Fabricação de Micropartículas Poliméricas Pulsáteis Encapsulando o Antígeno Rábico

Resumo

Este método descreve a encapsulação do antígeno da raiva em micropartículas poliméricas biodegradáveis com propriedades estruturais e materiais que permitem a liberação pulsátil após um atraso pré-determinado. A avaliação ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) do antígeno recuperado do núcleo da partícula confirma a presença de glicoproteína intacta do vírus trimérico da raiva através da fabricação de partículas.

Resumo

As diretrizes atuais para profilaxia pós-exposição à raiva requerem múltiplas injeções administradas ao longo de várias semanas. Isso pode ser desproporcionalmente oneroso para aqueles que vivem em países de baixa e média renda (PBMRs), onde a maioria das exposições mortais à raiva ocorre. Diferentes estratégias de liberação de fármacos têm sido exploradas para condensar regimes vacinais em uma única injeção por meio do encapsulamento de antígenos em partículas poliméricas. No entanto, estressores severos durante o processo de encapsulação podem causar desnaturação do antígeno encapsulado. Este artigo descreve um método para encapsular o antígeno do vírus da raiva (RABV) em micropartículas poliméricas que exibem liberação pulsátil ajustável. Este método, denominado Partículas Uniformemente Liquificadas e Seladas para Encapsular Fármacos (PULSED), gera micropartículas usando litografia suave para criar moldes inversos de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de um molde mestre multifóton impresso em 3D. Filmes de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) são então moldados por compressão nos moldes PDMS para gerar cilindros de face aberta que são preenchidos com RABV concentrado usando um robô de dosagem piezoelétrico. Essas microestruturas são então seladas pelo aquecimento do topo das partículas, permitindo que o material flua e forme uma barreira polimérica contínua e não porosa. Após a fabricação, um ensaio imunoenzimático (ELISA) específico para a detecção da glicoproteína intacta do vírus da raiva trimérica é usado para confirmar a alta recuperação do antígeno imunogênico das micropartículas.

Introdução

A vacinação é uma ferramenta de saúde extremamente eficaz, tendo evitado mais de 37 milhões de mortes entre 2000 e 2019¹. Apesar dessa eficácia, as doenças imunopreveníveis continuam a representar um risco significativo para a saúde global, especialmente em países de baixa e média renda (PBMRs), onde altas taxas de não vacinação e subvacinação contribuem para 1,5 milhão de mortes evitáveis por vacina anualmente². A raiva não é exceção a essas disparidades. Apesar de seu status como a doença mais mortal conhecida pela humanidade, sendo quase universalmente fatal, a raiva é totalmente tratável e é classificada como erradicada em muitos países de alta renda. Em vez disso, o fardo da raiva é desproporcionalmente suportado por pessoas que vivem em partes da Ásia e da África, onde a doença tem resultados devastadores em humanos e animais ^3,4.

A vacinação é fundamental para o manejo do impacto global da raiva⁵. O custo da vacinação impede a implementação generalizada da profilaxia pré-exposição (PrEP), considerando a baixa incidência geral da doença. Além disso, em PBMRs, a utilidade da profilaxia pós-exposição (PEP) é limitada por pressões socioeconômicas sobre os pacientes que procuram serviços de saúde. Fatores logísticos, como a distância de deslocamento até os pontos de acesso à saúde, a perda salarial durante a obtenção do tratamento, o custo do tratamento, a interferência nas consultas nas atividades diárias e o esquecimento, resultam em taxas de adesão ao PEP de até 60%^6,7. Essa alta taxa de atrito dos pacientes representa uma oportunidade para refinar as abordagens para abordar as lacunas na vacinação antirrábica, a fim de combater a doença.

Sistemas de vacinação de injeção única (SI) que controlam a liberação de antígenos têm sido explorados como formas de se obter a imunização completa em uma injeção. Eliminar a necessidade de múltiplas visitas a um profissional de saúde atenua os encargos que impedem os indivíduos de procurar cuidados adequados. Para conseguir a vacinação SI, um antígeno é tipicamente encapsulado dentro de uma matriz polimérica biodegradável que muitas vezes assume a forma de micropartículas injetáveis. Uma vez injetado, o polímero degrada e libera o antígeno sequestrado. Até o momento, duas estratégias de liberação primária foram perseguidas para alcançar a vacinação contra o SI. Em uma abordagem, o antígeno é liberado continuamente durante um longo período de tempo. Embora destinada a aumentar a imunogenicidade de uma única injeção, não está claro se essa abordagem é suficiente para provocar uma resposta imune protetora contra o vírus da raiva (RABV) em humanos⁸. No outro, o antígeno é liberado após um atraso pré-determinado para imitar um regime de vacina convencional e comprovadamente prime-boost. Os métodos de secagem por spray e fabricação de micropartículas baseados em emulsão/evaporação de solvente exibem a primeira estratégia e têm sido usados para encapsular com sucesso tanto vacinas modelo⁹ quanto antígenos altamente estáveis, como o toxoide tetânico¹⁰. No entanto, esses métodos de encapsulação envolvem estressores, incluindo calor, interação com solventes e forças físicas, que podem desnaturar antígenos¹¹.

Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) é um método de fabricação recentemente desenvolvido que pode ser empregado para encapsular biológicos em micropartículas biodegradáveis. A micromoldagem é usada para gerar partículas que são preenchidas com uma carga útil líquida e aquecidas para permitir que o polímero reflua e encapsular totalmente o depósito central de carga dentro de uma camada contígua do polímero biodegradável. Essa microestrutura resulta na liberação pulsátil da carga útil, após um tempo dependente da taxa de degradação da casca polimérica¹². Este manuscrito demonstra o encapsulamento de RABV inativado dentro de micropartículas compostas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA), um polímero biodegradável usado em muitas formulações aprovadas pela FDA¹³, usando o método de fabricação PULSED para encapsular antígeno estável de RABV avaliado por um ensaio imunoenzimático (ELISA). Ao combinar partículas de PLGA com diferentes pesos moleculares e/ou grupos finais, esta abordagem tem o potencial de imitar o curso atual do tempo de vacinação antirrábica após uma única injeção.

Protocolo

1. Geração do molde mestre de partículas

NOTA: O processo de impressão 3D pode ser realizado com qualquer impressora 3D com resolução espacial suficiente; no entanto, o protocolo atual descreve o processo para uma impressora 3D de vários fótons.

