O arranjo de anestesia seriado para a investigação de alto rendimento de agentes voláteis usando Drosophila melanogaster

A existência de efeitos anestésicos colaterais (isto é, efeitos que não são imediatamente observáveis, mas podem ter consequências comportamentais tardias) é geralmente aceita, mas a compreensão de seus mecanismos e fatores de risco permanece rudimentar ^1,2. Sua manifestação tardia e sutileza limitam o número de variáveis potencialmente importantes que podem ser investigadas em modelos de mamíferos dentro de prazos razoáveis e a um custo aceitável. A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) oferece vantagens únicas no contexto de doenças neurodegenerativas³ e para triagem toxicológica⁴ que, até o momento, não foram aplicadas ao estudo dos efeitos colaterais anestésicos.

Desenvolvemos o seriado anesthesia array (SAA) para facilitar o uso de moscas-das-frutas no estudo da farmacodinâmica e farmacogenética dos anestésicos. Uma das principais vantagens da SAA é a exposição simultânea a condições experimentais idênticas de múltiplas coortes. Quando combinado com a flexibilidade experimental de moscas-das-frutas, o alto rendimento do SAA permite a exploração de variáveis biológicas e ambientais em uma escala impossível em modelos de mamíferos.

Em princípio, o SAA é simplesmente uma série de locais anestesiantes conectados (câmaras feitas de frascos de 50 mL) através dos quais um gás transportador fornece agentes voláteis. A primeira câmara do sistema contém água destilada através da qual o gás transportador é umidificado (as moscas são sensíveis à desidratação), e termina com um indicador de fluxo simples que indica o fluxo de gás através do sistema. Redes finas colocadas nas aberturas da tubulação de conexão separam as câmaras para evitar a migração de moscas entre as câmaras. O número de locais "em série" é limitado pela resistência ao fluxo de gás não pressurizado (tubulações, redes).

Caracterizamos a cinética deste protótipo SAA em publicação^anterior5. Embora as propriedades farmacocinéticas exatas variem entre os AAS, os fundamentos relevantes que foram testados experimentalmente são os seguintes: (i) um fluxo inicial de 1,5-2 L/min equilibra todas as câmaras (volume total de ±550 mL) com a concentração desejada de anestésico dentro de 2 min; (ii) a concentração de vapor anestésico entregue às câmaras não muda sensivelmente entre o primeiro e o último local, porque a quantidade de anestésico contida no volume de gás em uma câmara individual (50 mL) excede em muito a quantidade absorvida por qualquer número de moscas; e (iii) uma vez que as câmaras estejam equilibradas, o fluxo de gás carreador pode ser reduzido (50-100 mL/min ou menos) para evitar desperdício e contaminação do ambiente (os anestésicos voláteis têm propriedades de gases de efeito estufa). O fluxo mínimo necessário para manter uma concentração de vapor em estado estacionário depende principalmente do vazamento do SAA, já que a absorção de vapor pelas moscas é desprezível. Nessas condições padrão (isoflurano a 2% e fluxo de gás carreador de 1,5 L/min), as moscas são anestesiadas (imóveis) em todas as posições da matriz dentro de 3-4 min, com diferenças imperceptíveis entre as posições. Os VGAs podem ser administrados por minutos a horas, e nossos paradigmas típicos de exposição estão na faixa de 15 min a 2 h. Para lavar o sistema, o vaporizador é desligado e o fluxo é mantido para trocar aproximadamente 10x volumes do array (1,5 L/min por 5 min). A velocidade de eliminação do anestésico varia de acordo com a taxa de fluxo definida.

Os agentes anestésicos voláteis interagem com inúmeros alvos ainda não identificados, incluindo o sistema imune-inflamatório⁶. A contribuição de alvos moleculares individuais para desfechos primários versus colaterais (o "estado anestésico" vs. "efeitos colaterais" de longo e curto prazo) é pouco compreendida. Portanto, um sistema de moscas sensíveis e de alto rendimento é valioso para informar experimentos em animais superiores, apesar das diferenças óbvias entre moscas e mamíferos⁷. Algumas diferenças podem, de fato, ser vantajosas; Por exemplo, o sistema imunológico da mosca difere do de animais superiores por não possuir o braço adaptativo da resposta⁸. Embora isso possa parecer uma limitação para a compreensão da doença em humanos, oferece uma oportunidade única para estudar a interação dos VGAs com a resposta imune-inflamatória inata isoladamente da resposta adaptativa⁹. Isso permite estudar os efeitos farmacológicos da VGA sobre a inflamação e sua modulação pelos variados backgrounds genéticos presentes em uma população.

