Artigo de método
O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.
As plantas micoheterotróficas apresentam uma das formas mais extremas de dependência micorrízica, tendo perdido totalmente sua capacidade autotrófica. Tão essenciais quanto qualquer outro recurso vital, os fungos com os quais essas plantas se associam intimamente são essenciais para elas. Assim, algumas das técnicas mais relevantes no estudo de espécies micoheterotróficas são as que possibilitam a investigação de fungos associados, especialmente aqueles que habitam raízes e órgãos subterrâneos. Nesse contexto, técnicas de identificação de fungos endofíticos dependentes e independentes de cultura são comumente aplicadas. O isolamento de endófitos fúngicos fornece um meio para identificá-los morfologicamente, analisar sua diversidade e manter inóculos para aplicações na germinação simbiótica de sementes de orquídeas. No entanto, sabe-se que existe uma grande variedade de fungos não cultiváveis habitando tecidos vegetais. Assim, técnicas de identificação molecular independentes de cultura oferecem uma cobertura mais ampla da diversidade e abundância de espécies. Este artigo tem como objetivo fornecer o suporte metodológico necessário para o início de dois procedimentos de investigação: um dependente de cultura e outro independente. Em relação ao protocolo cultura-dependente, são detalhados os processos de coleta e manutenção de amostras de plantas desde os locais de coleta até as instalações laboratoriais, além do isolamento de fungos filamentosos de órgãos subterrâneos e aéreos de plantas micoheterotróficas, manutenção de uma coleção de isolados, caracterização morfológica de hifas pela metodologia de cultura em lâminas e identificação molecular de fungos por extração de DNA total. Englobando metodologias independentes de cultura, os procedimentos detalhados incluem a coleta de amostras de plantas para análises metagenômicas e extração de DNA total de órgãos de plantas aclorofilas usando um kit comercial. Finalmente, protocolos de continuidade (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR], sequenciamento) também são sugeridos para análises, e técnicas são apresentadas aqui.
Os fungos endofíticos são, por definição, aqueles que habitam o interior dos órgãos e tecidos vegetais em infecções imperceptíveis (isto é, sem causar danos ao seu hospedeiro)1,2. Esses fungos podem interagir de forma neutra ou benéfica com as plantas hospedeiras, podem conferir resistência a patógenos e condições ambientais desfavoráveis e podem contribuir para a síntese de compostos benéficos para a planta (por exemplo, fatores de crescimento e outros fitohormônios)1,3. Os endofíticos micorrízicos são fungos que estabelecem associações micorrízicas c....
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1. Coleta de amostras de plantas
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No protocolo de isolamento, considerando que há contaminação da água utilizada na última lavagem e a contaminação também é detectada nas placas de Petri com fragmentos inoculados, diferentes ações podem ser tomadas, dependendo do tipo de contaminante (Tabela 1). Esse procedimento deve ser repetido desde o início no caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que também apresentam crescimento acelerado, e bactérias multiplicadoras intensas, resistentes aos antib.......
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A desinfestação superficial de amostras de plantas é uma das etapas mais críticas do protocolo apresentado. Nenhuma contaminação nas placas de PDA com gotas da última lavagem são altamente desejáveis. Bactérias são frequentemente observadas como contaminantes nas placas de isolamento, geralmente mais do que fungos esporulantes transportados pelo ar, considerando que bactérias endofíticas também são comuns nos tecidos vegetais 3,11. Assim, a adição de antibióticos.......
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Os autores não têm nada a revelar e nenhum conflito de interesses.