1. Projetar estruturas de micropartículas usando um programa de projeto auxiliado por computador (CAD).
   NOTA: As especificações de projeto são as seguintes: 308 partículas (diâmetro = 400 μm, altura = 500 μm e espessura da parede = 100 μm) estão dispostas em uma matriz de 22 por 14, com 600 μm de espaçamento entre elas. O projeto também contém uma estrela de quatro pontas e uma estrela de cinco pontas como fiduciais imediatamente fora da matriz (Figura Suplementar 1).
2. Exporte o projeto final como um arquivo STL (Supplementary Coding File 1) e carregue o arquivo para um software capaz de definir os parâmetros de impressão, conforme mostrado abaixo. Em seguida, salve-o como um arquivo compatível com a impressora 3D (consulte Tabela de materiais).
   NOTA: Distância de corte = 5 μm, distância de eclosão = 1 μm, contorno da concha = 50 μm, contagem de fatias de base = 5 μm, andaime = oco, modo de varredura = galvo, eixo z = microscópio z-drive, velocidade de varredura = 100.000, potência = 100.
3. Pré-tratar um substrato de impressão de silício (ver Tabela de Materiais) usando um processo de limpeza a plasma (gás: O₂; potência: 200 watts; temperatura: 25 °C; fluxo: 20; tempo: 5 min), em seguida, imergir imediatamente o substrato em uma solução de 30 mL de etanol e 60 μl de metacrilato de 3-(trimetoxisilil) propila em uma placa de Petri de vidro. Cubra com papel alumínio e deixe incubar durante a noite.
   NOTA: Esta etapa aumenta a aderência de impressão ao substrato, o que é importante durante a separação do PDMS (etapa 2.6).
4. Carregue o arquivo de impressão na impressora 3D de vários fótons, aplique a resina de impressão no substrato tratado, carregue a lente de 10x (consulte Tabela de Materiais) e imprima as microestruturas.
5. Uma vez terminado, submerja a impressão em acetato de éter metílico de propilenoglicol (ver Tabela de Materiais) por 45 min para remover fotorresistência não exposta e, em seguida, submerja a impressão em álcool isopropílico por 5 min. Pós-cura do molde mestre expondo-o à luz UV a 254 nm por 120 min.
   NOTA: Se disponível, a luz UV na faixa de 405 a 365 nm pode ser usada por ~20 min para pós-cura das estruturas impressas.

2. Geração de bolor de polidimetilsiloxano (PDMS)

1. Trate a superfície do molde mestre impresso em 3D colocando-o numa câmara de vácuo contendo uma lâmina de vidro com 40 μL de silano Tricloro(1H,1H,2H,2H,-perfluorooctil) (ver Tabela de Materiais) adicionado à superfície. Puxe o vácuo (pressão relativa: -20 pol. Hg) por 1 h.
   NOTA: Esta etapa garante fácil separação ao desmoldar (etapa 2.6).
2. Enquanto a superfície do molde mestre está sendo tratada, misture completamente a base de pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) com o agente de cura de pré-polímero PDMS em uma proporção de 9:1 em massa (pelo menos 10 g de material é necessário para cada molde mestre). Uma vez completamente misturado, transferir o PDMS não curado para um tubo de centrífuga de 50 mL e centrífuga a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente.
3. Uma vez que o tratamento de superfície esteja completo, coloque o molde mestre em uma placa de folha de alumínio e despeje o PDMS não curado sobre o molde, garantindo que as características fiquem totalmente submersas. Coloque a placa de alumínio em uma câmara de vácuo e puxe o vácuo (pressão relativa: -20 pol. Hg) por 1 h para remover bolhas de ar.
4. Retire o prato de folha de alumínio da câmara de vácuo. Coloque espaçadores de 800 μm nas extremidades do molde mestre e sobreponha uma lâmina de vidro limpa sobre o molde mestre, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar. Utilize grampos aglutinantes para prender o molde e a lâmina juntos, localizando a força de fixação sobre os espaçadores (Figura 2 Suplementar).
5. Coloque a estrutura em um forno regulado a 120 °C por pelo menos 4 h para curar o pré-polímero em moldes de PDMS.
6. Remova a estrutura do forno, solte cuidadosamente os grampos aglutinantes e separe cuidadosamente o molde mestre do molde PDMS curado usando uma lâmina de barbear.
   NOTA: O molde mestre impresso em 3D pode ser reutilizado para gerar moldes PDMS adicionais.

3. Fabricação de filme PLGA

1. Pesar 450 mg de PLGA (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo sobre uma folha de polímero antiaderente de 76 mm por 76 mm dentro de um calço de anel de 250 μm de espessura, com um diâmetro interno de 50,8 mm. Coloque uma segunda folha de polímero antiaderente sobre o PLGA e comprima a pilha entre dois blocos de alumínio usando uma braçadeira em c de 101,6 mm até apertar o dedo.
   LEGENDA: PLGA 502H foi utilizado exclusivamente neste estudo; no entanto, outros tipos de PLGA são compatíveis com esse processo.
2. Coloque o conjunto c-clampeado em um forno a vácuo regulado para 120 °C por 30 min sob vácuo, com uma pressão relativa de -30 in.Hg. Em seguida, retire o conjunto e aperte firmemente a braçadeira antes de colocá-la novamente no forno a vácuo por mais 30 min.
   NOTA: O principal objetivo do uso de um vácuo é evitar a degradação do PLGA, que é acelerado em altas temperaturas.
3. Retire o conjunto do forno e deixe esfriar por 4 h em um dessecador.
4. Depois de esfriar, solte a braçadeira, retire o filme de PLGA das folhas de polímero antiaderente e coloque o filme em uma placa de Petri rotulada. Guarde a placa de Petri dentro de um exsicador para uso posterior.

4. Geração de partículas de PLGA

1. Trate a superfície do molde PDMS conforme descrito anteriormente na etapa 2.1.
2. Usando uma pinça e/ou um bisturi, corte e coloque uma porção do filme de PLGA de 250 μm, aproximadamente do tamanho da matriz, sobre o molde PDMS tratado.
3. Sobreponha uma lâmina de microscópio de vidro limpa sobre o filme de PLGA e o molde de PDMS e prenda os componentes colocando uma pinça de mola diretamente sobre o conjunto e o filme de PLGA.
4. Coloque o conjunto do molde fixado no forno a vácuo regulado para 120 °C e puxe o vácuo com uma pressão relativa de -30 pol. Hg por 1 h.
   NOTA: O tempo necessário para formar as partículas depende do PLGA, e pode variar de 1-12 h.
5. Retire o conjunto de molde preso do forno e deixe esfriar passivamente em temperatura ambiente por aproximadamente 15 min, ou até esfriar ao toque.
6. Usando uma lâmina de barbear, aplique suavemente pressão entre o molde PDMS e a matriz de partículas PLGA para separar os dois. Armazenar as partículas de PLGA em um exsicador para uso futuro.

