Artigo de método

Oligonucleotídeos Antisense como Ferramenta para Nocaute Prolongado de lncRNAs Nucleares em Linhagens Celulares Humanas

DOI:

10.3791/65124

⸱

1 de setembro de 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

Neste artigo

Resumo

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Para analisar a função dos lncRNAs em processos dependentes do tempo, como instabilidade cromossômica, um efeito de knockdown prolongado deve ser alcançado. Para esse fim, é apresentado um protocolo que utiliza oligonucleotídeos antisense modificados para obter knockdown efetivo em linhagens celulares por 21 dias.

Resumo

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Os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) desempenham papéis regulatórios importantes na expressão gênica no nível transcricional. Evidências experimentais estabeleceram que uma fração substancial de lncRNA se acumula preferencialmente no núcleo. Para a análise da função dos lncRNAs nucleares, é importante obter um knockdown eficiente desses transcritos dentro do núcleo. Em contraste com o uso de interferência de RNA, uma tecnologia que depende da maquinaria de silenciamento citoplasmático, uma tecnologia de oligonucleotídeo antisense (ASO) pode atingir o knockdown de RNA recrutando RNase H para os duplexes de RNA-DNA para clivagem de RNA nuclear. Ao contrário do uso de ferramentas CRISPR-Cas para engenharia genômica, onde podem ocorrer possíveis alterações no estado da cromatina, os ASOs permitem o knockdown eficiente de transcritos nucleares sem modificar o genoma. No entanto, um dos principais obstáculos ao knockdown mediado por ASO é seu efeito transitório. Para o estudo dos efeitos duradouros do silenciamento do lncRNA, é necessário manter o knockdown eficiente por um longo tempo. Neste estudo, foi desenvolvido um protocolo para obter um efeito knockdown por mais de 21 dias. O objetivo foi avaliar os efeitos cis-regulatórios do knockdown do lncRNA no gene codificador adjacente RFC4, que está relacionado à instabilidade cromossômica, uma condição que é observada apenas com o tempo e o envelhecimento celular. Duas linhagens celulares humanas diferentes foram usadas: PrEC, células epiteliais primárias normais da próstata, e HCT116, uma linhagem celular epitelial isolada de carcinoma colorretal, alcançando knockdown bem-sucedido nas linhagens celulares testadas.

Introdução

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A grande maioria do genoma humano é transcrita, dando origem a uma grande variedade de transcritos, incluindo lncRNAs, que, em número, excedem o número de genes codificantes anotados no transcriptoma humano1. LncRNAs são transcritos com mais de 200 nucleotídeos que não codificam proteínas 2,3 e foram recentemente examinados por suas importantes funções regulatórias na célula4. Suas funções têm se mostrado dependentes de sua localização subcelular5, como o núcleo onde uma fração significativa de lncRNAs se acumula e participa ativamente da regulação transcricional6 e da manutenção da arquitetura nuclear7, entre outros processos biológicos 8,9,10.

Para a caracterização funcional de lncRNAs nucleares, métodos capazes de induzir knockdown (KD) no núcleo devem ser usados, e os ASOs são uma ferramenta poderosa para silenciar transcritos nucleares. Em geral, ASOs são sequências de DNA de fita simples ~ 20 pares de bases de comprimento que se ligam ao RNA complementar pelo emparelhamento de bases Watson-Crick 11,12,13 e podem modificar a função do RNA por meio de mecanismos que dependem de sua estrutura química e modificações 13,14. As modificações químicas do ASO podem ser divididas em 2 grupos principais: modificações da espinha dorsal e modificações do anel de açúcar 2 '15, ambas destinadas a aumentar a estabilidade, conferindo alta resistência às nucleases, mas também a aumentar o efeito biológico pretendido13,16. Entre as modificações da espinha dorsal, as ligações fosforamidato morfolino (PMO), tiofosforamidato e morfolino são amplamente utilizadas para fins como interferência no splicing17,18 servindo como agentes bloqueadores estéricos19, mas não para induzir a degradação do transcrito. Outra modificação da espinha dorsal é a ligação fosforotioato (PS), uma das modificações mais comumente usadas em ASOs. Em contraste com as modificações mencionadas anteriormente, as ligações PS não interferem no recrutamento da RNase H12,20, permitindo assim o knockdown do RNA. No entanto, há também uma grande variedade de modificações do anel de açúcar 2 '21; no entanto, para fins de knockdown de RNA, entre as modificações que induzem efeitos de silenciamento eficientes estão os ácidos nucléicos bloqueados (LNAs) 22, 23 e a modificação de 2'-O-metil24. Embora os LNAs tenham se mostrado altamente eficazes para knockdown em comparação com outras modificações25, eles podem induzir efeitos indesejados, como hepatotoxicidade26 e indução de apoptose in vivo e in vitro27.

