Summary
Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.
Abstract
Bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctie is een pathologisch kenmerk van veel neurodegeneratieve en neuro-inflammatoire ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) beïnvloeden. Vanwege de beperkte toegang tot ziektegerelateerde BBB-monsters is het nog steeds niet goed begrepen of BBB-storing oorzakelijk is voor de ontwikkeling van de ziekte of eerder een gevolg is van het neuro-inflammatoire of neurodegeneratieve proces. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) bieden daarom een nieuwe mogelijkheid om in vitro BBB-modellen van gezonde donoren en patiënten op te stellen en zo ziektespecifieke BBB-kenmerken van individuele patiënten te bestuderen. Er zijn verschillende differentiatieprotocollen vastgesteld voor het afleiden van microvasculaire endotheelcellen (BMEC)-achtige cellen uit hiPSC's. Overweging van de specifieke onderzoeksvraag is verplicht voor de juiste keuze van het respectieve BMEC-differentiatieprotocol. Hier beschrijven we de uitgebreide endotheelcelcultuurmethode (EECM), die is geoptimaliseerd om hiPSC's te differentiëren in BMEC-achtige cellen met een volwassen immuunfenotype, waardoor de studie van immuuncel-BBB-interacties mogelijk is. In dit protocol worden hiPSC's eerst gedifferentieerd in endotheelvoorlopercellen (EPC's) door Wnt/β-catenine signalering te activeren. De resulterende cultuur, die gladde spierachtige cellen (SMLCs) bevat, wordt vervolgens sequentieel gepasseerd om de zuiverheid van endotheelcellen (EC's) te verhogen en BBB-specifieke eigenschappen te induceren. Co-cultuur van EECM-BMEC's met deze SMLCs of geconditioneerd medium van SMLCs maakt de reproduceerbare, constitutieve en cytokine-gereguleerde expressie van EC-adhesiemoleculen mogelijk. Belangrijk is dat EECM-BMEC-achtige cellen barrière-eigenschappen vaststellen die vergelijkbaar zijn met primaire menselijke BMEC's, en vanwege hun expressie van alle EC-adhesiemoleculen verschillen EECM-BMEC-achtige cellen van andere hiPSC-afgeleide in vitro BBB-modellen. EECM-BMEC-achtige cellen zijn dus het model bij uitstek voor het onderzoeken van de potentiële impact van ziekteprocessen op het niveau van de BBB, met een impact op immuuncelinteractie op een gepersonaliseerde manier.
Introduction
De neurovasculaire eenheid (NVU) in het centrale zenuwstelsel (CZS) bestaat uit de zeer gespecialiseerde microvasculaire endotheelcellen (EC's), pericyten ingebed in het endotheelkeldermembraan en het parenchymale keldermembraan en astrocyteneindvoeten1. Binnen de NVU zijn microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC's) de belangrijkste componenten die de bloed-hersenbarrière (BBB) vormen. BMEC's vormen complexe en continue tight junctions en hebben een extreem lage pinocytotische activiteit in vergelijking met microvasculaire EC's in perifere organen, waardoor de BBB de vrije paracellulaire diffusie van in water oplosbare moleculen in het CZS kan remmen. De expressie van specifieke instroomtransporters en effluxpompen door BMEC's zorgt voor de opname en export van respectievelijk voedingsstoffen en schadelijke moleculen uit hetCZS 2. Bovendien controleert de BBB strikt de toegang van immuuncellen tot het CZS door lage niveaus van endotheeladhesiemoleculen tot expressie te brengen die cruciaal zijn voor de handel van immuuncellen in het CZS3. Onder fysiologische omstandigheden zijn de expressieniveaus van adhesiemoleculen op het oppervlak van BMEC's, zoals intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) en vasculaire celadhesiemolecuul-1 (VCAM-1), laag, maar deze niveaus nemen toe bij sommige neurologische aandoeningen2. Morfologische en functionele afbraak van de BBB wordt gemeld bij veel neurologische aandoeningen, zoals beroerte4, multiple sclerose (MS)5 en verschillende neurodegeneratieve ziekten 6,7,8. Gedetailleerd onderzoek van de cellulaire en moleculaire kenmerken van BMEC's onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden is een benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën die gericht zijn op de BBB.
Tot voor kort werden primaire of vereeuwigde BMEC's voor mensen en knaagdieren gebruikt om de BBB te bestuderen. Of conclusies op basis van diermodellen van de BBB gemakkelijk toepasbaar zijn op de menselijke BBB is echter onduidelijk, omdat de expressie van verschillende belangrijke moleculen, waaronder adhesiemoleculen en opgeloste dragereiwitten, verschilt tussen mensen en knaagdieren 9,10. Hoewel menselijke BMEC-lijnen zoals hCMEC/D3 de juiste niveaus van adhesiemoleculen11 uitdrukken, hebben deze vereeuwigde BMEC's over het algemeen geen complexe tight junctions en robuuste barrière-eigenschappen12. Primaire menselijke BMEC's zijn nuttig om barrièrefuncties te bestuderen13, maar ze zijn niet direct beschikbaar voor alle onderzoekers. Verder kunnen primaire BMEC's van patiënten moeilijk te verkrijgen zijn, omdat ze moeten worden verzameld via een hersenbiopsie of een operatie die alleen onder specifieke klinische omstandigheden wordt uitgevoerd.
Recente ontwikkelingen in stamceltechnologie hebben de differentiatie van verschillende menselijke celtypen mogelijk gemaakt, voortkomend uit stamcelbronnen zoals door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). De hiPSC-afgeleide modellen stellen ons in staat om pathofysiologische modellen op te stellen met behulp van patiënt-afgeleide monsters. Verschillende hiPSC-afgeleide celtypen kunnen worden gecombineerd om autologe coculturen of organoïden te vestigen die fysiologische omstandigheden beter nabootsen. Verschillende veelgebruikte protocollen 14,15,16,17,18,19 kunnen worden gebruikt om hiPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen te differentiëren die robuuste diffusiebarrière-eigenschappen hebben met de expressie van BBB-specifieke transporters en effluxpompen, en zijn nuttig om de paracellulaire diffusie van kleine moleculen, moleculaire transportmechanismen en medicijnafgifte aan de hersenen te bestuderen 20,21. Eerdere studies hebben echter aangetoond dat veel gebruikte hiPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen de expressie van belangrijke endotheeladhesiemoleculen missen, waaronder VCAM-1, selectines en ICAM-2, die verantwoordelijk zijn voor het bemiddelen van interacties tussen immuuncellen en de BBB22. Bovendien is gemeld dat eerdere van hiPSC afgeleide BMEC's gemengde endotheel- en epitheelkenmerken vertonen op transcriptioneel niveau23. Daarom ontwikkelden we de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), een nieuw protocol dat de differentiatie van hiPSC's in BMEC-achtige cellen mogelijk maakt die lijken op primaire menselijke BMEC's met betrekking tot morfologie, barrièrekenmerken en endotheeladhesiemolecuulexpressie. Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methodologische procedures om hiPSC's te onderscheiden van BMEC-achtige cellen die een volwassen immuunfenotype vertonen.