5. Concentração e purificação do antígeno

1. Descongelar uma alíquota de antigénio RABV comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.
2. Monte a configuração de filtração colocando dois filtros de spin centrífugos com um corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO; ver Tabela de Materiais) em dois tubos de coleta.
3. Pré-molhar os dois filtros de spin centrífugos adicionando 500 μL de água UltraPure.
4. Gire os filtros a 2.400 x g por 1 min em uma centrífuga de bancada à temperatura ambiente.
5. Remova a água dos compartimentos superior e inferior da configuração de filtração usando uma pipeta de 200 μL.
   NOTA: Não deixe o filtro de rotação pré-molhado secar.
6. Adicionar 400 μL de água destilada ao compartimento superior de cada filtro de spin, em seguida, adicionar 100 μL do antigénio RABV descongelado e misturar com a pipeta.
   NOTA: Este estudo concentrou o antígeno aproximadamente cinco vezes e reduziu a concentração de excipientes <100 kDa em ~50 vezes.
7. Coloque os dois filtros de spin centrífugos em uma centrífuga de bancada, garantindo que os filtros fiquem voltados para o centro da centrífuga. Marque qual lado do filtro está voltado para o centro da centrífuga.
   NOTA: Se orientadas incorretamente, as soluções não serão devidamente filtradas/concentradas.
8. Centrifugar os filtros a 14.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.
9. Recupere os filtros da centrífuga. Os tubos de coleta conterão o filtrado, enquanto os filtros conterão a amostra concentrada (Figura 3A Suplementar).
10. Retire o filtrado dos tubos de coleta usando uma pipeta e descarte.
11. Adicionar 450 μL de água destilada filtrada a cada filtro e misturar a amostra concentrada e a água pipetando para cima e para baixo seis vezes.
12. Centrifugar os dois filtros de spin uma segunda vez a 14.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que os filtros estão virados para o centro da centrífuga na mesma orientação do passo 5.7.
13. Recupere as unidades filtrantes da centrífuga e, tal como antes, remova e elimine o filtrado de cada tubo utilizando uma pipeta.
14. Remova os filtros de spin dos tubos de coleta e tampe as carcaças de filtro usando a parte superior dos tubos de coleta (Figura 3B Suplementar).
15. Coloque a parte inferior das carcaças do filtro de rotação diretamente sobre um vórtice e vórtice a 3.000 rpm por 30 s, mantendo as caixas do filtro na vertical e em ângulos de 45° (Figura Suplementar 3C).
    NOTA: Esta etapa destina-se a ressuspender qualquer antígeno RABV que formou um pellet durante o processo de centrifugação.
16. Remova cuidadosamente a tampa dos tubos de coleta das caixas do filtro de spin. Coloque as caixas de filtro de volta nos tubos de coleta fornecidos e execute um giro rápido (2-3 s) para coletar qualquer volume que possa ter ficado preso na tampa.
    NOTA: Este giro rápido deve ser realizado em uma microcentrífuga de bancada. Os filtros devem ser tangenciais à centrífuga, ao contrário da configuração anterior, para garantir que nenhuma solução seja perdida através dos filtros.
17. Inverter cada unidade de filtro de spin em um novo tubo de coleta fornecido com o kit de filtro de spin (consulte Tabela de Materiais) e centrifugar por 2 min a 1.000 x g à temperatura ambiente para coletar as amostras concentradas.
18. Consolidar as amostras concentradas dos dois tubos de coleta em um tubo de coleta. Meça e registre o volume resultante.
    NOTA: A amostra resultante terá 5x a concentração inicial do antígeno como o estoque, terá uma pequena concentração de excipiente (<100 kDa) aproximadamente 50 vezes menor do que o estoque e aparecerá ligeiramente branca leitosa. O volume total deve ser de aproximadamente 44-48 μL.
19. Conservar o antigénio concentrado de 5x lavado duas vezes a 4 °C até ao momento da dispensação, mas não durante mais de 16 horas. Antes de encher as partículas com esta solução, centrifugar o tubo a 1.000 x g durante 1 min para remover quaisquer bolhas. A solução pode ser diluída com água destilada para atingir a concentração-alvo nominal para a dispensação.

6. Enchimento de partículas

1. Filtrar a vácuo 500 mL de água deionizada através de um filtro de vácuo de 0,22 μm e, em seguida, desgaseificar a solução aplicando um vácuo (pressão relativa: -20 pol. Hg) sob sonicação por 20 min.
2. Durante este tempo, anexe os capilares dispensadores piezo (PDCs; ver Tabela de Materiais) ao dispensador piezoelétrico.
3. Prima a máquina de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) e coloque a lâmina com as partículas de PLGA na área de dosagem.
4. Configure o "Find Target Reference Points", Run, e configure o "Target Substrate", de acordo com a Figura Suplementar 4.
5. Carregar 25 μL do antigénio concentrado na placa de origem e carregá-lo na máquina. Usando os PDCs, aspirar 10 μL de antígeno concentrado na ponta de dosagem, lavar a parte externa da ponta e, em seguida, calibrar o alinhamento de dispensação (Figura 5 Suplementar).
6. Digite "Target Setup parameters" e clique em Run (Figura 6 suplementar).
7. Depois de concluído, remova as partículas preenchidas e verifique se elas estão preenchidas sob um estereoscópio.
8. Passe diretamente para a próxima etapa do protocolo.

