Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.
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Artigo de método
Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nas últimas décadas, além das células cultivadas em monocamadas, esferoides tumorais tridimensionais têm sido desenvolvidos como uma ferramenta potencialmente poderosa para a avaliação de drogas antineoplásicas. No entanto, os métodos convencionais de cultura não têm a capacidade de manipular os esferoides tumorais de forma homogênea em nível tridimensional. Para abordar essa limitação, neste artigo, apresentamos um método conveniente e eficaz de construção de esferoides tumorais de tamanho médio. Adicionalmente, descrevemos um método de análise baseado em imagens usando software de análise baseado em inteligência artificial que pode escanear toda a placa e obter dados sobre esferoides tridimensionais. Vários parâmetros foram estudados. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas realizados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.
Introdução
O câncer é uma das doenças mais temidas pelo ser humano, principalmente por sua alta taxa demortalidade1. Nos últimos anos, a possibilidade de tratamento do câncer tem aumentado à medida que novas terapias têm sido introduzidas2,3,4,5. Modelos in vitro bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) são usados para estudar o câncer em laboratório. No entanto, os modelos 2D não podem avaliar imediata e precisamente todos os parâmetros importantes que indicam sensibilidade antitumoral; portanto, não conseguem repres....
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Protocolo
1. Construção esferoide
- Tratamento antiaderente da placa de cultura
- Pipetar 100 μL de reagente antiaderência em cada poço de uma placa de 48 poços com fundo de poço em forma de U e manter por 10 min. Após 10 min, aspirar o reagente de revestimento e lavar duas vezes com PBS esterilizado.
- Colocar a placa de cultura em estufa (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) até à sua utilização.
- Preparação, coleta e contagem de células
- Utilizar o meio de cultura específico das células para cultura das células em frascos de cultura celular (Tabela Suplementar 2). Por exemplo, cél....
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Resultados
A Figura 1A,B mostra o processo de construção dos esferoides tumorais neste estudo. Primeiro semeamos as células em uma placa de fundo em U de 48 poços. Esta etapa é quase a mesma usada em cultura de células 2D. Mantivemos a placa em uma incubadora comum com água ao redor dos poços para que as células depositadas começassem a formar esferoides em um processo de auto-montagem. Em condições operacionais normais, a maioria dos tipos de esferoides tumorais foi completamente for.......
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Discussão
O microambiente desempenha um papel importante no crescimento tumoral. Pode afetar o fornecimento de matrizes extracelulares, gradientes de oxigênio, nutrição e interação mecânica e, assim, afetar a expressão gênica, as vias de sinal e várias funções das células tumorais19,20,21. Em muitos casos, as células 2D não produzem tais efeitos ou mesmo produzem efeitos opostos, afetando a avaliação dos tratamentos medicamentosos. No ent.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios por suas contribuições críticas e sugestões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto Chave da Comissão de Saúde de Jiangsu (K2019030). A conceituação foi conduzida por C.W. e Z.C., a metodologia foi realizada por W.H. e M.L., a investigação foi realizada por W.H. e M.L., a curadoria dos dados foi realizada por W.H., Z.Z., S.X. e M.L., a elaboração do rascunho original foi realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., a revisão e edição foi realizada por Z.C., a administração do projeto foi realizada por C.W. e Z.C., e a aquisição de financiamento foi conduzida por C.W. Todos os autores leram e concordaram com a ver....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5-10 μ L Ponteiras de pipeta | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Microtubos à prova de fervura | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μ L Ponteiras de pipeta | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | Nest | 601052 | |
| 200 μ L Pontas de pipeta | AXYGEN | T-200-Y | |
| gel 3D | Avatarget | MA02 | |
| Placa inferior em U de 48 poços | Avatarget | P02-48UWP | |
| Tubo de Centrífuga de 50 mL | Ninho | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | ||
| de enxágue antiaderente | STEMCELL | #07010 | |
| Certificado FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Aladim | de água deionizada | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel software | Microsoft Office | ||
| Graphpad prisma sofware | Software GraphPad | ||
| Imager de alto conteúdo e sistema SMART | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Suplemento (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicilina / estreptomicina Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Frasco | JET Biofil | TCF012050 | |
| Tripsina, 0,25% (1X) | Hyclone | SH30042,01 |
Referências
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer ....
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Reimpressões e permissões
