Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

Summary

Aqui, descrevemos a produção e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos. Os nanodiscos de anfotericina B são tomados como exemplo para descrever o protocolo de forma escalonada.

Abstract

O termo nanodisco refere-se a um tipo discreto de nanopartícula composto por uma bicamada formando lipídio, uma proteína de andaime e um agente bioativo integrado. Os nanodiscos são organizados como uma bicamada lipídica em forma de disco cujo perímetro é circunscrito pela proteína do andaime, geralmente um membro da família das apolipoproteínas trocáveis. Numerosos agentes bioativos hidrofóbicos têm sido eficientemente solubilizados em nanodiscos por sua integração no meio hidrofóbico da bicamada lipídica da partícula, produzindo uma população amplamente homogênea de partículas na faixa de 10-20 nm de diâmetro. A formulação de nanodiscos requer uma proporção precisa de componentes individuais, uma adição sequencial apropriada de cada componente, seguida de sonicação em banho da mistura de formulação. A proteína do arcabouço anfipático entra em contato espontaneamente e reorganiza a bicamada dispersa formando mistura lipídico/agente bioativo para formar uma população discreta e homogênea de partículas de nanodisco. Durante esse processo, a mistura de reação faz a transição de uma aparência opaca e turva para uma amostra clarificada que, quando totalmente otimizada, não produz precipitado após a centrifugação. Estudos de caracterização envolvem a determinação da eficiência de solubilização de agentes bioativos, microscopia eletrônica, cromatografia de filtração em gel, espectroscopia de absorbância no ultravioleta visível (UV/Vis) e/ou espectroscopia de fluorescência. Isto é normalmente seguido por uma investigação da actividade biológica utilizando células cultivadas ou ratinhos. No caso de nanodiscos que abrigam um antibiótico (isto é, o antibiótico polieno macrolídeo anfotericina B), sua capacidade de inibir o crescimento de leveduras ou fungos em função da concentração ou do tempo pode ser medida. A relativa facilidade de formulação, versatilidade em relação às partes componentes, tamanho de partícula em nanoescala, estabilidade inerente e solubilidade aquosa permitem inúmeras aplicações in vitro e in vivo da tecnologia de nanodiscos. No presente artigo, descrevemos uma metodologia geral para formulação e caracterização de nanodiscos contendo anfotericina B como agente bioativo hidrofóbico.

Introduction

As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas¹. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das ....

Protocol

1. Transformação, expressão e purificação do componente proteico do andaime

1. Transformação bacteriana BL21 com apoE4-NT contendo plasmídeo
   1. Descongelar um tubo de células competentes BL21 (DE3) no gelo por 10 min.
   2. Depois que todo o gelo derreter, misture suave e cuidadosamente pipetar 50 μL das células em um tubo de transformação sobre gelo.
   3. Adicionar 5 μL contendo 50 ng de ADN plasmidial (para sequência, ver quadro suplementar 1) à mistura celular. Agite cuidadosamente o tubo quatro ou cinco vezes para misturar. Não vórtice.
   4. Coloque a mistura no gelo por 30 min.
   5. Choque térmic....

Results

Processo de formulação de nanodiscos de agentes bioativos
No procedimento de formulação de ampB-nanodisco descrito, a reação é considerada completa quando a aparência da amostra transita de turva para clara (Figura 1). Essa alteração indica que nanodiscos se formaram e que o agente bioativo foi solubilizado. Muitas vezes, os agentes bioativos absorvem luz na região do comprimento de onda visível (por exemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q₁₀) e, nesses ca.......

Discussion

A formulação de um agente bioativo contendo nanodiscos fornece um método conveniente para solubilizar compostos hidrofóbicos insolúveis. Como os nanodiscos do agente bioativo do produto são totalmente solúveis em meio aquoso, eles fornecem um método de liberação útil para uma ampla gama de moléculas hidrofóbicas (Tabela 1). Estes incluem pequenas moléculas, drogas naturais e sintéticas, fitonutrientes, hormônios, etc. A estratégia de formulação geralmente segue um protocolo padrão que deve levar em consi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anfotericina B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulação &
Ampicilina	Fisher Scientific	BP17925	Transformação e Expansão
ApoE4-NT Plasmídeo	GenScript	N/A	Transformação
Frasco Defletor	New Brunswick Scientific	N/A	Expansão & Expressão
BL21 competente E coli New	England Biolabs	C2527I
Frascos de centrífuga	de transformação Nalgene	3140-0250	Expressão
Clorofórmio	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulação
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Padrão Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulação
Frasco Erlenmeyer	Bellco Biotecnologia N	/ A	Expansão & Tubos
Falcão	Sarstedt Ag & Co	D51588	Ensaio de Viabilidade de Levedura
Tubos de borossilicato de vidro	VWR	47729-570	ND Formulação
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Ensaio de Viabilidade de Levedura
Banho de Sonicação Aquecido	VWR	N/A	ND Formulaton
Módulo de aquecimento e nitrogênio	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulação
HiTrap Heparina HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purificação
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo	Centrífuga Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25	Beckman Coulter	J325-IM-2	Rotor Expression
JA-14	Beckman Coulter	339247
Expression Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulação
Metanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulação
Gás nitrogênio	Praxair	UN1066	ND Formulação
NZCYM mídia	RPI Produtos de pesquisa	N7200-1000.0	Expansão e Expressão
Vetor Pet-22B	GenScript	N/A	Transformação Placa
Petri	Fisher Scientific	FB0875718	Transformação & Cuvetes
de quartzo	Marca Fisher	14385 928A	Incubadora de agitação de análise espectral
	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformação, Expansão e Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purificação
SnakeSkin Tubo de Diálise	Thermo Scientific	68100	Purificação
SnakeSkin Tubo de Diálise	Thermo Scientific	88243	Purificação
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S271
Purificação Fosfato de Sódio dibásico	Fisher Scientific	S374-500	Purificação
de Fosfato de Sódio monobásico	Fisher Scientific	BP329-500
Purificação Espectros / POR Tampas Ponderadas	Espectro Indústrias Médicas	132736
Espectrofotômetro	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	análise espectral
Centrífuga de mesa Beckman	Coulter	366816	ND Formulação
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Análise Espectral
Filtro a vácuo	Millipore	9004-70-0	Expressão & Bomba
	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purificação
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulação
Levedura	N / A	BY4741	Ensaio de Viabilidade de Levedura
Extrato de Levedura-Peptona-Dextrose	BD	242820	Ensaio de Viabilidade de Levedura