7. Vedação e colheita de partículas

1. Coloque um bloco de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais) em uma placa de aquecimento. Coloque duas lâminas de microscópio no bloco de aço inoxidável para que fiquem paralelas. Certifique-se de que o bloco de aço inoxidável esteja nivelado, ligue a placa de aquecimento e ajuste a temperatura para que a temperatura da superfície do aço inoxidável seja de 200 °C. Verifique a temperatura da placa de aquecimento antes da vedação.
2. Suspenda as partículas de PLGA preenchidas acima da placa de aquecimento, colocando-as nas duas lâminas de vidro e, em seguida, inicie imediatamente um temporizador por 18 s.
   NOTA: A quantidade de tempo e calor que as partículas precisam para selar irá variar dependendo das propriedades químicas do PLGA usado para fazer as partículas. Um suporte de slides personalizado impresso em 3D pode ser usado para manusear os slides a uma distância segura da placa de aquecimento. O arquivo STL é fornecido como arquivo de codificação suplementar 2.
3. Uma vez selada, remova a matriz de partículas da placa de aquecimento e suspenda-a sobre a bancada do laboratório, colocando a matriz de partículas em duas lâminas de vidro separadas. Deixe as partículas esfriar por 1 min.
4. Uma vez resfriadas, as partículas podem ser colhidas usando um bisturi enquanto olham através de um estereoscópio. Segure o bisturi com a lâmina em um ângulo de 45° em relação à lâmina e aplique pressão na base da partícula para separá-la da lâmina de vidro.
5. Uma vez colhido, use o bisturi para transferir as partículas para tubos de ligação de 0,5 mL de baixa proteína (ver Tabela de Materiais). Em seguida, encher os tubos com 250 μL de uma solução tampão fosfato (PBS) 1x contendo 30 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 1 mg/mL de glicose.
   NOTA: A BSA de 30 mg/mL e a solução de glicose de 1 mg/mL preparada em PBS manterão a estabilidade do antígeno RABV.
6. Esmague as partículas sob um estereoscópio usando um par de pinças de ponta fina. Certifique-se de que o antigénio RABV no núcleo da partícula está disponível para ser dissolvido na solução circundante. Conservar as amostras num frigorífico a 4 °C até que a potência do antigénio possa ser avaliada através de um ELISA. As amostras devem ser executadas em um ELSIA dentro de 7 dias após a preparação.

8. Avaliação do antígeno por ELISA

ATENÇÃO: Não deixe as microplacas secarem em nenhum momento. Sempre empilhar placas e sempre cobrir a placa superior com um selo plástico, uma placa vazia ou uma tampa para evitar o ressecamento.

1. Prepare os buffers conforme as instruções no Arquivo Suplementar 1.
2. Preparar 5 ml de solução de revestimento (tampão carbonato-bicarbonato, pH 9,6) a uma concentração de 2,5 μg/ml, adicionando 25 μL do anticorpo de revestimento a 4975 μL de tampão de revestimento a pH 9,4-9,6.
   NOTA: 5 mL são necessários para revestir 96 poços com 50 μL cada (com volume extra para perda de pipetagem). Aumentar o volume total em 5 mL para cada placa de ELISA adicional necessária.
3. Use uma pipeta multicanal para distribuir 50 μL da solução de revestimento em cada poço da microplaca. A solução deve ser utilizada para revestimento imediatamente após a sua preparação.
4. Bata suavemente ao longo das bordas da placa em uma palma enluvada para garantir que o fundo de cada poço esteja uniformemente coberto com líquido.
5. Sele a placa com película adesiva e coloque-a a 37 °C por 1 h, depois transfira para 4 °C durante a noite.
6. Retirar as placas do armazenamento refrigerado e lavá-las três vezes com 200 μL de tampão de lavagem em cada poço.
7. Retire o tampão de lavagem e distribua 300 μL de tampão de bloqueio em cada poço.
   CUIDADO: Ao executar várias placas com as mesmas amostras repetidas em placas diferentes, é importante proceder placa por placa (ou seja, encher a placa 1 com o material antes de prosseguir para a placa 2 e, em seguida, para a placa 3 e assim por diante). Não aplique o material X em todas as placas e depois o material Y, etc., pois isso aumentaria o risco de secagem dos poços. Após a etapa final de lavagem, o tampão de lavagem deve permanecer nos orifícios da placa e só ser descartado imediatamente antes de adicionar amostras à placa. Uma tampa de placa plástica de 96 poços precisa ser usada para cobrir todos os poços da placa ELISA que não estão sendo dispensados imediatamente, e a tampa sequencialmente movida para revelar poços adicionais a serem preenchidos com material.
8. Sele as placas com um filme plástico adesivo (ver Tabela de Materiais) e coloque-as em uma incubadora por 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
9. Preparar a curva padrão e as amostras de teste a serem avaliadas durante esta incubação.
   NOTA: O antigénio a avaliar deve ser pré-diluído em tampão diluente numa diluição recomendada de 0,125 UI/ml, com um volume excessivo de, pelo menos, 40 μL para explicar a perda de pipetagem. Todas as amostras são avaliadas em duplicata (duas réplicas técnicas) em cada placa de ELISA. Para a curva padrão, deve ser incluída nas colunas 2 e 3 de cada placa ELISA uma série de diluição dupla, num total de oito pontos. Pode ser efectuada uma série de diluição para todas as outras amostras com um número adequado de pontos com base na quantidade prevista de antigénio a avaliar. Embora menos rigorosa para maior rendimento, uma única diluição de amostra pode ser usada como uma alternativa ao revestimento descrito acima. No entanto, a concentração esperada de uma única diluição deve situar-se dentro do intervalo de curvas padrão.
10. Em placas de proteína de 96 poços de baixa ligação, ou tubos de proteína de baixa ligação (ver Tabela de Materiais), execute uma série de diluição dupla de cada amostra ao longo das colunas da placa.
11. Carregar o início da série de diluição na linha A para cada amostra respectiva ao dobro do volume final necessário (por placa, são necessários 100 μL de amostra por poço, de modo que todos os poços em A2-A11 devem conter pelo menos 240 μL de uma amostra, com um volume adicional de 40 μL para contabilizar a perda de pipetagem).
12. Carregar 120 μL de tampão diluente em todos os outros poços na placa proteica de baixa ligação, excluindo as colunas 1 e 12 (ou seja, B2 a H11).
13. Usando uma pipeta multicanal carregada com 10 pontas, execute a diluição em série transferindo 120 μL de amostra de A2-A11 para B2-B11 e pipetando para cima e para baixo várias vezes para misturar, evitando respingos e bolhas. Repita esse processo, descendo a placa ao longo dos pilares até os poços H2-H11. Descarte os 120 μL restantes de volume aspirado da última fileira de poços.
    NOTA: As amostras estão agora prontas para análise. Se a fase de bloqueio não estiver concluída até este momento, certifique-se de que as amostras sejam mantidas no gelo.
14. Ao final da etapa de incubação, lavar as placas três vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
15. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 μL de tampão diluente para as colunas 1 e 12 como os "espaços em branco".
16. Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 μL de cada poço da placa de proteína de 96 poços de baixa ligação contendo diluições de amostra para a placa ELISA lavada. Repita para todas as placas ELISA que estão sendo executadas.
17. Sele as placas com um filme plástico adesivo e coloque-as em uma incubadora por 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
18. Preparar a solução de anticorpos de detecção (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 0,2 μg/mL adicionando 4,4 μL da solução de anticorpos a 10.995,6 μL do tampão diluente e misturar bem pipetando para cima e para baixo.
    NOTA: Um total de 11 mL é necessário para 96 poços a 100 μL cada (com volume extra para perdas por pipetagem). Aumentar o volume total em 11 mL para cada placa adicional de ELISA avaliada. A solução deve ser utilizada imediatamente após a preparação.
19. Ao final da etapa de incubação, lavar as placas cinco vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
20. Aspirar o tampão de lavagem restante e distribuir 100 μL da solução de anticorpos de detecção em cada poço na microplaca usando uma pipeta multicanal.
21. Sele as placas com um filme plástico adesivo e coloque-as em uma incubadora por 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
22. Preparar o conjugado no final da etapa de incubação do anticorpo de detecção adicionando 4,4 μL de solução conjugada de estreptavidina-peroxidase (ver Tabela de Materiais) a 10.995,6 μL de tampão de lavagem.
    NOTA: Um total de 11 mL é necessário para 96 poços a 100 μL cada (com volume extra para pipetagem multicanal). Aumentar o volume total em 11 mL para cada placa adicional de ELISA avaliada.
23. Lavar as placas cinco vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
24. Aspirar o tampão de lavagem restante e distribuir 100 μL da solução conjugada em cada poço.
25. Selar as placas com um filme plástico adesivo e colocá-las em uma incubadora de 37 °C por 60 ± 5 min a 37 ± 2 °C.
26. Preparar o substrato durante a etapa final de lavagem de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para cada placa, dissolver um comprimido de dicloridrato de o-fenilenodiamina (OPD; ver Tabela de Materiais) em 9 mL de água deionizada no escuro e, em seguida, completar com 1 mL de tampão de peróxido estável de 10x. Ajustar o número de comprimidos e o volume total da solução (10 mL) de acordo com o número de placas a serem avaliadas.
27. Lavar as placas cinco vezes com 200 μL de tampão de lavagem.
28. Distribuir 100 μL do substrato em cada poço usando uma pipeta multicanal.
29. Sele as placas com um filme plástico adesivo e deixe-as na bancada por 10-20 min, protegidas da luz, usando papel alumínio.
    NOTA: Monitore visualmente o desenvolvimento de cores para evitar a saturação.
30. Adicionar 50 μL de solução de paragem a cada poço e à placa de leitura imediatamente para a absorbância a 492 nm e uma absorbância de referência de 620 nm.
31. Analisar os dados utilizando a leitura de absorbância corrigida (leitura a 492 nm menos a leitura a 620 nm) e subtrair a média do branco de todas as amostras. Use um método de interpolação sigmoidal 4PL para converter valores de absorbância em UI/mL. Finalmente, multiplique pelos 250 μL (volume total da amostra) para converter em UI.
    NOTA: Esta análise pode ser feita usando um software de análise de dados.