Protocol
Figuur 1: Overzicht van het protocol. Het manuscript presenteert een stap-voor-stap protocol voor het differentiëren van hiPSC's in EECM-BMEC-achtige cellen. De juiste schema's geven de celpopulaties bij elke stap weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hiPSC-lijn, HPS1006, werd geleverd door de RIKEN BRC via het National Bio-Resource Project van de MEXT/AMED, Japan.
1. Inductie van hiPSC-differentiatie in endotheelvoorlopercellen (EPC's)
- Extracellulaire matrix (ECM)-gecoate platen en reagentia
- Bereid keldermembraanmatrix-gecoate 12-putplaten voor door 2,5 mg matrixgel in centrifugebuizen van 50 ml te aliquoteren voor opslag bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 30 ml koud Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium/nutriëntenmengsel F-12 (DMEM/F12), dat in de koelkast (4 °C) is bewaard, toe aan de buis. Meng voorzichtig door pipetteren totdat de gel is ontdooid en voeg vervolgens 500 μL van de oplossing toe aan elk putje van de 12-putplaat. Plaats de plaat minstens 1 uur in een incubator (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: De keldermembraanmatrixgel is temperatuurgevoelig en moet worden behandeld volgens de instructies van de fabrikant voor aliquotering en plaatcoating. De concentratie van extracellulaire matrixeiwitten kan variëren tussen batches. Om de nauwkeurigheid te garanderen, moet de exacte concentratie worden vermeld op het kwaliteitscertificaatblad voor de specifieke partij, met gebruikmaking van het partijnummer. Als de exacte concentratie bijvoorbeeld 10,0 mg / ml is, gebruik dan 250 μl gel voor een totaal van 2,5 mg. - Bereid rho-kinase (ROCK)-remmeroplossing door de ROCK-remmer in steriel water op te lossen tot een concentratie van 10 mM (tabel 1). Aliquoteer de stamoplossing in volumes van 100-200 μL en bewaar bij -20 °C om vries-dooicycli te voorkomen.
- Maak een stamoplossing van 100 mg/ml L-ascorbinezuur door 5 g L-ascorbinezuur op te lossen in 50 ml steriel water en bewaar bij -20 °C (tabel 1). Voeg 6,25 ml glutamine en 305 μl L-ascorbinezuuroplossing toe aan 500 ml geavanceerde DMEM/F12 om een LaSR-medium24 te maken (tabel 1). Bewaren bij 2-8 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Bereid CHIR99021-oplossing door CHIR99021 op te lossen in onverdund dimethylsulfoxide (DMSO) tot een eindconcentratie van 10 mM (tabel 1). Aliquoteer de oplossing in volumes van 100-200 μL om vries-dooicycli te voorkomen en bewaar deze bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar. Bewaar de werkaliquots van de voorraadoplossing bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Bereid DMEM/F12-10 medium door 50 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum toe te voegen aan 450 ml DMEM/F12. Bewaar het medium bij 2-8 °C gedurende maximaal 1 maand (tabel 1).
- Bereid stroombuffer-1 voor door 33,3 ml 7,5% runderserumalbumine (BSA) toe te voegen aan 467 ml dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (tabel 1). Bewaren bij 2-8 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Bereid keldermembraanmatrix-gecoate 12-putplaten voor door 2,5 mg matrixgel in centrifugebuizen van 50 ml te aliquoteren voor opslag bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 30 ml koud Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium/nutriëntenmengsel F-12 (DMEM/F12), dat in de koelkast (4 °C) is bewaard, toe aan de buis. Meng voorzichtig door pipetteren totdat de gel is ontdooid en voeg vervolgens 500 μL van de oplossing toe aan elk putje van de 12-putplaat. Plaats de plaat minstens 1 uur in een incubator (37 °C, 5% CO2).
- Zaaien van singulariseerde hiPSC's en expansie voor EPC-differentiatie (dag -3 tot dag -1)
- Begin met differentiatie wanneer de hiPSC-kolonies in een 6-well-plaat geen spontane differentiatie vertonen en de juiste dichtheid hebben voor passaging, meestal rond 80% confluentie (2,5-3,5 x 106 cellen). Controleer spontaan gedifferentieerde cellen zorgvuldig onder de microscoop om ervoor te zorgen dat er meerdere passages nodig zijn om niet-gedifferentieerde cellen te elimineren. Raadpleeg de onderstaande opmerking stap 1.4.15 voor informatie over celkweekmedium en extracellulaire matrix.
- Zuig het medium aan en voeg 1 ml dissociatiereagens toe aan de putjes en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C. Dissocieer en singulariseer de cellen door de dissociatie-reagensoplossing twee of drie keer zachtjes over de oppervlakken van de putten te pipetteren.
- Breng de losgemaakte cellen over in een buis van 15 ml met 4 ml hiPSC-onderhoudsmedium en resuspensie de cellen grondig. Reserveer een aliquot van 10 μL voor het tellen van cellen.
- Pelleteer de cellen door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 200 x g bij 20-25 °C. Tel de cellen en bereken het benodigde volume om een geschikte dichtheid van hiPSC's (75-400 x 103 per put) te bereiken in een met keldermembraan matrix gecoate 12-well plaat (stap 1.1.1).
- Zuig de coatingoplossing uit de putten op en voeg 1 ml hiPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer toe aan elke put (1:1.000 verdunning). Na het centrifugeren, zuig het supernatant op en dissocieer de pellet in 1 ml hiPSC-medium.