Para fins de knockdown de RNA, ASOs com as modificações adequadas mencionadas anteriormente podem recrutar RNase H1 e H220,28, e essas enzimas são recrutadas para híbridos de DNA-RNA e clivam o RNA alvo, liberando o ASO13. Os produtos de RNA dessa clivagem são então processados pelo maquinário de vigilância de RNA, resultando na degradação do RNA29 sem modificar a região genômica de interesse, em contraste com outras técnicas, como os sistemas CRISPR-Cas, onde modificações no estado da cromatina podem criar efeitos biológicos indesejados30. Apesar das vantagens da tecnologia ASO, os efeitos de silenciamento temporário devido à divisão celular ou degradação da ASO ao longo do tempo são um obstáculo a ser superado quando se estuda processos dependentes do tempo, como a instabilidade cromossômica (NIC)31.

Em particular, a NIC é definida como um aumento da taxa de alterações no número e estrutura cromossômica em comparação com as células normais32 e surge de erros na segregação cromossômica durante a mitose, levando a alterações genéticas que originam heterogeneidade intratumoral33 ao longo do tempo. Assim, a NIC não pode ser avaliada apenas pela descoberta de um cariótipo aneuploide. Para o estudo e avaliação adequados da NIC em cultura celular, é importante monitorar as células ao longo do tempo. Para o estudo dos efeitos de um lncRNA KD na NIC, é necessária uma metodologia que permita um efeito prolongado de KD. Para isso, ASOs foram utilizados neste protocolo, onde o lncRNA-RFC4 foi silenciado com sucesso nas linhagens celulares humanas HCT115 e PrEC por 18 e 21 dias, respectivamente. Este transcrito é um lncRNA não caracterizado de 1,2 kb de comprimento e sua localização genômica está no cromossomo 3 (q27.3). É adjacente ao gene codificador de proteínas RFC4, um gene associado à NIC em diferentes tipos de câncer humano 34,35,36.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo destina-se a ser realizado apenas por pessoal de laboratório com experiência em procedimentos de segurança de laboratório. É essencial ler corretamente as fichas de dados de segurança de todos os reagentes e materiais utilizados neste protocolo antes de começar a manusear materiais e equipamentos perigosos. É essencial ler, compreender e cumprir todos os requisitos de segurança indicados no manual de segurança do laboratório da sua instituição ao longo de todo o protocolo. O descarte de todos os resíduos biológicos e químicos deve ser realizado de acordo com o manual de gerenciamento e descarte de resíduos da instituição. Se não forem manuseados com cuidado e de acordo com práticas laboratoriais seguras, os materiais e equipamentos usados neste protocolo podem causar ferimentos graves. Siga sempre o manual do laboratório de segurança da instituição e os procedimentos de segurança.

