Aqui, descrevemos um aprimoramento do método semi-in vitro (SIV) para observação da orientação e recepção do tubo polínico em Arabidopsis thaliana, que aumenta a receptividade dos óvulos. O método SIV cum septum de alto rendimento pode ser acoplado a linhagens de marcadores gametófitos e biossensores codificados geneticamente para monitorar o processo dinâmico de fertilização.
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Artigo de método
Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum
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Resumo
Resumo
Em plantas com flores, o crescimento e a orientação do tubo polínico (gametófito masculino) dentro do pistilo e a recepção do tubo polínico pelo gametófito feminino são essenciais para a dupla fertilização e posterior desenvolvimento das sementes. As interações entre gametófitos masculinos e femininos durante a recepção do tubo polínico culminam na ruptura do tubo polínico e na liberação de dois espermatozoides para efetuar a dupla fecundação. Como o crescimento do tubo polínico e a dupla fertilização estão profundamente ocultos nos tecidos da flor, esse processo é difícil de observar in vivo.
Um método semi-in vitro (SIV) para obtenção de imagens em células vivas da fertilização na planta-modelo Arabidopsis thaliana tem sido desenvolvido e implementado em diversas investigações. Esses estudos têm ajudado a elucidar as características fundamentais de como ocorre o processo de fertilização em plantas com flores e quais mudanças celulares e moleculares ocorrem durante a interação dos gametófitos masculino e feminino. No entanto, como esses experimentos de imagem de células vivas envolvem a excisão de óvulos individuais, eles são limitados a um baixo número de observações por sessão de imagem, tornando essa abordagem tediosa e muito demorada. Entre outras dificuldades técnicas, é frequentemente relatada a falha dos tubos polínicos em fertilizar os óvulos in vitro , o que confunde severamente tais análises.
Aqui, um protocolo de vídeo detalhado para a obtenção de imagens da recepção e fertilização do tubo polínico de forma automatizada e de alto rendimento é fornecido, permitindo até 40 observações de recepção e ruptura do tubo polínico por sessão de imagem. Aliado ao uso de biossensores e linhagens de marcadores codificados geneticamente, esse método possibilita a geração de grandes tamanhos amostrais com reduzido investimento de tempo. Nuances e pontos críticos da técnica, incluindo estadiamento floral, dissecção, preparação do meio e imagem, são claramente detalhados em formato de vídeo para facilitar futuras pesquisas sobre a dinâmica de orientação, recepção e fertilização dupla do tubo polínico.
Introdução
A geração de descendentes geneticamente únicos em organismos sexualmente reprodutores depende da fusão bem sucedida de gametas masculinos e femininos. Em plantas com flores, a interação de dois gametas masculinos (espermatozoides) com dois gametas femininos (óvulo e célula central) durante a dupla fecundação depende da liberação de espermatozoides do tubo polínico (o gametófito masculino). Esse processo, denominado recepção do tubo polínico, é amplamente controlado pelas células sinérgicas que residem no saco embrionário (o gametófito feminino)1,2. Como a recepção do tubo polínico ocorre profundamente no interior da flor, um método que permite a obtenção de imagens em células vivas do processo, denominado recepção do tubo polínico semi-in vitro (SIV), foi estabelecido3. Com esse método, óvulos de Arabidopsis excisados são colocados em meio de germinação de pólen semilíquido e alvo de tubos polínicos que crescem através do estigma e estilo de um pistilo cortado na junção do trato transmissordo estilo 3,4. Desde o desenvolvimento desta técnica, observações detalhadas levaram a várias descobertas em torno da orientação, recepção e fertilização do tubo polínico. Entre outras, essas descobertas incluem a aquisição de competências de direcionamento do tubo polínico pelo crescimento através do estigma3, o aparecimento de oscilações intracelulares de cálcio nos sinergídeos com a chegada do tubo polínico 5,6,7,8,9 e a dinâmica de liberação e fertilização dos espermatozoides após a ruptura do tubo polínico10 . No entanto, como essa técnica depende da excisão dos óvulos, as observações de fertilização são limitadas em número, e a recepção do tubo polínico é frequentemente aberrante, resultando na falha da ruptura do tubo polínico (Vídeo 1 e Arquivo Suplementar 1). Portanto, há necessidade de uma abordagem mais eficiente que permita análises de alto rendimento da recepção e fertilização do tubo polínico.