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais usados no protocolo.

1. Construção do AEA

1. Faça a armação cortando madeira e montando a moldura usando as dimensões da Figura 1A.
2. Modificar tampas de tubo cônico de 50 mL.
   1. Faça dois furos em cada tampa com uma broca de 9/32 polegadas. Lixe os buracos para limpar o plástico esfarrapado. Lixe a parte superior da tampa para rugar a superfície (isso ajuda na adesão da cola).
   2. Cortar pipetas sorológicas de 5 mL para o tamanho (3 em para entrada e 1,5 em para saída) marcando o plástico e, em seguida, quebrando-o limpo na linha marcada. Lixe as extremidades das pipetas cortadas/quebradas.
   3. Cole a rede nos tubos (permita o tempo de secagem adequado para o adesivo). Corte a rede até o tamanho do tubo após o adesivo secar.
   4. Insira os tubos nos orifícios das tampas cônicas com ambos os tubos estendendo-se (3/4 pol) acima da tampa; certifique-se de que o tubo de entrada se estenda por mais tempo no tubo do que o fluxo de saída (Figura 1B).
   5. Aplique cola na parte superior das tampas ao redor dos tubos para fixar as peças juntas (permita um tempo de secagem adequado para o adesivo antes de continuar).
3. Fixe as tampas ao quadro e direcione a tubulação (Figura 1C).
   1. Conecte cabos adesivos à estrutura (3,25 pol. de distância, centro a centro).
   2. Afixar as tampas na moldura usando gravatas zip; Corte as pontas da etiqueta de gravata zip.
   3. Corte e conecte os comprimentos (9 pol) da tubulação Tygon aos tubos de entrada/saída em cada tampa modificada (Figura 1D). Começando na extremidade a montante, conecte primeiro à entrada e, em seguida, conecte a tubulação da saída à entrada da próxima posição.
   4. Adicione um indicador de fluxo à "entrada" mais a jusante (posição 10, Figura 1E).
   5. Colocar um tubo cônico de 50 mL na primeira posição e preenchê-lo com água logo abaixo do tubo de entrada (Figura 1F).
4. Prepare a interface para o vaporizador. Remova os êmbolos, corte os entalhes de duas seringas dosadoras de 10 mL (1/2 de profundidade x 1/4 de largura, Figura 1G) e insira-os na entrada e saída do vaporizador com os entalhes voltados diretamente para a frente do vaporizador para alinhamento com os orifícios (Figura 1H). Opcional: Cole as seringas modificadas no lugar. Se for acessível, use um coletor comercial (consulte a Tabela de Materiais para obter uma opção).
5. Conecte todo o sistema. Use a tubulação Tygon para unir os componentes na seguinte ordem: tanque de gás transportador com regulador > medidor de vazão específico para gás > vaporizador > SAA (Figura 1C).
6. Preencha as posições vazias na matriz com tubos cônicos vazios de 50 mL. Ligue o tanque de gás, abra o medidor de vazão para ~2 L/min e ligue o vaporizador para 0%. Confirme o fluxo de gás através do sistema verificando o fluxo do medidor de vazão a montante do vaporizador e o indicador de vazão a jusante da última câmara do SAA quanto ao fluxo. Alternativamente, insira a extremidade da tubulação a jusante na água e procure bolhas.
   NOTA: Como o sistema não é pressurizado, uma coluna de água superior a alguns centímetros interromperá o fluxo. Se não houver fluxo na extremidade a jusante da matriz, verifique o seguinte: o vaporizador precisa estar ligado para permitir o fluxo; verificar se o regulador do tanque e os medidores de vazão estão permitindo a vazão; Verifique as posições da matriz para certificar-se de que os tubos estão bem rosqueados; e verifique se há vazamentos ao redor do adesivo nas tampas modificadas.