1. Projeto de ASOs

  1. Projete manualmente os ASOs conforme descrito abaixo.
    1. Obtenha a sequência completa do transcrito alvo e analise-o no RNAfold WebServer, University of Vienna37 (Table of Materials), usando os parâmetros padrão no site para obter a estrutura secundária de energia livre mínima (MFE).
    2. Quando os resultados estiverem prontos, vá para o desenho da estrutura simples do MFE e clique em Exibir no Forna para abrir a estrutura secundária do MFE no site, e o software mostrará a estrutura secundária prevista do transcrito analisado.
    3. A partir da estrutura secundária MFE prevista, selecione uma região de 20 pb de comprimento no RNA, evitando G-strings (sequências de 3 guaninas seguidas) ao projetar os oligonucleotídeos. Para a seleção da melhor região-alvo para o ASO, use as regiões previstas para ter uma menor probabilidade de emparelhamento de bases internas (Figura 1).
    4. A partir da região selecionada de 20 pb, crie a sequência de complemento inversa. Crie manualmente o complemento reverso ou use a ferramenta online de complemento reverso (Tabela de Materiais). A sequência do complemento reverso será a ASO que deve ser sintetizada para o experimento.
    5. Analise a sequência ASO usando Nucleotide Blast NCBI (blastn) e UCSC Genome Browser on Human (GRCh38 / hg38). Certifique-se de que os ASOs não mostrem homologia com outros transcritos ou outras regiões genômicas no genoma humano.
      NOTA: A síntese e purificação do ASO foram realizadas por uma empresa comercial (Tabela de Materiais).
  2. Certifique-se de que os oligonucleotídeos sintetizados tenham as seguintes características.
    1. Garantir que o PS se ligue ao longo de toda a sequência do oligonucleotídeo38 (Figura 2A). Certifique-se de que os ASOs sejam quiméricos, com 5 nucleotídeos flanqueando as extremidades 5 'e 3' com anéis de açúcar modificados com 2'-O-metil ( Figura 2B ).
    2. Certifique-se de que os 10 nucleotídeos no meio tenham um anel de açúcar não modificado para suportar a ligação da RNase H ( Figura 2C ).
    3. Peça à empresa para realizar a purificação usando dessalinização padrão e HPLC de fase reversa (RP)39.
    4. Solicite a entrega ASO em formato liofilizado.
  3. Dissolva os ASOs liofilizados em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem cálcio e magnésio até uma concentração final de 200 μM. Armazene a -20 ° C.
  4. Preparar a solução de trabalho de ASO diluindo a massa concentrada até uma concentração de 20 μM. Preparar a diluição utilizando DPBS. Conservar a -20 °C.
    NOTA: Para este estudo, dois ASOs direcionados ao lncRNA-RFC4 foram projetados. Para otimização da concentração de ASO para transfecção e eficiência, foi seguido o protocolo de Zong et al.40 . Dois ASOs foram projetados e otimizados experimentalmente de acordo com o protocolo de Zong: ASO-lncRFC4 e ASO-lncRFC4-2. Após a otimização, um ASO efetivo direcionado ao lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, foi selecionado para o protocolo de knockdown prolongado (Figura Suplementar 1). Como controle positivo, foi utilizado um ASO eficiente previamente confirmado visando lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1. Para o controle negativo, foi projetado um ASO direcionado ao gene Escherichia coli lacZ, ASO-lacZ (número de acesso do NCBI: FN297865).

2. Preparação de células

NOTA: Trabalhe dentro da capa de cultura de células sempre que linhagens celulares, soluções, materiais ou qualquer produto a ser usado durante a manipulação da cultura de células for manuseado. Ao manipular líquidos para cultura de células, use sempre pipetas sorológicas esterilizadas ou micropipetas com pontas esterilizadas. Sempre cumpra e siga todos os requisitos de segurança indicados no manual de segurança do laboratório da instituição durante todo o protocolo.

  1. Preparar o meio de cultura celular completo para cada linhagem celular, conforme descrito abaixo.
    1. Para HCT116, prepare o meio 5A de McCoy com 10% de soro fetal bovino (FBS).
    2. Para PrEC, prepare o meio basal das células epiteliais da próstata com o kit de crescimento de células epiteliais da próstata.
  2. Use três placas de cultura de 100 mm (área de superfície de 55 cm2 ) para experimentos KD, uma para cada oligonucleotídeo a ser usado: ASO direcionado ao lncRNA, ASO a ser usado como controle positivo (ASO-MALAT1) e ASO a ser usado como controle negativo (ASO-lacZ).
  3. Use duas placas de cultura de 35 mm (9 cm2 de área de superfície) para serem usadas como pontos de verificação para KD entre as passagens celulares, uma das quais será transfectada com meios de transfecção completos para ASO-lncRFC4 e a outra para ASO-lacZ.
    NOTA: A transfecção foi planejada de acordo com os procedimentos e protocolos do fabricante do reagente de transfecção à base de lipídios (ver Tabela de Materiais) relatados anteriormente41,42.
  4. Semeie células com uma densidade de 1 x 104 células/cm2 em placas de cultura de células. Incubar a 37 °C na incubadora utilizando 5% de CO2 no ar até que as células atinjam 50% de confluência (quando 50% da superfície estiver coberta pela monocamada celular). Com uma confluência de 50%, as células estão prontas para serem transfectadas para este protocolo.
    NOTA: Para a transfecção de ASO-lncRFC4 e ASO-lacZ, foram semeadas uma placa de 100 mm e uma placa de 35 mm. Para a transfecção de ASO-MALAT1, apenas uma placa de 100 mm foi semeada (Figura 3A).