No desenvolvimento desse protocolo, várias novas abordagens para analisar a recepção do tubo polínico, desde os métodos mais "in vitro" até os mais "in vivo", foram testadas, e uma técnica eficiente baseada na excisão de todo o septo foi estabelecida, o que permite até 40 observações de fertilização por dia. Aqui, as nuances e os pontos críticos da técnica são delineados, incluindo estadiamento floral, dissecção, preparação do meio e configurações de imagem. Seguindo esse protocolo, pesquisas com foco na orientação do tubo polínico, recepção do tubo polínico e dupla fertilização devem ser facilitadas. Espera-se que os tamanhos de amostra mais altos que o método permite reforcem a solidez científica das conclusões tiradas de experimentos de imagens ao vivo. As aplicações potenciais desta técnica incluem, mas não estão limitadas a, realizar observações das mudanças moleculares e fisiológicas nas concentrações citosólicas de cálcio ([Ca2+]cyt), pH ou H2 O2 durante interações gametófitas através do uso de biossensores codificados geneticamente. Além disso, alterações citológicas, como degeneração do sinérgico receptivo, migração de células espermáticas ou cariogamia, podem ser mais facilmente observadas usando este método melhorado. Finalmente, o tempo dos diferentes estágios de fertilização pode ser monitorado sob microscopia de campo largo e, em seguida, análises mais detalhadas usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) ou microscopia de excitação de dois fótons (2PEM) podem ser conduzidas para maior resolução e reconstrução 3D.
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista dos materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.
1. Considerações para o desenho do experimento de imagem
- Predetermine a duração da imagem e a frequência de amostragem necessárias para capturar o fenômeno desejado a ser observado. Por exemplo, seguindo o teorema de amostragem de Nyquist, a frequência de amostragem deve ser maior que o dobro da frequência mais alta da amostra de entrada. Portanto, para capturar com precisão as oscilações sinérgicas de [Ca2+]cyt , realizar imagens aproximadamente a cada 10 s, mas para medir a velocidade dos espermatozoides na descarga do tubo polínico, garantir uma resolução temporal inferior a 1 s10.
- Selecione marcadores fluorescentes para as células de interesse que são suficientemente brilhantes além da autofluorescência de fundo. Para o uso de biossensores, selecione as linhas mais brilhantes que não perturbam a função celular, pois geralmente são mais sensíveis e exigem menos tempo de exposição.
- Considere qual tipo de microscopia de fluorescência e ampliação são mais adequadas para capturar o fenômeno desejado. Use microscopia de campo largo e objetivas de baixa ampliação para capturar a luz de uma maior profundidade de campo e manter o foco ao longo do tempo, criar imagens de objetos maiores, como óvulos inteiros, ou usar sensores ratiométricos sensíveis a artefatos de deslocamento cromático. Use CLSM ou 2PEM com objetivas de alta ampliação para melhor resolução de objetos celulares e subcelulares, mas observe a dificuldade em manter o foco ao longo do tempo.
- Estimar o número de amostras a serem fotografadas por experimento. Por exemplo, use uma objetiva de 10x com um tempo mínimo de amostragem de ~30 s para obter imagens de três septos e obter imagens de até 40 eventos de fertilização por experimento devido ao tempo necessário para as funções de autofoco e aquisição de vários estágios.
2. Preparo do meio de germinação de pólen
- Preparar meio líquido de germinação de pólen (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0,01% [p/v] H 3 BO3e 10% [p/v] sacarose) usando 1 M alíquotas de cada micronutriente, que são armazenadas a −20 °C. Ajuste o pH para 7,5 com KOH 0,1 M. Conservar o meio a 4 °C durante 2 semanas.
NOTA: O pH pode cair com o tempo. - Adicione 2,5 mL de meio líquido a um copo de 10 mL e adicione lentamente 32 mg de agarose de ponto de fusão ultrabaixo (~1,3%) com uma barra de agitação de rotação rápida para evitar aglomeração.
- Derreta a agarose numa placa de aquecimento a 65 °C e nutre o copo para recolher qualquer condensação dos lados.
- Pipetar 130 μL de meio para o poço de 14 mm de uma placa de fundo de vidro de 35 mm e girar a placa até que o meio cubra o poço.
- Aspirar um total de 40 μL com uma pipeta do centro da placa, deixando para trás um volume total de 90 μL.
NOTA: Mais meio pode ser aspirado para fora do poço para alcançar um volume total menor; Isso pode ser necessário para objetivos de alta ampliação com baixas distâncias de trabalho. No entanto, quanto mais fina for a almofada de ágar, mais rápido ela secará. - Resfrie o prato em um bloco de alumínio em uma câmara de umidade para garantir um resfriamento uniforme. Guarde os pratos a 4 °C durante a noite para usar na manhã seguinte.
3. Estadiamento floral de doadores septais, estigmatizantes e doadores de pólen
Figura 1: Estadiamento floral de doadores de septo, doadores estigma e doadores de pólen. (A) Estágios das flores de Arabidopsis (Ler-0) dentro de uma inflorescência. Os botões no estágio 12B, que têm pétalas prestes a se abrir e anteras indeiscentes amarelas, devem ser emasculados removendo todas as sépalas, pétalas e estames. Os pistilos (que abrigam a fêmea fabricante de gametófitos) são então utilizáveis como doadores de septo 24 h mais tarde. (B) Estágios das flores de Arabidopsis (Col-0) dentro de uma inflorescência. Os botões no estágio 12B, que têm anteras amarelas indeiscentes e estigmas que mal estão emergindo das pétalas, devem ser emasculados removendo todas as sépalas, pétalas e estames. Os pistilos são então utilizáveis como doadores de estigma 24 h mais tarde, quando deveriam ser polinizados por flores (que abrigam o marcador gametófito masculino) abertas e soltando pólen. Os estigmas polinizados devem ser dissecados dentro de 1 h após a polinização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Na manhã anterior à aquisição de imagens, escolher plantas de Arabidopsis para serem usadas como doadoras de septo e estigma; garantir que eles são saudáveis e começaram recentemente a produzir siliques.