Figura 1: Construção do SAA. (A) Esquema, com medidas, da estrutura de madeira que suporta o SAA. (B) Corte transversal esquematizado, com medidas, de tampa modificada com tubos de entrada e saída confeccionados com pipetas sorológicas de 5 mL. (C) SAA montada (reproduzida de Olufs et ^al.5) (D) Detalhes de uma tampa cônica modificada de 50 mL mostrando tubos de entrada e saída. (E) Escoamento a jusante (posição 10) com o indicador de vazão. (F) Tubo a montante (posição 1) cheio de água para umidificar o gás transportador. A seta vermelha indica o nível da água. (G) Seringa dosadora modificada de 10 mL para o coletor improvisado. O círculo vermelho destaca o entalhe de corte localizado entre as marcas de 8 mL e 10 mL (ou 1/2 pol x 1/4 pol). (H) Vista traseira do vaporizador Tec7 mostrando a inserção e orientação das seringas modificadas. Apenas uma seringa está no lugar nesta vista para mostrar, à esquerda, o orifício (seta vermelha) que precisa ser alinhado com o entalhe da seringa modificada. Nota: O desalinhamento deste entalhe de corte e a abertura da saída irão perturbar a administração do anestésico. Esta parte é um potencial ponto fraco neste sistema personalizado. Se houver fundos disponíveis, um coletor comercial deve ser usado. Abreviação: SAA = serial anesthesia array. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Antes da exposição anestésica

1. Vinte e quatro horas ou mais antes da exposição ao anestésico, classifique as coortes de moscas conforme necessário para o experimento usando o método preferido (por exemplo, CO₂ ou éter).

3. Funcionamento do AEA

1. Transfira moscas de frascos para frascos de alimentos para tubos cônicos vazios de 50 mL (sem CO₂).
   1. Conte e registre todas as moscas mortas antes da exposição.
2. Uncap e rosquear tubos cônicos de 50 mL com moscas sobre o SAA.
3. Ligue o gás transportador e ajuste para a vazão desejada.
   NOTA: Nós normalmente usamos 1-2 L/min.
4. Ajuste o vaporizador anestésico para a concentração desejada.
   NOTA: Normalmente usamos 2% para isoflurano e 3,5% para sevoflurano, que são doses equipotentes em mamíferos¹⁰.
5. Expor as moscas pela duração desejada (min: 15 min).
   NOTA: Recomenda-se um tempo mínimo de exposição de 15 min para evitar uma possível variabilidade no equilíbrio entre as posições do SAA. Nesse sistema, os anestésicos levam de 2 a 3 minutos para se equilibrarem em todas as posições.
6. Ao final da exposição, lave o sistema com fluxo de gás fresco (vaporizador regulado para 0%) a 1,5 L/min por 5 min, correspondendo a aproximadamente 10x volumes do volume total de SAA.

4. Lista de verificação antes de iniciar um experimento

1. Abra o regulador de alta pressão (na parte superior do tanque de ar) completamente e, em seguida, feche-o meia volta para garantir o fluxo de gás transportador.
2. Siga a tubulação de cada linha para os i) fluxômetros e ii) vaporizador (certifique-se de que a entrada/saída esteja conectada corretamente) e iii) verifique o nível anestésico nos vaporizadores.
3. Depois de carregar as câmaras com os sujeitos, verifique se o ar/gás está fluindo com o teste de bolhas ou o indicador de fluxo.
   NOTA: Alguns vaporizadores não permitem o fluxo de ar quando o mostrador está na posição desligada.
4. Quando o gás estiver fluindo, confirme se o medidor de vazão e o indicador de fluxo a jusante indicam vazão.
5. Ao final do experimento, aguarde 4-5 min de fluxo aéreo para lavar o anestésico.

Um link de vídeo SAA é fornecido aqui: Perouansky Research Methods - Department of Anesthesiology - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Nosso laboratório utilizou a SAA para (i) estudar o efeito do genótipo na sensibilidade comportamental aos anestésicos5; (ii) triagem de mutantes mitocondriais para efeitos colaterais dos anestésicos11; e (iii) investigar a farmacodinâmica do isoflurano e do sevoflurano sobre os desfechos no traumatismo cranioencefálico (TCE)12,13,14,15,16,17. Os resultados publicados demonstram claramente que o background genético influencia a farmacodinâmica dos AGVs utilizados clinicamente, tanto em relação ao fenótipo convencional de anestesia quanto aos efeitos colaterais da toxicidade anestésica, bem como à proteção tecidual 5,11,13,14,15.

