Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Praapti Jayaswal; Mohd Ilyas; Kuljit Singh; Saurabh Kumar; Lovely Sisodiya; Sapna Jain; Rahul Mahlawat; Nishant Sharma; Vishal Gupta; Krishnamohan Atmakuri

doi:10.3791/65138

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Artigo de método

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

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DOI:

10.3791/65138

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8 de dezembro de 2023

Praapti Jayaswal¹ , Mohd Ilyas¹ , Kuljit Singh¹^,² , Saurabh Kumar¹^,³ , Lovely Sisodiya¹ , Sapna Jain¹ , Rahul Mahlawat¹ , Nishant Sharma¹^,⁴ , Vishal Gupta¹ , Krishnamohan Atmakuri¹

¹Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, ²Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, ³ICAR-Research Complex for Eastern Region, ⁴Public Health Research Institute, Rutgers University

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Resumo

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Resumo

A maioria das bactérias, incluindo as micobactérias, gera vesículas extracelulares (EVs). Uma vez que os EVs bacterianos (bEVs) contêm um subconjunto de componentes celulares, incluindo metabólitos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, vários grupos avaliaram as versões nativas ou recombinantes de bEVs por sua potência protetora como candidatos a vacinas de subunidades. Ao contrário dos EVs nativos, os EVs recombinantes são projetados molecularmente para conter um ou mais imunógenos de interesse. Na última década, diferentes grupos têm explorado diversas abordagens para a geração de bEVs recombinantes. No entanto, aqui relatamos o projeto, construção e enriquecimento de EVs micobacterianos recombinantes (mEVs) em micobactérias. Para tanto, utilizamos como sistema modelo o Mycobacterium smegmatis (Msm), uma micobactéria avirulenta do solo. Primeiramente descrevemos a geração e o enriquecimento de EVs nativos de Msm. Em seguida, descrevemos o projeto e a construção de mEVs recombinantes que contêm mCherry, uma proteína repórter fluorescente vermelha, ou EsxA (Esat-6), um imunógeno proeminente do Mycobacterium tuberculosis. Conseguimos isso fundindo separadamente mCherry e EsxA N-termini com o término C de uma pequena proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 é uma das poucas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. O protocolo para gerar e enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm permanece idêntico à geração e enriquecimento de EVs nativos de Msm.

Introdução

Apesar do desenvolvimento e administração de uma ampla gama de vacinas contra doenças infecciosas, até hoje, ~30% de todas as mortes humanas ainda ocorrem por doenças transmissíveis¹. Antes do advento da vacina contra a tuberculose (TB) - Bacilo Calmette Guerin (BCG) - a TB era a principal causa de morte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)². Com a administração de BCG e o fácil acesso a medicamentos anti-TB de primeira e segunda linha, em 2022, as mortes relacionadas à TB caíram drasticamente para ~1 milhão/ano em 2022 (ou seja, ~15-20/100.000 habitantes¹). No entanto, em populações endêmicas de....