- Voeg het vereiste volume hiPSC, bepaald in stap 1.2.4, toe aan elke put van de 12-putplaat. Twee tot vier 12-well platen kunnen voldoende zijn om een hiPSC-kloon te onderscheiden. Raadpleeg stap 1.2.4 om het aantal platen te bepalen dat nodig is voor zaaicellen.
- Plaats de plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2). Verdeel de cellen gelijkmatig door de plaat voorzichtig heen en weer te schuiven en vervolgens van links naar rechts in de couveuse.
- Vervang het medium de volgende dag (d.w.z. dag -2) met 2 ml hiPSC-onderhoudsmedium zonder ROCK-remmer. Vervang het medium de volgende dag (dag -1) door 2 ml vers hiPSC-onderhoudsmedium.
- Inductie van EPC's met de glycogeensynthasekinase 3 (GSK-3)-remmer CHIR99021 (dag 0 tot dag 5)
- Vervang op dag 0 het hiPSC-onderhoudsmedium in elke put door 2 ml LaSR-medium met 8 μM CHIR99021.
- Zuig op dag 1 het medium aan en voeg 2 ml vers LaSR-medium toe dat 8 μM CHIR99021 bevat.
- Vervang op dag 2, 3 en 4 het medium door 2 ml vers LaSR-medium zonder CHIR99021.
- Magnetische geactiveerde celsortering (MACS) om CD31 te zuiveren+ EPC's (dag 5)
- Zuig op dag 5 het medium aan en voeg vervolgens 1 ml dissociatiereagens toe aan elk putje, voordat u gedurende 6-8 minuten bij 37 °C incubeert.
- Dissocieer en singulariseer de cellen met een micropipette en ga door een celzeef van 40 μm om de suspensie te filteren in een buis van 50 ml met 10 ml DMEM / F12-10-medium. Filter de celsuspensie verzameld uit meer dan twee 12-putplaten in ten minste twee buizen van 50 ml.
- Stop de verteringsreactie door toevoeging van DMEM/F12-10 medium (tot 50 ml). Pipetteer grondig en reserveer 10 μL voor het tellen van cellen. Pelleteer de cellen door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 200 x g bij 20-25 °C.
- Voeg na het verwijderen van het supernatant 10 ml DMEM/F12-10 medium toe en breng de celsuspensie over in verse buizen van 15 ml. Pelleteer de cellen door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 200 x g bij 20-25 °C.
- Zuig het supernatant op en resuspensie in stroombuffer-1 met een dichtheid van 1,0 x 107 cellen per 100 μL buffer.
- Voeg FcR-blokkerend reagens toe in een verhouding van 1:100 en incubeer gedurende 5 minuten voordat u het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabelde CD31-antilichaam verdund 1:200 toevoegt. Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten in het donker bij 20-25 °C.
- Voeg 10 ml flowbuffer-1 toe en reserveer 10 μL van de suspensie voor flowcytometrie-analyse om de fractie CD31+ -cellen te bepalen (figuur 2).
- Pelleteer de cellen door te centrifugeren op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20-25 °C. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspensie tot een dichtheid van 1,0 x 107 cellen per 100 μL stroombuffer-1-oplossing. Voeg de FITC-selectiecocktail toe (5 μL per 100 μL celsuspensie). Meng grondig door pipetteren en incubeer in het donker gedurende 15 minuten bij 20-25 °C.
- Voeg 5 μL magnetische nanodeeltjes per 100 μL celsuspensie toe, pipetteer goed en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 20-25 °C.
- Breng de celsuspensie over in een 5 ml flowcytometriebuis en voeg stroombuffer-1 toe om een totaal volume van 2,5 ml te bereiken. Plaats de flowcytometriebuis gedurende 5 minuten in de magneet.
- In een continue beweging keert u de magneet om en decanteert u de celsuspensie met cellen die niet zijn gelabeld met het FITC-CD31-antilichaam. Houd de magneet en buis gedurende 2-3 s in de omgekeerde positie en verwijder vervolgens de resterende vloeistof. Zuig eventuele druppels op de rand van de buis op voordat u de buis terugbrengt naar een rechtopstaande positie.
- Pak de flowcytometriebuis van de magneet en voeg 2,5 ml flowbuffer-1 toe om de resterende CD31+ cellen te wassen. Resuspendeer de cellen door de cellen twee of drie keer voorzichtig op en neer te pipetteren. Plaats de stroombuis gedurende 5 minuten in de magneet.
- Herhaal stap 1.4.11-1.4.12 driemaal en stap 1.4.11 nogmaals voor in totaal vier wasbeurten.
- Verwijder de stroombuis van de magneet en voeg de aangegeven hoeveelheid van een geschikt medium (bijv. humaan endotheelserumvrij medium [hECSR] voor uitgebreide EC-cultuur of vriesmedium voor bevriezing) toe aan de buis om de gezuiverde CD31+ cellen te resuspenderen. Bewaar twee aliquots van 10 μL van de suspensie, één voor celtelling en de tweede voor het uitvoeren van flowcytometrie-analyse om de zuiverheid van CD31+ -cellen in post-MACS-monsters te beoordelen (figuur 2). Als er niet onmiddellijk een flowcytometer beschikbaar is, bewaar het aliquot dan bij 4 °C tot de analyse.
- Als de volgende stappen (via stap 2) niet onmiddellijk kunnen worden uitgevoerd, bevriest u de CD31+ EPC's op dit punt. Voor uitbreiding en selectieve passaging van EPC's gaat u verder met stap 2.
OPMERKING: Vitronectine25-gecoate 12-well platen en het stabielere hiPSC onderhoudsmedium (mTeSR plus) kunnen worden gebruikt in plaats van keldermembraan matrix-gecoate platen en hiPSC onderhoudsmedium (mTeSR1). Om met vitronectine gecoate 12-putplaten te bereiden, verdunt u vitronectine met verdunningsbuffer tot een eindconcentratie van 10 μg / ml en brengt u vervolgens 500 μl van de verdunde oplossing over naar elk putje van de 12-putplaten. Laat de platen minstens 1 uur op 20-25 °C staan. De zaaidichtheid van singulariseerde hiPSC's is vergelijkbaar met die van keldermembraanmatrix-gecoate platen. Het veranderen van het kweekmedium of de matrixsamenstelling kan van invloed zijn op de proliferatie en spontane differentiatie van hiPSC's, die meestal 1-2 weken nodig hebben om zich aan te passen aan nieuwe kweekomstandigheden. Als het stabielere hiPSC-onderhoudsmedium wordt gebruikt voor hiPSC-onderhoud, kan dit medium worden gebruikt voor EPC-differentiatie in plaats van het hiPSC-onderhoudsmedium. In dit geval moet het stabielere hiPSC-onderhoudsmedium op dag -2 worden vervangen om de ROCK-remmer te verwijderen en kan de uitwisseling op dag -1 worden overgeslagen.
2. Uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM) om microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen (BMEC-achtige cellen) en gladde spierachtige cellen (SMLCs) te onderscheiden
- Bereiding van met collageen beklede platen en reagentia
- Bereid met collageen gecoate 6-well platen door 5 mg gekristalliseerd collageen type IV op te lossen in 5 ml steriel water. Incubeer een nacht bij 4 °C voordat u aliquoteert en bewaart bij -20 °C. Verdun collageen IV aliquots 1:100 in steriel water om 10 μg/ml oplossingen te produceren en voeg 1 ml 10 μg/ml collageen IV-oplossingen toe aan elke put van de 6-well platen. Incubeer de platen gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C. De platen kunnen maximaal 1 week bij 37 °C bewaard worden.
- Bereid een stamoplossing van humane fibroblastgroeifactor 2 (FGF2) door 500 μg FGF op te lossen in 5 ml PBS van Dulbecco, voeg 7,5% BSA toe aan een eindconcentratie van 0,1% en aliquoteer de stamoplossing in volumes van 20-200 μL. Deze kunnen maximaal 3 maanden bij -20 °C worden bewaard (tabel 1). Voorraadoplossingen kunnen tot 1 maand bij 4 °C worden bewaard; Vermijd vries-dooicycli. Bereid hECSR-medium door 2 ml B-27-supplement en 20 μL FGF2 toe te voegen aan 98 ml hECSR-medium (tabel 1). Het hECSR-medium kan maximaal 2 weken bij 2-8 °C worden bewaard.
- Bereid vriesmedium voor de EPC's, EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs door 15 ml foetaal runderserum, 5 ml DMSO en 25 μl ROCK-remmeroplossing toe te voegen aan 30 ml hECSR-medium (tabel 1). Het vriesmedium kan maximaal 2 weken bij 2-8 °C worden bewaard.
- Zaaien van EPC's voor uitgebreide endotheelcelkweek
- Verwijder de collageenoplossing uit de 6-putplaten. Breng vervolgens 1,0-2,0 x 10 5 gezuiverde CD31+ EPC's over in 2 ml hECSR-medium met5 μM ROCK-remmer (1:2.000 verdunning). Plaats de plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2). Verdeel de cellen gelijkmatig door de platen voorzichtig heen en weer te schuiven en vervolgens van links naar rechts.
- Verwijder de volgende dag het hECSR-medium dat ROCK-remmer bevat en voeg 2 ml vers hECSR-medium zonder ROCK-remmer toe. Vervang het hECSR-medium om de dag totdat 100% samenvloeiing is bereikt.
OPMERKING: Als een regelmatig voedingsschema gedurende een weekend niet kan worden gehandhaafd, kan het medium 's avonds van de laatste werkdag van de week en 's ochtends vroeg na het weekend opnieuw worden vervangen.
- Selectieve passage om EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs te zuiveren
- Verwijder het hECSR-medium uit de 6-putplaten die een mengsel van EC's en niet-EG-populaties bevatten. Voeg 1 ml dissociatiereagens toe aan elk putje.
- Controleer de celmorfologie zorgvuldig onder een microscoop. Wanneer de EC's (maar niet niet-EC's) helder en rond lijken (meestal binnen 2-5 minuten), maakt u ze los door op de rand van de plaat te tikken. De meeste niet-EC's blijven aan de plaat vastzitten.
- Verzamel de losgemaakte EC's met behulp van een micropipette, zorg ervoor dat de niet-EC's niet opnieuw worden gesuspendeerd. Breng de EC's over in een centrifugebuis van 15 ml of 50 ml met 4 ml DMEM/F12-10 per 1 ml dissociatiereagens.
- Voeg 2 ml hECSR-medium toe aan de putjes met de resterende aangehechte niet-EC's om SMLCs vast te stellen. Plaats de plaat in de incubator.
- Pipetteer de EC-suspensie in de centrifugebuis om grondig te mengen en reserveer 10 μL van de suspensie voor celtelling. Centrifugeer de resterende cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g bij 20-25 °C. Verwijder het supernatant uit de pellet en voeg 2 ml hECSR-medium per 1,0-2,0 x 105 EC's toe.
- Voeg bij verwijdering van de collageen IV-oplossing uit een nieuwe 6-putplaat 2 ml EC-suspensie toe aan elke put, gevolgd door incubatie bij 37 °C met 5% CO2. Om de cellen gelijkmatig in de plaat te verdelen, beweegt u deze voorzichtig in een heen en weer en zijwaartse beweging op de incubatorplank.
- Vervang het hECSR-medium om de dag totdat de EC's 100% confluency bereiken.
- Herhaal stap 2.3.1-2.3.7 totdat een zuivere EG-monolaag is verkregen. Als de volgende stappen niet kunnen worden uitgevoerd, bevriest u de CD31+ EC's (zie stap 2.4.2). Als u EC-functies wilt analyseren, gaat u verder met stap 3.
OPMERKING: Over het algemeen zijn twee of drie selectieve passages nodig om bijna zuivere culturen van EC's te verkrijgen die geschikt zijn voor functionele analyses, en we beschouwen deze cellen als EECM-BMEC-achtige cellen. Na meer dan vijf of zes passages vertraagt de celproliferatie meestal, hoewel deze variabele afhankelijk is van de hiPSC-lijn. - Om SMLCs te kweken, vervangt u het hECSR-medium om de andere dag. Om SMLC-geconditioneerd medium (CM) te verzamelen, passeert u het verzamelde medium door een filter van 0,22 μm bij elke mediumwissel. De CM kan worden gebruikt om de VCAM-1-expressie van EECM-BMEC-achtige cellen te upreguleren. Bundel de SMLC-CM totdat de SMLCs 100% confluency bereiken.