Resultados

A vedação e o enchimento de partículas são duas das etapas mais críticas deste protocolo. As partículas foram preenchidas com sal fluoresceína sódico para demonstrar enchimento ideal e alguns erros comuns. O sal fluoresceína sódico foi usado no lugar do antígeno RABV para facilitar a visualização. Durante o enchimento, é importante dispensar a solução no fundo dos núcleos de partículas e, em seguida, permitir tempo suficiente para que o solvente/água evapore. Uma vez concluído, um depósito do soluto permanece no fundo do núcleo de partículas (Figura 1A). Uma vez preenchido, é fundamental selar as partículas corretamente. A Figura 1B demonstra vários resultados (bem-sucedidos e malsucedidos) do processo de selagem. Após 12 s de tempo de selagem, um caminho distinto permanece do centro da partícula para o exterior da partícula, demonstrando uma partícula que não está totalmente selada. Por outro lado, se deixado para selar por 36 s, o PLGA derrete quase totalmente, resultando em uma microestrutura com um perfil raso. A morfologia ideal pode ser visualizada quando as partículas são seladas por 18 e 24 s, pois contêm carga totalmente encapsulada pelo polímero, mantendo uma estrutura de partículas. A Figura 1C demonstra vários resultados potenciais após o enchimento e selagem. Durante a dispensação, se o solvente não atingir o fundo da partícula, ele deixa o soluto seco no meio do núcleo da partícula (preenchido incorretamente); Embora essas partículas ainda possam selar, o mau carregamento da carga pode limitar a eficiência do carregamento. Se as partículas forem preenchidas com muita carga (sobrecarregadas), o processo de vedação é inibido, pois a carga impede que o PLGA flua sobre a abertura. Quando corretamente preenchidas e seladas, as partículas dessa geometria são pequenas o suficiente para caber facilmente dentro de uma agulha de 19 G. Além disso, 10 partículas fluíram consistentemente através de uma agulha de 19 G (100% ± 0%) quando injetadas com uma solução viscosa, como carboximetilcelulose a 2% (Figura 7 suplementar).