Agradecemos o financiamento da FAPESP (2015/26479-6) e do CNPq (447453/2014-9). JLSM agradece ao CNPq pelas bolsas de produtividade (303664/2020-7). O MPP agradece à Capes (bolsa de mestrado, processo 88887.600591/2021-00) e ao CNPq.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fita | (de qualquer empresa, para montagem de fita adesiva em análises micromorfológicas) | ||
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | A5354 | (para instalação de fragmentos de plantas; outros antibióticos podem ser usados - verifique a etapa 2.2.1) |
| Autoclave | (de qualquer empresa, para esterilização de materiais em várias etapas) | ||
| Ágar bacteriológico | Sigma-Aldrich | A1296 | (para muitas etapas) |
| Soluções C1, C2, C3, C4, C5, e C6 | Qiagen | 12888-50 | (comprado com o kit DNeasy PowerSoil) |
| Centrífuga | Merck/Eppendorf | 5810 G | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Tubos de centrífuga | Merck | CLS430828 | (para coleta de amostras) |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | C2432 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Congo red | Supelco | 75768 | (para coloração de hifas) |
| Criotubos | Merck | BR114831 | (para muitas etapas) |
| Etanol | Supelco | 100983 | Será necessário realizar as diluições apropriadas (para muitas etapas) |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Papel de filtro | Merck | WHA10010155 | (para muitas etapas) |
| Tubos de ensaio de vidro | Merck | CLS7082516 | (para criopreservação em grãos de arroz sem casca) |
| Lã de vidro | Supelco | 20411 | (para criopreservação em grãos de arroz sem casca) |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G8270 | Ou dextrose (para criopreservação em vermiculita) |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Ou glicerina (para criopreservação em vermiculita, para preparação de LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (para extração total de DNA de fungos isolados) |
| Ácido láctico | Sigma-Aldrich | 252476 | (para preparar LPCB - coloração de hifas) |
| Solução de azul de lactofenol (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (para coloração de hifas) |
| fluxo laminar | (classe I, de qualquer empresa, para muitas etapas) | ||
| Microscópio | de luz (de qualquer empresa, para observação de hifas) | ||
| MB Spin Colunas | Qiagen | 12888-50 | (adquirido com o kit DNeasy PowerSoil) |
| Azul de metila (azul algodão) | Sigma-Aldrich | M5528 | (para preparar LPCB - coloração de hifas) |
| Tubo de microcentrífuga (1,5 mL) | Merck | HS4323 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Tubo de microcentrífuga (2 mL) | Merck | BR780546 | (para muitas etapas) |
| Óleo mineral | (para preservação de isolados de fungos) | ||
| Sacos | Tamanho médio 150 mm x 200 mm (para coleta de amostras) | ||
| Placa de Petri (Vidro, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavável, para cultura de lâminas de fungos, prefira as mais altas) |
| Placa de Petri (Vidro, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (para purificação de isolados de fungos); alternativamente: placas de Petri de poliestireno (estéreis, irradiadas com γ, não autoclaváveis)Placa de |
| Petri (Vidro, 80 mm x 15 mm) | Merck/ | Marca BR455732 | (para instalação de fragmentos de plantas); alternativamente: placas de Petri de poliestireno (estéreis, irradiadas com γ, não autoclaváveis) |
| Fenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (para extração total de DNA de isolados de fungos, para preparação de LPCB) |
| Porcelana argamassa | Sigma-Aldrich | Z247464 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Pilão de porcelana | Sigma-Aldrich | Z247502 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Ágar batata dextrose (PDA) | Millipore | P2182 | para muitas etapas) |
| Tubos PowerBead | Qiagen | 12888-50 | comprado com kit DNeasy PowerSoil) |
| Montagem rápida meio (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (para cultura de lâminas de fungos) |
| Sílica gel | Supelco | 717185 | (para criopreservação em grãos de arroz sem casca) |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauril sulfato de sódio (para extração de DNA total de isolados de fungos) |
| Hipoclorito de sódio (c/ 2% de cloro ativo) | (produto comercial, para desinfestação superficial) | ||
| Kit de extração de DNA do solo (kit DNeasy PowerSoil) | Qiagen | 12888-50( | para extração total de DNA de órgãos vegetais) |
| Espectrofotômetro - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (para extração total de DNA de órgãos vegetais) |
| Estereomicroscópio | (=microscópio de dissecação, de qualquer empresa, para análises macromorfológicas) | ||
| Tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660 | (para instalação de fragmentos de plantas) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (ou de outras empresas) |
| Homogeneizador de tecidos e lisador de células | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Homogeneizador de Tecidos Automatizado e Cell Lyzer (para extração total de DNA de órgãos vegetais) | |
| Azul de toluidina O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (para coloração de hifas) |
| Trealose | Sigma-Aldrich | T9531 | (para criopreservação em vermiculita) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Grãos | (para criopreservação) | ||
| Haste | (ou uma adaptação - verifique a etapa 5.4.1, para cultura de lâminas de fungos) | ||
| Vermiculita | Granulometria fina (para criopreservação em vermiculita) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich / BenchMixer | BMSBV1000 | (para extração total de DNA de isolados de fungos) |
| Extrato de levedura | Sigma-Aldrich | Y1625 | (para criopreservação em vermiculita) |
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Solicitar permissãoAn erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
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Juliana Lischka Sampaio Mayer