- EPC, EECM-BMEC-achtige cel en SMLC cryopreservatie en ontdooiing
- Om EPC's in te vriezen, na de laatste MACS-wasbeurt (stap 1.4.13), resuspensie van de EPC's in vriesmedium in plaats van hECSR-medium met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml. Verdeel 1 ml van de celsuspensie in cryobuizen. Plaats de cryobuizen in een vriesapparaat met gecontroleerde snelheid en breng ze snel over naar -80 °C. Voor langdurige opslag verplaatst u de buizen 24 tot 48 uur na het invriezen naar een tank met vloeibare stikstof.
- Om EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs te bevriezen, voegt u na het verwijderen van het medium uit putten dissociatiereagens (1 ml / put) toe en incubeert u de plaat bij 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen loskomen (respectievelijk 5-7 min en 20-30 min voor EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs). Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml of 50 ml met 4 ml DMEM/F12-10 per 1 ml dissociatiereagens.
- Pipetteer grondig om 10 μL van de celsuspensie te mengen en te reserveren voor celtelling. Pelleteer de cellen door te centrifugeren op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20-25 °C. Verwijder het supernatant en resuspendien de cellen grondig in vriesmedium tot een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen/ml. Verdeel 1 ml van de celsuspensie in verse cryobuizen.
- Plaats de cryobuizen in een vriesapparaat met gecontroleerde snelheid en breng ze onmiddellijk over naar -80 °C. Voor langdurige opslag kunnen de buizen 24 tot 48 uur na het invriezen worden overgebracht naar een tank met vloeibare stikstof.
- Voor het ontdooien van EPC's, EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs, rol injectieflacons met cryobuizen tussen de handen of incuber in een waterbad van 37 °C totdat de cellen bijna volledig zijn ontdooid. Voeg 500 μL DMEM/F12-10 toe en breng de celsuspensie voorzichtig over in een buis van 15 ml met 4 ml DMEM/F12-10 medium. Was de cryobuis eenmaal door 1 ml DMEM/F12-10 toe te voegen en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 5 minuten op 200 x g bij 20-25 °C.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 2 ml hECSR-medium met 5 μM ROCK-remmer (1:2.000 verdunning) tot een dichtheid van 1,0-2,0 x 10 5 cellen per 2 ml voor EPC's en 2,0-3,0 x 105 cellen per 2 ml voor EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs. Verdeel de celsuspensie over de putjes van de met collageen gecoate 6-putplaten na het aanzuigen van de collageenoplossing.
- Beweeg de platen voorzichtig heen en weer en vervolgens van links naar rechts op de plank van een incubator bij 37 °C, 5 % CO2 om de cellen gelijkmatig in de putten te verdelen.
- Vervang het medium de volgende dag door vers hECSR-medium zonder ROCK-remmer. Vervang het hECSR-medium om de dag totdat 100% confluentie is bereikt. Ga vervolgens over tot selectieve passaging voor EPC's (zie stap 2.3) en functionele analyses voor EECM-BMEC-achtige cellen (zie stap 3). Alvorens moleculaire karakterisering en functionele assays uit te voeren, moeten EECM-BMEC-achtige cellen 100% confluent zijn, wat meestal 2-3 dagen na het ontdooien wordt bereikt.
3. Validatie van EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs
- Permeabiliteitstest voor kleine molecuul tracers
- Beoordeel de integriteit van de EECM-BMEC-achtige celbarrière door de permeabiliteit van natriumfluoresceïne te meten, zoals beschreven door Nishihara et al.26. Zaai de EECM-BMEC-achtige cellen op filterinzetstukken om volledige monolagen te ontwikkelen en meet de permeabiliteit van natriumfluoresceïne.
- Immunofluorescentiekleuring om belangrijke moleculen te beoordelen.
- Voor immunofluorescentiekleuring om de expressie van junctionele moleculen, adhesiemoleculen of cytoskeletale eiwitten van EECM-BMEC-achtige cellen in monolagen of van SMLCs te controleren, gebruikt u kamerglaasjes, 96-putplaten of membranen met insertfilters. Beoordeel de EECM-BMEC-achtige celexpressie van celoppervlakadhesiemoleculen met of zonder inflammatoire cytokinestimulatie, zoals beschreven door Nishihara et al.26.
- Flowcytometrie om de expressie van celoppervlakadhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen te analyseren
- Gebruik flowcytometrie om de semi-kwantitatieve expressie te beoordelen van celoppervlakadhesiemoleculen die betrokken zijn bij immuuncelmigratie naar het CZS, waaronder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectine, E-selectine, CD99 en bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM-1), zoals beschreven door Nishihara et al.26. Kweek de EECM-BMEC-achtige cellen met SMLC-geconditioneerd medium in de aan- en afwezigheid van inflammatoire cytokines gedurende 16-18 uur.
- Immuunceladhesietest onder statische omstandigheden om de expressie van functionele adhesiemoleculen te beoordelen
- Gebruik de methode beschreven door Nishihara et al.26 om te bepalen of de celoppervlakadhesiemoleculen van de EECM-BMEC-achtige cellen functioneel zijn.
- Kortom, zaai de EECM-BMEC-achtige cellen op een kamerschuif op 5,5 x 104/cm2 en groei tot samenvloeiing. Verander ongeveer 24 uur later het kweekmedium in SMLC-geconditioneerd medium in de aan- of afwezigheid van pro-inflammatoire cytokines en incuber de EECM-BMEC-achtige cellen gedurende nog eens 16 uur.
- Op de dag van het experiment ontdooien gecryopreserveerde immuuncellen (bijv. T-cellen of perifere mononucleaire bloedcellen [PBMC's]) met T-cel wasbuffer (tabel 1) en etiket met fluorescerende kleurstoffen (bijv. celtrackerkleurstoffen) in T-celmedium (tabel 1). Optimalisatie van het kweekmedium voor de immuuncellen moet worden afgestemd op het specifieke type immuuncellen dat wordt bestudeerd.
- Voeg in een 16-well kamerschuif 2 x 104 Th1-cellen toe aan de EECM-BMEC-achtige cellen. Specifiek, bij het werken met effector T-cellen zoals Th1-cellen, is waargenomen dat ze een grotere gehechtheid vertonen aan EECM-BMEC-achtige cellen in vergelijking met PBMC's (Nishihara. et al. [2022]). Bijgevolg moet het aantal PBMC's dat aan de EECM-BMEC-achtige cellen moet worden toegevoegd hoger zijn in vergelijking met zuivere effector T-cellen.