Figura 1: Problemas comuns com o processo de enchimento e vedação . (A) As imagens mostram a evaporação do solvente após um ciclo de enchimento, onde as partículas são carregadas com 6 nL de 100 mg/mL de sal de sódio fluoresceína dissolvido em água. (B) Imagens representativas de partículas de PLGA 502H removidas do processo de vedação a 0, 12, 18, 24 e 36 s. (C) Resultados diferentes do processo de vedação quando as partículas são preenchidas corretamente, incorretamente ou com excesso de preenchimento. As imagens são geradas pelo empilhamento de foco de várias imagens e mesclando-as usando o software de empilhamento de foco. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processar o antígeno através de um filtro de spin antes de carregá-lo nas partículas é importante por duas razões. Primeiro, a centrifugação serve para remover excipientes de estoque na solução vacinal, que podem limitar a capacidade de carga de partículas, mantendo o antígeno RABV. O protocolo atual purifica o antígeno em aproximadamente 50 vezes. Em segundo lugar, o antígeno também é concentrado durante esse processo. A Figura 2A mostra uma micrografia dos virions RABV intactos na amostra concentrada de antígeno. Esse antígeno é aproximadamente 4,4 vezes mais concentrado que a solução-estoque inicial (Figura 2B). A quantidade de antígeno inicialmente carregada nos filtros de spin centrífugos pode ser alterada para modular a concentração final da dobra alcançada. Por exemplo, carregar 40 μL de antígeno estoque resulta em uma concentração aproximada de 1,75 vezes. A Figura 8 suplementar demonstra a importância do vórtice (etapa 5.15) no processo de concentração. Negligenciar o vórtice ou o vórtice inadequado das amostras limita o processo de concentração.

Figura 2: Concentração do antígeno. A concentração do antígeno por filtração centrífuga mostrada por microscopia eletrônica de transmissão (A) e confirmada por ELISA (B). As barras de erro indicam o desvio padrão. A análise estatística é feita por meio do teste de comparações múltiplas de Tukey com ANOVA one-way. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3A mostra o antígeno concentrado preenchido em partículas não seladas e seladas. Embora uma quantidade significativa de antígeno seja carregada nas partículas (0,0469 ± 0,0086 UI), este material compreende <90% da capacidade das partículas, deixando amplo espaço para o carregamento de antígeno adicional. Curiosamente, as partículas não seladas contêm apenas 0,0396 ± 0,0077 UI, compreendendo apenas 85% ± 16% da quantidade total carregada. Embora uma perda estatisticamente insignificante, parte do antígeno RABV pode ter se desnaturado durante repetidas reidratações e secagem no processo de enchimento. Após o selamento, 69% ± 5% do antígeno permanecem encapsulados na forma bioativa. Embora isso sugira que ocorra perda significativa durante o processo de selamento devido ao estresse térmico, a maior parte do antígeno viral inativado permanece intacta (Figura 3B). A coencapsulação de excipientes estabilizadores juntamente com o antígeno é uma estratégia possível para aumentar ainda mais a estabilidade do antígeno durante todo o processo de fabricação, e já foi bem sucedida com outros antígenos do vírus inativado^14,15.

Figura 3: Antígeno RABV bioativo após fabricação de partículas . (A) As imagens mostram partículas não seladas e seladas contendo o antígeno RABV. (B) Estabilidade do antígeno através do processo de fabricação de partículas (n = 4). O controle de carga é gerado pela dispensação do antígeno diretamente na solução. As barras de erro indicam o desvio padrão. Barra de escala = 200 μm. A análise estatística é feita por meio do teste de comparações múltiplas de Tukey com ANOVA one-way. *p < 0,05. As imagens são geradas pelo empilhamento de foco de várias imagens e mesclando-as usando o software de empilhamento de foco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Dimensões de partículas, fiduciárias e matrizes. A figura mostra as propriedades geométricas da estrela fiducial de quatro pontas (A), da micropartícula cilíndrica (B), da estrela fiducial de cinco pontas (C) e de uma matriz de partículas com fiduciais (D) exibidas no software CAD. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Esta figura mostra uma seção transversal da estrutura colocada no forno para curar os moldes de PDMS. As setas indicam onde as braçadeiras de aglutinante são aplicadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Técnica adequada para recuperar eficientemente o antígeno concentrado. No final do primeiro spin, a amostra concentrada circulada em vermelho (A) é retida no filtro, enquanto o filtrado é coletado no fundo do tubo de coleta (tubo externo maior). Para ressuspender o antígeno peletizado, a unidade de filtro centrífugo é tampada usando o tubo de coleta (B) em preparação para vórtice. Durante o vórtice, a ponta do tubo é mantida em contato com a almofada de vórtice e a extremidade da tampa girada ao redor, mantendo um ângulo de 45° com a almofada de vórtice (C). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Dispensador piezoelétrico de programação pré-execução. (A) Configure a opção "Localizar pontos de referência de destino" navegando da "guia Principal" para a função Configuração do robô > Diversos >Div. > Localizar pontos de referência de destino. Use os botões destacados em azul para definir as marcas fiduciárias. Primeiro, selecione Aprender modelo e desenhe uma caixa ao redor da marca fiduciária de interesse, verifique a precisão do modelo clicando em Modelo de pesquisa e salve o modelo. Faça isso para as estrelas de quatro e cinco pontas e salve os nomes de arquivo de acordo com as instruções em Usar duas imagens de modelo diferentes. Em seguida, verifique se todos os parâmetros nas caixas pretas correspondem. Carregue a estrela fiducial de quatro pontas usando o Modelo de Carregamento (caixa verde). Salve o programa "Localizar pontos de referência de destino" selecionando Lista de tarefas (caixa laranja). (B) Configure a opção Executar navegando até a guia Configuração do robô > Tarefas e, em seguida, carregue a sequência de tarefas mostrada na caixa azul adicionando tarefas da Lista de Tarefas (caixa preta) usando a opção Tarefa em Executar seleções (caixa verde). Por fim, salve a tarefa (caixa laranja). (C) Configure o "Substrato de Destino" navegando até a Configuração do Robô > Substrato de Destino e, em seguida, adicione um alvo (caixa azul). (D) Insira os parâmetros mostrados aqui e selecione Salvar (caixa azul). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 5: Antígeno de carga e alinhamento de desvio de calibração. (A) Navegue até a guia Configuração do bocal > Do Task e aspirar 10 μL do antígeno na ponta de distribuição selecionando TakeProbe10 uL (caixa preta) e clicando em DO (caixa preta). (B) Isso abre uma janela separada. Selecione o poço em que o antígeno concentrado foi carregado e selecione OK (caixa azul). (C) Após a aspiração do antígeno, lavar a ponteira selecionando a caixa azul e repetir essa lavagem mais duas vezes. Selecione a câmera (caixa preta) e determine o volume de queda selecionando o volume de descarte (caixa verde). Certifique-se de que uma queda estável está se formando com um desvio padrão de volume (%) <2 (caixa laranja). (D) Seguindo estes passos irá abrir a Snap Drop Cam; selecione Imagem (caixa azul) no menu suspenso e selecione Nozzle Head Camera Wizard. Isso abre uma nova janela. Execute a próxima sequência de etapas rapidamente. (E) Certifique-se de que o destino feito na Figura 4 Suplementar esteja carregado e selecione Mover para o destino (caixa azul). Ajuste as gotas para 15 e selecione Spot (caixa preta). Uma vez detectado, selecione imediatamente Mover (caixa verde). Certifique-se de que a opção Localizar automaticamente está selecionada e exclua o tamanho da partícula = 12 e clique em Iniciar (caixas laranjas). Se a detecção automática falhar, repita esse processo depois de mover para uma área diferente no slide (caixa roxa). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Programando a matriz de detecção e iniciando a execução. (A) Navegue até a Configuração de Destino > Destino e preencha os parâmetros mostrados na caixa azul. (B) Em seguida, navegue até a aba "Configuração de campo" e digite 20 no não. do campo de gotas (caixa azul), selecione um poço (caixa preta) e, em seguida, selecione alvos/partículas para distribuir (caixa verde). Ao selecionar um poço diferente e reselecionar os alvos/partículas, ciclos de enchimento adicionais são realizados durante uma única execução. (C) Na tela principal, verifique se a execução e o destino criados na Figura Suplementar 5 estão selecionados. (D) Navegue até a guia "Executar" e selecione Iniciar execução (caixa azul). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 7: Injetabilidade de micropartículas. (A-C) Imagens de estereoscópio empilhadas com foco de micropartículas preenchidas com sal de fluoresceína sódica e seladas em uma agulha de 19 G. (D) Um total de 10 partículas foi injetado através de uma agulha 19 G usando uma solução de carboximetilcelulose a 2% (n = 8). Barra de escala = 1 mm. As barras de erro indicam o desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 8: Problemas potenciais com a concentração de antígenos. A linha vermelha indica o aumento esperado da dobra na concentração. As barras de erro indicam o desvio padrão. A análise estatística foi realizada por meio do teste de comparações múltiplas de Tukey com ANOVA one-way. p < 0,001, ****p < 0,0001. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: Preparação de buffers e soluções para RABV ELISA. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo STL contendo matriz de partículas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: arquivo STL contendo geometria para o suporte de slide personalizado usado para vedação de partículas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