3. Transfecção

  1. Aqueça o meio sérico reduzido para 37 °C antes do início do procedimento.
  2. Para transfecção com ASO-lacZ e ASO-lncRFC4, siga as etapas descritas abaixo.
    NOTA: A transfecção com ASO-lacZ e ASO-lncRFC4 está planejada para células em uma área de superfície de 55 cm2; Quando diferentes áreas são usadas, os volumes podem ser ajustados de acordo. Este procedimento deve ser realizado para cada ASO utilizado nas mesmas condições.
    1. Prepare o tubo 1 dentro da capa de cultura de células dissolvendo 43,75 μL de ASO (20 μM) em 1,4 mL de meio de soro reduzido quente em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
    2. Prepare o tubo 2 dentro da capa de cultura de células misturando 18,66 μL de reagente de transfecção à base de lipídios com 1,4 mL de meio de soro reduzido quente em um tubo de microfífugo sem RNase de 1,5 mL.
    3. Incube os tubos 1 e 2 dentro da capa de cultura de células em temperatura ambiente por 10 min.
    4. Adicionar a solução contida no tubo 2 (reagente de transfecção + soro reduzido) directamente ao tubo 1 (ASO + soro reduzido) lentamente, gota a gota, para evitar espalhar os reagentes sobre a superfície do tubo.
    5. Incubar a mistura contida no tubo 1 durante 20 min no interior da coifa à temperatura ambiente.
    6. Adicione o meio sérico reduzido quente ao tubo 1 até um volume final de 8,75 mL.
      NOTA: O meio de transfecção final continha ASO a uma concentração de 100 nM.
    7. Retirar os meios de cultura da placa de cultura de células que contém as células a serem transfectadas e adicionar 7,5 ml dos meios de transfecção à placa de cultura de 100 mm e 1 ml à placa de cultura de 35 mm diretamente na monocamada de células, gota a gota. Certifique-se de que a mídia esteja uniformemente distribuída ao longo de toda a superfície, agitando suavemente o prato.
    8. Incubar em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 no ar por 6 h.
    9. Após 6 h de incubação no meio de transfecção, adicione 7,5 mL de meio completo às células na placa de cultura de 100 mm e 1 mL de meio completo às células na placa de cultura de 35 mm. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
  3. Para transfecção com ASO-MALAT1, realize os experimentos conforme descrito abaixo.
    NOTA: A transfecção com ASO-MALAT1 está planejada para células em uma área de superfície de 55 cm2.
    1. Prepare o tubo 1 dentro da capa de cultura de células dissolvendo 37,5 μL de ASO (20 μM) em 1,2 mL de meio de soro reduzido quente em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
    2. Prepare o tubo 2 misturando 16 μL de reagente de transfecção à base de lipídios com 1,2 mL de meio de soro reduzido quente.
    3. Incubar os tubos 1 e 2 à temperatura ambiente durante 10 min no interior da campânula de cultura de células.
    4. Adicionar a solução contida no tubo 2 (reagente de transfecção à base de lípidos + soro reduzido) directamente ao tubo 1 (ASO + soro reduzido) lentamente, gota a gota, para evitar espalhar os reagentes sobre a superfície do tubo.
    5. Incubar a mistura contida no tubo 1 durante 20 min no interior da coifa à temperatura ambiente.
    6. Adicione o meio sérico reduzido quente ao tubo 1 até um volume final de 7,5 mL. O meio de transfecção final continha ASO na concentração de 100 nM.
    7. Remova o meio de cultura do prato de cultura de células que contém as células a serem transfectadas e adicione 7,5 mL do meio de transfecção diretamente à monocamada de células gota a gota para garantir que o meio seja distribuído uniformemente ao longo de toda a superfície agitando suavemente o prato.
    8. Incubar a 37 °C em uma incubadora usando 5% de CO2 no ar por 6 h.
    9. Após 6 h de incubação com o meio de transfecção, adicione 7,5 mL de meio completo às células e incube em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
  4. Avalie as células microscopicamente a cada 12-24 h até que as células estejam prontas para a próxima rodada de transfecção.
    NOTA: Em seguida, a transfecção deve ser realizada quando as células atingirem uma confluência de 70%. Se necessário, troque o meio substituindo por meio de cultura completo.
  5. Quando as células estiverem 70% confluentes na placa de cultura de células, repita o procedimento (etapas 3.1 a 3.4) e execute a próxima rodada de transfecção.
    NOTA: Após a segunda transfecção, as células devem ser avaliadas microscopicamente a cada 12-24 h. A colheita e a passagem celular devem ser realizadas quando as células atingirem uma confluência de 80% a 85%. Se necessário, troque o meio substituindo por meio de cultura completo.

