Aprimoramento da Enumeração de Esporos de Bacillus subtilis e Análise de Marcação em Citometria de Fluxo

Resumo

Este protocolo enfoca o uso de citometria de fluxo e contagem de esferas para quantificar esporos bacterianos marcados com brometo de etídio. O método também é eficiente para analisar o acoplamento covalente de proteínas na superfície de esporos intactos.

Resumo

Os esporos de Bacillus subtilis já foram propostos para diferentes aplicações biotecnológicas e imunológicas; No entanto, há uma necessidade crescente para o desenvolvimento de metodologias que melhorem a detecção de antígenos imobilizados na superfície de esporos juntamente com sua quantificação. Análises baseadas em citometria de fluxo têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de B. subtilis. Neste trabalho, propomos o uso da citometria de fluxo para avaliar a eficiência de exibição de um anticorpo fluorescente (AG) na superfície do esporo e quantificar o número de esporos usando esferas de contagem.

Para isso, utilizamos brometo de etídio como marcador de DNA e um anticorpo marcado com aloficocianina (APC), que foi acoplado aos esporos, como marcador de superfície. A quantificação dos esporos foi realizada por meio da contagem de contas, uma vez que esta técnica demonstra alta acurácia na detecção das células. Os esporos marcados foram analisados por citômetro de fluxo, que confirmou o acoplamento. Como resultado, demonstrou-se que a marcação de DNA melhorou a precisão da quantificação por citometria de fluxo, para a detecção de esporos germinados. Observou-se que o brometo de etídio não foi capaz de marcar esporos dormentes; No entanto, esta técnica fornece uma determinação mais precisa do número de esporos com proteína fluorescente acoplada à sua superfície, auxiliando assim no desenvolvimento de estudos que enfoquem o uso de esporos como plataforma biotecnológica em diferentes aplicações.

Introdução

Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, em forma de bastonete, capaz de produzir esporos quiescentes quando as condições ambientais não permitem o crescimento celular¹. Os esporos são formas celulares extremamente estáveis e os de várias espécies, incluindo B. subtilis, são amplamente utilizados como probióticos para uso humano e animal². Devido às suas propriedades de resistência e segurança, o esporo de B. subtilis, que apresenta proteínas heterólogas, tem sido proposto como adjuvante da mucosa, sistema de liberação vacinal e plataforma enzimática ^3,4

Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e software usados neste protocolo.

1. Configuração da citometria de fluxo

1. Alinhamento dos parâmetros ópticos do citômetro de fluxo acoplado a um computador
   1. Faça login no software Cytometer.
   2. No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro | Inicie e aguarde alguns minutos | Modo de limpeza | Sente-se fluidos.
      OBS: Bolhas de ar e obstruções foram removidas durante o processo de início do citômetro, antes da aquisição da amostra.
   <....

Resultados

Em amostras de esporos autoclavados (AS), 2 × 10³ esporos/μl e 1 ×^{10 3} esporos/μl foram detectados usando contagem de contas e o método de Petroff-Hausser, respectivamente (Figura 2).

Figura 1: Esquema geral de quantificação dos esporos. (A) Esporos marcados com EtBr e (.......

Discussão

Métodos tradicionais, como a contagem em placas de colônias, não só são demorados, como também necessitam de células viáveis e não permitem a quantificação de esporos inativados5. A câmara de Petroff-Hausser é uma metodologia alternativa, mas requer um microscopista experiente para realizá-la. A citometria de fluxo tem se mostrado uma alternativa útil para esse fim.

Genovese et ^al.12 descreveram o uso da citometria de fluxo para a quantificação d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(N-hidroxisuccinimida) (NHS)	Sigma	130672
Anticorpo fluorescente humano	BioLegend	501410	APC anti-IL-10
humana Anticorpo fluorescente de camundongo	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II			Citômetro de fluxo
BD FACSConfiguração e configuração do citômetro de diva Kit de Contas de Rastreamento (use com o software BD FACSDiva v 6.x)	BD	642412	Reagente de controle de qualidade
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	Software BD	643629
Centrífuga MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Contas de Contagem	BD	340334	Tubos TruCount
Eclipse 80i	Nikon		Microsope Fluorescente
Brometo de etídio	Ludwig Biotec
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	A4503
Microtubos de plástico	Eppendorf
Tubo de poliestireno	Falcon	352008	Tubo de poliestireno de 5 mL, 12 x 75 mm, sem tampa, não estéril

BD