- Incubeer de immuuncellen met de monolaag van EECM-BMEC-achtige cellen gedurende 30 minuten in migratietestmedium (tabel 1). Was de dia na 30 minuten voorzichtig, tweemaal door onder te dompelen in een pot met Dulbecco's PBS en vervolgens gedurende 2 uur te fixeren met 2,5% glutaaraldehyde-oplossing bij 4 °C.
- Na fixatie was je de dia twee keer door ze onder te dompelen in een pot met Dulbecco's PBS en te monteren met een coverslip. Verkrijg vervolgens fluorescentiemicroscopiebeelden van het midden van de monolaag op de dia's voor het tellen van immuuncellen die zijn bevestigd aan EECM-BMEC-achtige celmonolagen.
Representative Results
Permeabiliteitstest
De permeabiliteit van natriumfluoresceïne werd berekend door de fluorescentie-intensiteit van het medium verzameld uit de onderste kamer te meten na 15, 30, 45 en 60 minuten. Op elk tijdstip wordt in totaal 150 μl medium bemonsterd en het ontbrekende volume van 150 μl wordt vervangen door hECSR-medium. de fluorescentie-intensiteit wordt afgelezen met behulp van een fluorescerende plaatlezer (485 nm excitatie/530 nm emissie) en de juiste signalen, klaringsvolumes en permeabiliteiten worden berekend met behulp van een eerder beschreven formule18 (tabel 2). Het wordt aanbevolen om te bevestigen of de fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne in de loop van de tijd toeneemt. Meerdere filters - ten minste drievoudige - moeten worden gebruikt voor één test om de reproduceerbaarheid te garanderen. Voor gezonde controle-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen moet de natriumfluoresceïne (376 Da) permeabiliteit lager zijn dan 0,3 x 10-3 cm / min. Om de vorming van een confluente EECM-BMEC-achtige celmonolaag te bevestigen, moet immunofluorescentiekleuring voor junctionele eiwitten van de EECM-BMEC-achtige cellen van elk filter dat in de permeabiliteitstests wordt gebruikt, na deze test worden uitgevoerd.
Immunofluorescentiekleuring
Immunofluorescentiekleuring van EECM-BMEC-achtige cel junctionele moleculen, waaronder claudin-5, occludin en VE-cadherine1, werd gebruikt om celmorfologie en de aanwezigheid van continue en volwassen juncties te beoordelen (figuur 4). De monolagen van EECM-BMEC-achtige cellen op de membranen van de filterinzetstukken werden gedurende 20 s gefixeerd met koude methanol (-20 °C), geblokkeerd met blokkeringsbuffer (tabel 1) en vervolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. De EECM-BMEC-achtige cellen vertoonden spindelachtige vormen en zigzagvormige juncties, die beide karakteristieke morfologische kenmerken zijn van BMEC's27. Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen gezaaid op kamerglaasjes met pro-inflammatoire cytokines, zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interferon-γ (INF-γ) (0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ) verdund in SMLC-afgeleid geconditioneerd medium, upreguleerde de expressie van adhesiemoleculen, zoals ICAM-1 en VCAM-128 (figuur 5). Representatieve beelden van gladde spiercelmarkers, waaronder α-gladde spieractine (SMA), calponine en gladde spiereiwit 22-Alpha (SM22a)29, worden weergegeven in figuur 6. SMLCs gezaaid op de kamerschuif werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde, geblokkeerd met blokkeringsbuffer en vervolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen.
Flowcytometrie-analyse van celoppervlakadhesiemolecuulexpressie door EECM-BMEC-achtige cellen
Representatieve resultaten voor celoppervlakexpressie van endotheeladhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen worden weergegeven in figuur 7. Stimulatie met pro-inflammatoire cytokines, zoals TNF-α en INF-γ, upreguleerde de celoppervlakexpressie van verschillende adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, VCAM-1 en P-selectine. Het kweken van EECM-BMEC-achtige cellen met SMLC-geconditioneerde medium verbeterde endotheliale VCAM-1 celoppervlakexpressie. Het effect van de inductie van VCAM-1 celoppervlakexpressie kan variëren tussen batches SMLC-geconditioneerd medium. Het wordt aanbevolen om bij het onderscheiden van SMLCs verschillende partijen geconditioneerd medium geoogst uit SMLCs, afgeleid van dezelfde hiPSC-bron, op te slaan om na te gaan welke partij de juiste expressie van VCAM-1 induceert.
Immuunceladhesietest onder statische omstandigheden
Het aantal aangehechte immuuncellen correleerde met het expressieniveau van functionele adhesiemoleculen op het oppervlak van EECM-BMEC-achtige cellen. Stimulatie met inflammatoire cytokines upreguleerde de expressie van endotheeladhesiemoleculen en bevorderde het verhoogde aantal immuuncellen dat zich hechtte aan EECM-BMEC-achtige celmonolagen (figuur 8). Het huidige experiment demonstreerde de functionaliteit van adhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen, waardoor dit model geschikt is voor het bestuderen van immuuncel-EC-interacties.
