussão

Como mencionado anteriormente, os lncRNAs têm funções regulatórias importantes na célula; assim, a desregulação desses transcritos pode estar envolvida em doenças. O câncer é uma dessas doenças caracterizada pela desregulação do lncRNA^43,44. Nesta doença, sabe-se que os lncRNAs desempenham importantes papéis regulatórios como oncogenes⁴⁵ ou supressores tumorais⁴⁶. Alguns deles estão.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de Centrífuga de 15ml - Tubos Cônicos de 15ml	Thermo Fisher Scientific	339650
Corning 100 mm TC-treated Culture Dish	Corning	430167	Área de superfície:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture Dish	Corning	430165	Área de superfície: 9 cm2
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Thermo Fisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC	30-2020
HCT 116 linha celular	ATCC	CCL-247
HEPES, 1M Buffer Solution	Thermo Fisher Scientific	15630122
Integrated DNA Technologies	NA	NA	https://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Thermo Fisher Scientific	13778150
McCoy's 5A medium	ATCC	30-2007
Células Epiteliais Primárias Humanas Normais da Próstata (HPrEC)	ATCC	PCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI	NA	NA	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Mídia de Soro Reduzida	Thermo Fisher Scientific	31985070
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific Célula
Epitelial da Próstata Basal Medium	ATCC	PCS-440-030
Kit de Crescimento de Células Epiteliais da Próstata	ATCC	PCS-440-040
Ferramenta on-line de complemento reverso	NA	NA	https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServer	NA	NA	http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
Tubos de microfífugas sem RNase, 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	AM12400
Enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	12604013	Solução de tripsina-EDTA
Solução neutralizante de tripsina	ATCC	PCS-999-004
Tripsina-EDTA para células primárias	ATCC	PCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38 / hg38)		NA NA	https://genome.ucsc.edu/