4. Colheita e passagem de células

NOTA: A coleta e a passagem de células são realizadas a cada 2 rodadas de transfecção e após a2ª,4ª e6ª rodadas de transfecção. O tempo médio de colheita nas células HCT116 foi de 6 dias após a1ª,3ª e5ª transfecções, e para as células PrEC, o tempo médio foi de 7 dias após a1ª,3ª e5ª transfecções. O ponto de tempo para a transfecção difere para ambas as linhagens celulares usadas neste protocolo. Para HCT116, as2ª,3ª,4ª,5ª e6ª transfecções são realizadas 3, 6, 9, 12 e 15 dias após a primeira transfecção, respectivamente. Para PrEC, as2ª,3ª,4ª,5ª e6ª transfecções são realizadas 3, 7, 10, 14 e 18 dias após a primeira transfecção, respectivamente. Consulte a linha do tempo na Figura 3 para verificar os pontos de tempo para transfecção, passagem e colheita.

  1. Realize a coleta e a passagem de células para os experimentos de KD em placas de cultura de 100 mm, conforme descrito abaixo.
    1. Prossiga para a colheita de células e passagem quando as células atingirem uma confluência de 80% a 85%.
    2. Aquecer o meio completo e lavar as soluções a 37 °C. Aqueça o reagente de dissociação à temperatura ambiente. Aquecer a solução neutralizante do reagente de dissociação à temperatura ambiente.
      NOTA: Soluções de lavagem, reagentes de dissociação e soluções neutralizantes diferem para as duas linhas celulares usadas neste protocolo. As células HCT116 são lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato) e dissociadas com solução de tripsina-EDTA. A neutralização do reagente de dissociação é realizada com meios de cultura completos para células HCT116. Para PrEC, a solução salina tamponada com HEPES é usada como solução de lavagem. A tripsina-EDTA é usada como reagente de dissociação. Para neutralização do reagente de dissociação, use solução neutralizante de tripsina.
    3. Dentro da capela de cultura, remova o meio de cultura da placa de cultura de células e lave suavemente com 3 mL de solução de lavagem, seguida de descartar a solução de lavagem. Repita esta etapa 2x.
    4. Adicionar 2 ml de reagente de dissociação de acordo com a linha celular à monocamada celular e incubar a 37 °C durante 3-5 min. Avalie as células a cada 2 minutos até que a dissociação esteja completa.
    5. Adicionar 2 ml de solução neutralizante de acordo com a linhagem celular e transferir todo o volume da suspensão celular da placa de cultura celular para um tubo de centrifugação cónico de 15 ml.
    6. Para extração de RNA, pegue 500 μL da suspensão celular e transfira-o para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo e prossiga para a etapa 5.1 para extração de RNA e RT-qPCR.
    7. Centrifugar o resto da suspensão celular a 120 x g durante 5 min à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante.
    8. Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de meio de cultura completo e proceda à contagem celular de acordo com os procedimentos padrão.
    9. Para a cariotipagem, semear células com uma densidade de 1 x 10,4 células/cm2 numa placa de cultura de células de 35 mm de diâmetro (área de superfície de 9cm2), incubar numa incubadora a 37 °C a 5% de CO2 no ar durante 24 h e proceder à cariótipagem de acordo com os procedimentos normalizados.
    10. Para continuar os experimentos de DK na próxima passagem celular, semeie células com uma densidade de 1 x 104 células / cm2 em uma nova placa de cultura de células de 100 mm de diâmetro. Este prato será a passagem número 2 para o experimento. Incubar a 37 °C em incubadora usando 5% de CO2 no ar até que as células atinjam uma confluência de 50%.
      NOTA: Se desejado, as células restantes podem ser usadas para extração e/ou congelamento de proteínas de acordo com os procedimentos padrão.
    11. Repita as etapas 3.1 a 4.1.10 para transfecção e colheita da passagem 2 e da passagem 3.
  2. Seguir o procedimento seguinte para a colheita de células para os pontos de controlo das experiências de DK em placas de cultura de 35 mm.
    NOTA: A colheita para o primeiro checkpoint no experimento KD é realizada 2 dias após o2º e4º procedimentos de transfecção.
    1. Aqueça o meio completo e as soluções de lavagem a 37 °C. Aqueça o reagente de dissociação à temperatura ambiente. Aquecer a solução neutralizante do reagente de dissociação à temperatura ambiente.
    2. Dentro da capa de cultura, remova o meio de cultura do recipiente de cultura de células e lave suavemente com 0,5 mL de solução de lavagem e, em seguida, descarte a solução de lavagem. Repita esta etapa 2x.
    3. Depois de descartar as soluções de lavagem, adicione 0,5 mL de reagente de dissociação de acordo com a linha celular e incube a 37 ° C por 3-5 min. Avalie as células a cada 2 minutos até que a dissociação esteja completa.
    4. Adicionar 0,5 ml de solução neutralizante de acordo com a linha celular e transferir todo o volume da suspensão celular da placa de cultura celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e colocá-lo sobre gelo.
    5. Prossiga para a etapa 5.1 para extração de RNA e qPCR.