Figuur 2: Zuivering van CD31+ EC's. Dot plots van representatieve flowcytometriegegevens van scatter gating van EC's en FITC-gelabelde CD31-kleuring van celpopulaties vóór (stap 1.4.7) en na (stap 1.4.14) MACS. MACS verbetert de zuiverheid van CD31+ EPC's in de populatie. Afkortingen: SSC = side scatter; FSC = voorwaartse verstrooiing; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; MACS = magnetische geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: EECM-BMEC-monolayer permeabiliteit (10-3 cm/min) berekend op basis van de ruwe fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne. De lineaire helling van het klaringsvolume wordt berekend met behulp van lineaire regressie voor elk filter (figuur 3A). De permeabiliteit van natriumfluoresceïne wordt berekend met behulp van twee formules (figuur 3B). (A) De lineaire helling van het klaringsvolume ten opzichte van de tijd werd berekend met behulp van lineaire regressie voor filter 1 (mc1) en het blancofilter (mf). De m c1 en m f zijn coëfficiënten van respectievelijk Xc1 en Xf. (B) Formule voor het berekenen van de fluoresceïnepermeabiliteit (Pe) met behulp van mc en mf (formule 1). Pe-eenheden werden omgebouwd met behulp van het oppervlak van een filter (Formule 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: EECM-BMEC-achtige cellen vertonen volwassen cellulaire juncties. Immunofluorescentiekleuring voor claudin-5, occludine of VE-cadherine (rood) in EECM-BMEC-achtige cellen gekweekt op membranen van insertfilters. Kernen werden gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (blauw). Kleuring werd uitgevoerd op exact dezelfde filterinzetstukken die werden gebruikt voor de permeabiliteitstests. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Expressie van endotheeladhesiemoleculen door EECM-BMEC-achtige cellen. Immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd op EECM-BMEC-achtige cellen gekweekt op membranen van filterinzetstukken in aanwezigheid van SMLC-afgeleide CM. Immunostaining voor ICAM-1 of VCAM-1 (rood) wordt getoond voor niet-gestimuleerde en 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN- γ gestimuleerde EECM-BMEC-achtige cellen. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Karakterisering van SMLCs. Immunocytochemie van α-gladde spieractine (SMA), calponine of gladde spiereiwit 22-Alpha (SM22a) (rood) voor SMLCs gekweekt op kamerglaasjes wordt weergegeven. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Endotheliale celoppervlakexpressie van adhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen. Resultaten van flowcytometrie-analyse van EC surface adhesion molecule expression op EECM-BMEC-achtige cellen worden getoond. EECM-BMEC-achtige cellen werden gekweekt met behulp van SMLC-afgeleid geconditioneerd medium. Blauwe, rode en grijze lijnen van de histogramoverlays tonen respectievelijk de niet-gestimuleerde (NS) conditie, 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN-γ-gestimuleerde toestand en isotypecontrole. De celoppervlakexpressie van endotheeladhesiemoleculen, waaronder intercellulair adhesiemolecuul 1 (ICAM-1), ICAM-2, vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1), P-selectine, E-selectine, CD99 en bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM-1) werden beoordeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Hechting van immuuncellen op EECM-BMEC-achtige cellen. (A) Afbeeldingen van fluorescerend gelabelde adherente immuuncellen op niet-gestimuleerde (NS) en 0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ-gestimuleerde (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC-achtige celmonolagen. De afbeeldingen komen overeen met de centra van de putten. Schaalbalk = 50 μm. (B) Het aantal fluorescerend gelabelde immuuncellen op monolagen van NS- en TNF-α + IFN-γ-gestimuleerde EECM-BMEC-achtige cellen. Aanhangende immuuncellen/gezichtsvelden (FOV's) werden automatisch geteld met behulp van FIJI-software. Punten staan voor het aantal gekoppelde T-cellen. Balken tonen de gemiddelde waarde en foutbalken tonen de standaarddeviatie (SD) van acht onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Bijzonderheden over specifieke reagentia voor de tests. De naam en de exacte hoeveelheid ingrediënten voor elk specifiek reagens worden beschreven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Voorbeeld van ruwe gegevens van de fluorescentieplaatlezer voor Pe-berekening. Getallen in vetgedrukte letters zijn de ruwe fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne gemeten door een plaatlezer. Om de gegevens nauwkeurig te analyseren, is het noodzakelijk om het achtergrondsignaal uit de onbewerkte waarden te verwijderen en rekening te houden met enig signaalverlies als gevolg van het bemonsteren van de onderste kamer en vervolgens het signaal te corrigeren. Na aftrek van de achtergrond vertoont het monster van 15 minuten bijvoorbeeld een signaal van 100 relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) en vertoont het monster van 30 minuten een signaal van 150 RFU. Het gecorrigeerde signaal op 30 min is (150 RFU + de ontbrekende waarden op 15 min [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), wat 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU is. Het klaringsvolume = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 min), waarbij 1.500 het volume van de onderste kamer is (1.500 μL), S B,t het gecorrigeerde signaal op tijdstip t, en ST,60 min het signaal van de bovenste kamer op 60 min. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Kritieke punten en probleemoplossing
Alvorens met EPC-differentiatie te beginnen, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat er geen spontane celdifferentiatiegebeurtenissen zijn opgetreden in de hiPSC-culturen. De afwezigheid van spontaan gedifferentieerde cellen en het gebruik van zuivere hiPSC-kolonies is van cruciaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. De hiPSC-zaaidichtheid op dag -3 is belangrijk voor het verkrijgen van een hoge zuiverheid van CD31+ EPC's na MACS. De zaaidichtheid voor elke hiPSC-lijn en elke passage kan optimalisatie vereisen. Afhankelijk van de hiPSC-lijn en het doorgangsnummer kan de zaaidichtheid variëren van 75 x 10 3tot 400 x 10 3 hiPSC's per put van een 12-putplaat (20-100 x 103/cm2). Het minimale dichtheidscontrolepunt van hiPSC's is de celdichtheid op dag 2. De hiPSC's moeten uiterlijk op dag 2 100% confluentie bereiken. Als de hiPSC's op dag 2 niet samenvloeien, zal de zuiverheid van CD31+ EPC's na MACS meestal vrij laag zijn. In dit geval kan de hiPSC-zaaidichtheid worden verhoogd. Als grote aantallen differentiërende cellen rond dag 3 tot dag 5 van de plaat loskomen, kan de initiële hiPSC-zaaidichtheid worden verlaagd. De 7-8 μM CHIR99021 is in onze ervaring de optimale concentratie voor de hiPSC-lijnen die hier worden gebruikt, maar de concentratie moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor andere hiPSC-lijnen die mogelijk anders reageren op de remmerbehandeling. De zuiverheid van CD31+ EPC's moet voor en na MACS worden bevestigd. Alvorens verder te gaan met MACS, moet het voorgesorteerde celmengsel >10% CD31+ cellen zijn. CD31+ celpercentages van <6% resulteren doorgaans in <80% EPC's na MACS. Optimalisatie van de initiële zaaidichtheid en/of de CHIR99021-concentratie is in deze situatie nodig.