É possível alterar a geometria das partículas para necessidades específicas; No entanto, para estruturas cilíndricas, os autores recomendam manter uma relação de 5:4:1 da espessura altura:diâmetro:parede descrita no protocolo. Essa proporção garante que material PLGA suficiente esteja presente para selar as partículas e permanecer mecanicamente robusto o suficiente para o manuseio. As dimensões e formas das partículas podem ser facilmente alteradas durante o processo CAD, permitindo que uma infinidade de geometrias seja gerada. A combinação da flexibilidade do CAD com a impressão 3D permite a rápida iteração de projetos de micropartículas. Embora este protocolo utilize uma impressora 3D multifóton, qualquer impressora 3D com especificações capazes de imprimir as dimensões da microestrutura em um material apropriado pode ser usada para gerar o molde mestre inicial. Além disso, a fotolitografia já foi usada para fazer estruturas semelhantes em matrizes muito maiores do que as produzidas neste protocolo; no entanto, a mão de obra, a demora na solicitação de fotomáscaras sob medida e a acessibilidade dos equipamentos retardariam o processo iterativo de design¹⁶. Finalmente, a geração de moldes mestres pode ser terceirizada para empresas pagas por serviços se a fabricação interna de moldes mestres não for viável. Independentemente da impressora 3D ou do método utilizado para gerar os moldes mestres, a adesão da impressão ao substrato é fundamental para as etapas a jusante. Especificamente, se a adesão for inadequada durante a geração do molde PDMS, as partículas impressas permanecerão alojadas no molde PDMS, exigindo a remoção manual das partículas impressas e a destruição do molde mestre.

O enchimento de partículas é outro aspecto crítico a ser considerado. As micropartículas têm capacidades de enchimento limitadas, de modo que a filtração é usada não apenas para concentrar o antígeno RABV, mas também para remover excipientes de estoque que, de outra forma, ocupariam uma grande parte do volume do núcleo de micropartículas. No entanto, dado o grande tamanho do antígeno RABV (aproximadamente 60 nm por 180 nm)¹⁷, é possível peletizar parcialmente o antígeno durante as etapas de centrifugação. Por esta razão, é importante ressuspender o antígeno por pipetagem ou vórtice após a centrifugação para obter uma alta recuperação do antígeno RABV. Uma solução altamente concentrada é ideal para dispensação, porque reduz os ciclos de dispensação e, assim, limita a degradação do antígeno durante o enchimento. No entanto, a viscosidade é uma limitação importante dos robôs de dosagem piezoelétricos que formam uma gota estável, de modo que a dispensação de uma solução de concentração muito alta pode não ser possível ou aconselhável. Diluir a solução de enchimento é a maneira mais fácil de alcançar uma formação de gota estável, mas a estabilidade do antígeno ao longo dos ciclos de enchimento adicionais necessários para atingir a carga desejada e a maior quantidade de tempo necessária para encher partículas deve ser considerada.

Limitações
Este método requer equipamentos altamente especializados para produzir os moldes iniciais e um instrumento de enchimento especializado para a produção de micropartículas. Embora a necessidade de uma impressora 3D com uma resolução de impressão capaz de gerar os moldes mestres iniciais possa ser subvertida por uma abordagem de pagamento por serviço, a acessibilidade a um robô dispensador piezoelétrico é limitante. A aquisição de um robô de distribuição piezoelétrico requer um investimento inicial significativo, muitas vezes na faixa de US$ 80.000 a US$ 200.000, dependendo da marca, do rendimento e das capacidades. Embora vários outros métodos de preenchimento sejam alternativas potenciais, esses métodos não foram validados usando o antígeno RABV¹².