5. Extração de RNA e RT-PCR

  1. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 2 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Lavar o pellet celular com 600 μL de PBS frio (4 °C).
  2. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 2 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    Use o pellet celular para extração de RNA de acordo com os procedimentos padrão.
  3. Proceder ao tratamento com DNase do ARN purificado de acordo com o procedimento padrão seguido no laboratório. No ponto de pausa, armazene o RNA purificado a -80 °C por longos períodos.
  4. Use o RNA para síntese de cDNA padrão com cada amostra de RNA obtida. No ponto de pausa, armazene o cDNA a -20 °C por longos períodos.
  5. Execute o qPCR padrão de acordo com as etapas descritas abaixo.
    1. Para qPCR, os oligonucleotídeos amplificam os seguintes transcritos: lncRNA de interesse, MALAT1 e um gene expresso constitutivamente como controle interno (Tabela 1). Para esse protocolo, a expressão RPS28 foi utilizada como controle interno.
    2. Realizar reações de qPCR para amplificar o controle interno, o lncRNA de interesse e MALAT1 usando cDNA da amostra ASO-LacZ. Este exemplo será usado para normalizar a expressão dos outros exemplos.
    3. Realize reações de qPCR para amplificar o controle interno RPS28 e o lncRNA de interesse usando cDNA da amostra ASO-lncRNA.
    4. Realize reações de qPCR para amplificar os controles internos RPS28 e MALAT1 usando cDNA da amostra ASO-MALAT1. Siga a configuração da reação e as condições do termociclador conforme descrito na Tabela 2.
    5. Analisar os dados de qPCR pela normalização ΔΔCt da expressão do transcrito de interesse em relação ao controle interno e, em seguida, normalizar a expressão do transcrito de interesse (lncRNA ou MALAT1) em relação à expressão do mesmo transcrito na amostra ASO-LacZ para obter o nível de expressão relativa do transcrito.

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Resultados

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No presente protocolo, o uso de ASOs foi adaptado ao KD de um lncRNA nuclear por um tempo prolongado nas linhagens celulares humanas PrEC e HCT116.

Certamente, o experimento KD foi bem-sucedido na linhagem celular PrEC por 21 dias do experimento, conforme observado na Figura 4. Para confirmar essa afirmação, além de analisar a expressão nos dias de passagem celular (Figura 4 A-C), analisamos os pontos de verificação e...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como mencionado anteriormente, os lncRNAs têm funções regulatórias importantes na célula; assim, a desregulação desses transcritos pode estar envolvida em doenças. O câncer é uma dessas doenças caracterizada pela desregulação do lncRNA43,44. Nesta doença, sabe-se que os lncRNAs desempenham importantes papéis regulatórios como oncogenes45 ou supressores tumorais46. Alguns deles estão...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manriquez, Rogelio é doutorando do Programa de Doutoramento em Ciências Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu uma bolsa CONACyT com o número CONACyT CVU: 581151.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de Centrífuga de 15ml - Tubos Cônicos de 15mlThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-treated Culture DishCorning 430167Área de superfície:55 cm2
Corning 35 mm TC-treated Culture DishCorning 430165Área de superfície: 9 cm2
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 linha celularATCCCCL-247
HEPES, 1M Buffer SolutionThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Células Epiteliais Primárias Humanas Normais da Próstata (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Mídia de Soro ReduzidaThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific Célula
Epitelial da Próstata Basal MediumATCCPCS-440-030
Kit de Crescimento de Células Epiteliais da PróstataATCCPCS-440-040
Ferramenta on-line de complemento reversoNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
Tubos de microfífugas sem RNase, 1,5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
Enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenolThermo Fisher Scientific12604013Solução de tripsina-EDTA
Solução neutralizante de tripsinaATCCPCS-999-004
Tripsina-EDTA para células primáriasATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38 / hg38)NA NAhttps://genome.ucsc.edu/

Referências

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