Voor succesvolle selectieve passaging en generatie van zuivere EC-monolagen is de post-MACS-zuiverheid van CD31+ EPC's van cruciaal belang. Als de zuiverheid na MACS <90% is, worden een of twee extra wasbeurten aanbevolen (stappen 1.4.11-1.4.12). Idealiter zou de post-MACS-zuiverheid >95% moeten zijn. De EPC-zaaidichtheid op met collageen gecoate platen moet worden geoptimaliseerd volgens de hiPSC-lijn om binnen 3-7 dagen 100% confluentie te bereiken. Wachten tot de EC's 100% confluent zijn, zal meestal leiden tot een succesvolle selectieve passage. Maar zelfs voor 100% confluente EC's worden de SMLCs van sommige hiPSC-lijnen ook vroegtijdig losgekoppeld. In dit geval kan selectieve passaging bij lagere confluentie (bijv. ≤80%) effectief zijn. Als sommige SMLCs eerder loskomen dan EC's, kunnen de EC's vaak niet worden gered van de gemengde EC-SMLC-populatie. In dit geval kan het nuttig zijn om de activeringstijd voor het dissociatiereagens bij passerende EC's en repetitieve selectieve passaging te verkorten. Het gebruik van een commercieel dissociatiereagens in plaats van trypsine als dissociatiereagens is gunstig voor selectieve passaging, omdat trypsine de afzonderlijke loslating van EC's en SMLCs niet toestaat. Onze permeabiliteitstests met behulp van kleine molecuultracers en het testen van tight junction- en adhesiemolecuulexpressieniveaus geven aan dat EPC's, EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs gedurende ten minste 2 jaar in vloeibare stikstof kunnen worden opgeslagen.
Betekenis en beperkingen van de methode
De methode onderscheidt CD31+ EPC's van hiPSC's door het gebruik van chemische GSK-3-remmers om Wnt/β-catenine signalering te activeren. Na positieve selectie van CD31+ EPC's door MACS, worden EPC's gekweekt in een gedefinieerd endotheelmedium dat differentiatie in gemengde endotheel- en SMLC-populaties bevordert. Selectieve passaging van deze gemengde populaties met verschillende kleefeigenschappen maakt de scheiding van EC's van SMLCs mogelijk. Na een of twee passages vertonen EECM-BMEC-achtige cellen barrière-eigenschappen en de expressie van endotheeladhesiemoleculen die die van primaire menselijke BMEC's recapituleren. Co-cultuur met SMLCs of hun supernatanten induceert de cytokine-geïnduceerde expressie van VCAM-1.
In vivo handhaaft de BBB de FOSS-homeostase door een lage paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit van moleculen vast te stellen, door het transport van voedingsstoffen via specifieke transporters en de controle van de handel van immuuncellen naar het CZS. Voor studies van de BBB is een geschikt model dat de respectieve moleculen en functies van belang weergeeft essentieel. Productie van EECM-BMEC-achtige cellen met behulp van gedefinieerde reagentia en monsters van patiënten of gezonde proefpersonen biedt een schaalbaar menselijk BBB-model. De voordelen van een model met EECM-BMEC-achtige cellen ten opzichte van andere BBB-modellen zijn: 1) een morfologie en endotheeltranscriptoomprofiel30 dat lijkt op dat van primaire menselijke BMEC's; 2) de aanwezigheid van volwassen tight junctions; 3) wenselijke barrière-eigenschappen; en 4) de robuuste expressie van endotheeladhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- en P-selectine, CD99, melanoomceladhesiemolecuul (MCAM) en geactiveerd leukocytceladhesiemolecuul (ALCAM)22. Dit model is dus bijzonder nuttig voor het bestuderen van interacties tussen immuuncellen en BMEC's. Hoewel de permeabiliteit van kleine molecuul tracers hoger is voor EECM-BMEC-achtige cellen dan die eerder gerapporteerd voor iPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen14,15, zijn de barrière-eigenschappen vrij goed te vergelijken met die beschreven voor primaire menselijke BMEC's. Deze gelijkenis geeft aan dat EECM-BMEC-achtige cellen waarschijnlijk een goed in vitro model van de BBB zijn. E-selectine-expressie op EECM-BMEC-achtige cellen onder fysiologische omstandigheden moet in aanmerking worden genomen bij het gebruik van dit model voor het bestuderen van niet-ontstoken BBB's die in vivo geen constitutieve E-selectine-expressie hebben 31. In onze vorige studie toonden we aan dat EECM-BMEC-achtige cellen de BBB konden fenocopie, zoals waargenomen in de hersenen van MS-patiënten met betrekking tot verstoorde tight junctions. Dit resulteert in een hogere permeabiliteit van kleine moleculen en een verhoogde expressie van functionele adhesiemoleculen, waardoor de verhoogde adhesie en transmigratie van immuuncellen over de BMEC-achtige cellen wordt bemiddeld32. Verder toonden we aan dat de activering van Wnt/β-catenine signalering de verstoring van tight junctions en verhoogde VCAM-1 expressie in MS-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellenkan verbeteren 32. Deze resultaten geven aan dat het model inderdaad nuttig is om de rol van de BBB bij neuro-immunologische ziekten, zoals MS, te bestuderen.
Alles bij elkaar genomen zijn EECM-BMEC-achtige cellen een veelbelovend hulpmiddel voor diepgaand begrip van pathofysiologische mechanismen op het niveau van de BBB en als een hulpmiddel om nieuwe therapeutische doelen voor BBB-stabilisatie te ontwikkelen. In de toekomst kan het model worden toegepast om BBB-disfunctie in een breder spectrum van ziekten te bestuderen en kan het wegen openen voor nieuwe therapeutische benaderingen.
Disclosures
BE ontving een subsidie van Biogen om de uitgebreide dosering van Natalizumab op T-celmigratie over de bloed-hersenbarrière te bestuderen en een subsidie van CSL Behring om de moleculaire onderbouwing van bloed-hersenbarrièredisfunctie bij neurologische aandoeningen te onderzoeken. HN en BE zijn uitvinders van de voorlopige Amerikaanse octrooiaanvragen met betrekking tot de EECM-BMEC-achtige cellen (63/084980 en 63/185815).
Acknowledgments
HN werd ondersteund door de Uehara Memorial Foundation, een ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS onder het Joint Research Program geïmplementeerd in samenwerking met SNSF (JRPs) Grant No. JPJSJRP20221507 en KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (Grant Number JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant No. YRY-2217, de ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, de Narishige Neuroscience Research Foundation, de NOVARTIS Foundation (Japan) voor de bevordering van de wetenschap, en het YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE werd ondersteund door de Swiss MS Society en de Swiss National Science Foundation (subsidies 310030_189080 en ZLJZ3_214086) en het Strategic Japanese-Swiss Science and Technology Programme (SJSSTP) subsidie IZLJZ3_214086.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
| 40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
| Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
| EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
| EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
| FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
| FlowJo version10 | BD | ||
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
| Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
| iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
| Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
| mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
| Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
| Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
| Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
| Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
- Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
- Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
- Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
- Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
- Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
- Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
- Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
- Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
- Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
- Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