Exemplo representativo 1 (Figura 2):Deriva genética na resiliência à toxicidade do isoflurano detectada por condições experimentais reprodutíveis de forma confiável
A descoberta de uma mudança quantitativa gradual na mortalidade induzida pela VGA entre moscas ND2360114 cultivadas separadamente é um exemplo da utilidade de comparações confiáveis da farmacodinâmica anestésica entre grupos experimentais usando o SAA. ND23 é um gene que codifica uma subunidade no núcleo do Complexo I do mETC (análogo ao Ndufs8 em mamíferos)18. Mutações nessa subunidade são causa da síndrome de Leigh, uma doença mitocondrial letal. Observamos um enfraquecimento gradual do fenótipo de mortalidade induzida pelo isoflurano ao longo do tempo em vários estoques homozigotos ND2360114 cultivados simultaneamente sob condições laboratoriais padrão (ou seja, sem exposição a VGAs). Essa adaptação evolutiva à toxicidade do isoflurano ocorreu na ausência de qualquer exposição aos VGAs e é provavelmente um efeito colateral da "sobrevivência do mais apto" dentro dos estoques mutantes. Essa mudança gradual na sensibilidade ao isoflurano teria permanecido não reconhecida sem nossa confiança de que as condições experimentais eram idênticas ao longo dos ensaios e ao longo do tempo. Concluímos que a seleção favorece modificadores dos efeitos da ND2360114, com aumento coincidente da resiliência à toxicidade do isoflurano. Como a inflamação no sistema nervoso central desempenha um papel importante na patogênese da síndrome de Leigh, a evolução da resistência testemunhada pode ser devida a mudanças adaptativas na resposta imune-inflamatória inata, sendo a resistência à toxicidade do isoflurano um subproduto acidental.

Figura 2: Variação na mortalidade induzida pela toxicidade do isoflurano como resultado da pressão evolutiva em moscas ND2360114. Sete linhagens (A-G) isoladas de uma única população através de acasalamentos de par único, expandidas e testadas para mortalidade em 24 h (PM24) após exposição de 2 h ao isoflurano a 2% (aos 10-13 dias de idade) apresentam variabilidade no fenótipo decorrente de uma única população. Dados apresentados em gráficos de caixa e bigode. As caixas representam o segundo e terceiro quartis dos dados, com os bigodes estendendo-se aos pontos de dados mínimo e máximo. A média e a mediana são indicadas por "+" e linhas horizontais, respectivamente. As porcentagens de mortalidade das réplicas individuais (N) são mostradas como círculos. N = 3-4 frascos para injetáveis de 20-50 moscas/frasco. Valor de p para uma ANOVA unidirecional comum; p = 0,012 indica diferença significativa entre as médias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Exemplo representativo 2 (Figura 3): Ilustração de uma aplicação de alto rendimento do SAA para revelar efeitos genéticos de base na farmacodinâmica do isoflurano
Como exemplo do alto rendimento do sistema, a Figura 3 ilustra os efeitos de exposições idênticas ao isoflurano (15 min de isoflurano a 2%) previamente ao traumatismo cranioencefálico (TCE)16, protocolo que testa o pré-condicionamento anestésico (PA) nesse modelo de mosca13,15,19. A leitura é mortalidade 24 h após TCE corrigido para atrito natural (IM24). Nesse modelo, todas as moscas recuperaram a mobilidade (isto é, estavam vivas) dentro de 30 minutos após o TCE, e a mortalidade registrada no IM24 foi resultado de lesão cerebral secundária (ICE). Nas quatro linhagens, a PA com isoflurano reduziu o IM24 em vários graus, indicando que a responsividade à PA é uma característica quantitativa. Como a resposta inflamatória é um fator importante na morbidade por ISCs, a PA pode envolver modulação do sistemaimune20.

Figura 3: Influência do background genético na supressão da mortalidade (IM24) pelo pré-condicionamento com isoflurano. O pré-condicionamento de moscas com 15 min de isoflurano a 2% (roxo) reduziu o índice de mortalidade em 24 h (IM24) nas cepas w 1118 e y1w1118 (p < 0,0001 e p = 0,036, respectivamente). O IM 24 não foi significativamente menor nas linhas pré-condicionadas Oregon R (OR) e Canton S (CS) (p = 0,16 e p = 0,27, respectivamente). Dados apresentados em gráficos de caixa e bigode. As caixas representam o segundo e terceiro quartis dos dados, com os bigodes estendendo-se aos pontos de dados mínimo e máximo. A média e a mediana são indicadas por "+" e linhas horizontais, respectivamente. Os valores de MI24 das réplicas individuais (N) são mostrados como círculos. N = 15-33 frascos de 30-40 moscas/frasco para moscas tratadas com TCE. N = 2-15 frascos para injetáveis de 30-40 moscas/frasco para controlos não tratados. Valores de p de um teste t de Student bicaudal não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.