Aplicações futuras
Uma proporção substancial do antígeno RABV encapsulado permaneceu estável durante o processo de selagem. Teoricamente, ao incorporar esse antígeno em partículas compostas por diferentes tipos de PLGA que mimetizam o cronograma de administração do tratamento profilático pós-exposição, todas as doses poderiam ser administradas em uma única injeção. A eliminação da necessidade de visitas repetidas ao hospital para administrar doses adicionais aumentará a adesão do paciente, resultando em melhores resultados do tratamento. Além disso, tendo demonstrado a capacidade de reter a reatividade ELISA do vírus inativado da raiva altamente complexo, é provável que outros antígenos, incluindo vacinas de subunidades, sejam compatíveis com esse método de encapsulamento. O uso de outros antígenos profiláticos com micropartículas PULSED poderia salvar milhões de vidas em PBMRs, aumentando as taxas de vacinação de populações subvacinadas. Para isso, no entanto, as vacinas devem permanecer estáveis não apenas por meio de encapsulamento, mas também de liberação, o que pode ser desafiador, uma vez que a carga útil será submetida a temperaturas elevadas e a um microambiente potencialmente ácido devido ao calor corporal e aos produtos de degradação do PLGA¹⁸. O trabalho futuro buscará estratégias de estabilização do antígeno por meio da liberação, o que abriria o potencial para uma plataforma de vacinação de injeção única que é amplamente aplicável para prevenir muitas doenças infecciosas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 µ m Filtro PES	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
Calços de 0,25 mm	McMaster Carr	98090A935
Grampos de Fichário de 0,75 polegada	480114
Seringa de 10 mL	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL  Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa Stripe	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	A alça preta acabará caindo. Use um alicate para ajustar quando isso acontecer.
Agulha de 19 G	EXCELINT	26438
25 mL  Pipetas Sorológicas Descartáveis de Poliestireno Estéril com Listra de Lupa	Fisherbrand	13-678-11
3-(Trimetoxissilil) Metacrilato de Propila	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 mL  Pipetas Sorológicas Descartáveis de Poliestireno Estéril com Faixa de Lupa	Eppendorf	22431081
Tubos de Centrífuga de 50 mL	Corning
50 mL  Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa Stripe	Fisherbrand	13-678-11F
Acetona	Fisher	AC268310010
Bloco de Alumínio	McMaster Carr	9057K175
Folha de Alumínio	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Filtros Centrífugos, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anticorpo Anti-Vírus Anti-Rábico, Anticorpo Livre de Soro, clone 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
, Clone D1-25, biotinilado	Fisherbrand	14-388-100
Carboximetilcelulose	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, Filtro, Racked	Fisherbrand	13-678-11
Tubo de Microcentrífuga Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap	Corning	3206
Costar 1.7 mL Tubo de Microcentrífuga de Baixa Ligação com Tampa de Pressão	Corning	3207
Descrever	Nanoscribe		O software usado para definir os parâmetros de impressão para a impressora 3D Nanoscribe é a etapa 1.2. Software fornecido com a impressora.
Dessecador	Fisher Scientific	10529901	Ou
grampos	de fita dupla face	649280
DPBS (10x), Sem Cálcio, Sem Magnésio	Gibco	14200075
Etanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Pipetas Multicanal, 30 a 300 µ L	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Pontas de Pipeta de Barreira Aerossol, 0.1 – 10 µ L	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Pontas de Pipeta de Barreira Aerossol, 100 – 1000 µ L	Fisherbrand	03-448-17
Pontas de Pipeta de Barreira Aerossol Fisherbrand SureOne, 2 – 20 µ L	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Pontas de Pipeta de Barreira Aerossol, 20 – 200 µ L	Fisherbrand	13-374-10
Marca Fisher  Kit de Pipetas Elite	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand  Controlador de pipeta	Fisherbrand	FB14955202
Placa de Petri de Vidro, 90 mm	VWR	470313-346
Corrediças	de Vidro Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software usado para focar imagens de pilha
IP-Q Resina	Nanoscribe		A resina da impressora é compatível com a lente 10x e é usada para imprimir grandes microestruturas no Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Termopar	Amazon	5053485896236	Ou equivalente
Microscópio Slide Box	Millipore Sigma	Z374385-1EA	Ou equivalente
Nanoscribe Photonic Professional GT2 com 10X Objective	Nanoscribe
NanoWrite	Nanoscribe		Software utilizado para interface com impressora 3D nanoscive. Software fornecido com a impressora.
Placa de Fundo Plano Nunc MaxiSorp de 96 poços	Invitrogen	44-2404-21
OPD Substrate Tablets (dicloridrato de o-fenilenodiamina)	Fisherbrand	02-707-432
, 4 pol.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 com Revestimento Tipo 3	Scienion	P-2020
PDMS Moldes de Partículas	Rice University	n/a	N/A- As partículas são 400 μ m de diâmetro com uma espessura de parede de 100 μ m, e uma altura de 500 μ m, resultando em um diâmetro interno de 200 μm. As matrizes são 14 x 22 partículas espaçadas de 600 μ m separados um do outro. Estrelas de 4 e 5 pontas são usadas como fiduciais, posicionadas a 600 μ m à direita e à esquerda das partículas superiores direitas e superiores esquerdas na matriz.
Placa de Petri Fisher	Scientific	08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Copos de Plástico	Fisher Scientific	S04170
PLGA Film, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Propileno Glicol Monometil Éter Acetato	Millipore	Sigma 484431
A Rabies Antigen	Chiron Behring e a Bharat Biotech International		Material foram adquiridas por meio de um contrato de transferência de materiais com a empresa.
Lâminas de barbear	VWR	55411-050
Bisturi	VWR	21899-530 e 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 com PCD 60	Scienion		ou fita de
vedação equivalente para placas de 96 poços	Thermo Scientific	15036
Bolacha de silício	Universidade Wafer	1025
Grampos de mola	IRWIN
Aço Inoxidável	McMaster Carr	9083K12
Streptavidin− Polímero Peroxidase, Ultrassensível	Fisherbrand	02-707-404
2646340		Sylgard 184
	DOW McMaster Carr	9266K12	Usado para fazer filmes PLGA. Deve ser cortado em pedaços de tamanho apropriado.
Folha de Teflon, 0.8 mm-thick	Pinça McMaster Carr	9266K81
Tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctil) Silano	Sigma	448931-10G
	Pixnor	ESD-16
Água Destilada UltraPura	Fisher Scientific	10977015
Forno UV, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	Ou equivalente
Dessecador a Vácuo	Bel-Art	F420100000	Note que você precisará de dois desses. Um será usado exclusivamente para pré-tratar amostras com tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano para evitar contaminação.
Forno a vácuo capaz de atingir 120 & C	VWR	97027-664	Ou vácuo equivalente
, CRVpro4	Welch	3041-01	Ou equivalente
para Abaixadores	Língua Microscopia Eletrônica Ciências	72320