NOTA: Landsberg erecta (Ler-0) é um bom acessório para uso como doador de septo, uma vez que seus septos são resistentes, e há pequenos entrenós entre os óvulos. Columbia (Col-0) é uma boa adesão para uso como um doador estigma porque eles parecem ser propícios para o crescimento do tubo polínico. - Emascular pelo menos três flores doadoras de septo estágio 12B e 12 flores doadoras estigma estágio 12B, removendo seus estames, sépalas e pétalas (Figura 1A, B). Remova também flores mais velhas na mesma inflorescência, o que poderia potencialmente polinizar a flor emasculada.
- Pela manhã, 24 h depois, polinize os doadores estigma com as flores doadoras de pólen (por exemplo, abrigando tubo polínico ou marcadores de espermatozoides) que estão prontamente liberando pólen. A polinização é completa quando os estigmas estão quase completamente cobertos por pólen (Figura 1B).
4. Dissecção septal
Figura 2: Guia rápido para dissecção septal e estigma . (A) Passos da dissecção septal. Fixar o pistilo em fita dupla face com uma agulha de seringa de insulina e fazer cortes na junção ovariano-pedículo, seguido de um corte raso ao longo do septo de cada carpelo (Passo 1). Descasque as paredes do carpo de volta para a fita adesiva (Passo 2). Corte o replum sob o septo superior (Passo 3). Cortar o septo no estilo e retirar com pinça no pedicelo (Passo 4). Coloque o septo em meio ágar e embuta suavemente com pinças. (B) Passos da dissecção do estigma. Fixar o pistilo (polinizado <1 h antes) em fita dupla face e cortar na junção estilo-ovário com uma lâmina de barbear (Passo 6). Coloque o estigma em meio ágar com uma agulha de insulina próxima ao septo e ajuste a distância para cerca de 250 μm (Passos 7-8). Certifique-se de que uma piscina semi-líquida se forme ao redor das micrópilas e da base dos estilos (Passo 9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Trinta minutos após a polinização, colete pistilos de doadores de septo saudáveis e maduros no pedículo e coloque-os em fita adesiva dupla face fresca montada em uma lâmina de vidro, com o estigma grudado apenas na borda da fita.
NOTA: Limite o tempo de dissecção durante o qual os pistilos estão na fita adesiva para garantir que seja o mais curto possível. A dissecção deve ser realizada com alta umidade, o que pode ser conseguido colocando-se um umidificador ao lado da lâmina. - Fixe o pistilo firmemente na fita pressionando suavemente o pedículo e ao longo do ovário usando a parte de trás de uma nova agulha de seringa de insulina antes de remover os restos de sépala, pétala e estame que sobraram da emasculação.
- Sob um estereoscópio, utilizar uma agulha de seringa de insulina para fazer dois cortes por carpelo na junção estilo-ovário e na junção ovário-pedículo, seguidos de cortes rasos ao longo do septo de cada carpelo (Figura 2, passo 1).
NOTA: Cortar muito profundamente ao longo do septo cortará os óvulos no funículo. - Descasque cuidadosamente as paredes do ovário sobre a fita adesiva (Figura 2, passo 2) e deslize suavemente a agulha entre os dois septos para cortar a reamexia ao longo de toda a extensão do pistilo sem perturbar os óvulos (Figura 2, passo 3).
NOTA: Corte o replum na direção do estilo para o pedículo para garantir que os óvulos no septo superior sejam perturbados o mínimo possível. - Cortar suavemente o septo superior tanto na junção com o estilismo quanto com o pedículo e retirar o septo com pinça do lado do pedículo (Figura 2, passo 4).
OBS: Mantenha este corte reto e suave para que o septo fique plano e não se curve. - Coloque o septo o mais plano possível no meio de tal forma que as micrópilas dos óvulos estejam voltadas para cima e no mesmo plano focal. Pressione o septo suavemente no meio até que os óvulos estejam levemente embutidos no meio (Figura 2, passo 5).
NOTA: É fundamental que o septo seja colocado de forma que as micrópilas dos óvulos sejam acessíveis aos tubos polínicos (quaisquer óvulos inacessíveis podem ser suavemente rearranjados com uma agulha). Uma pequena piscina de líquido deve se formar ao redor do septo após a incorporação. - Repita os passos 4.1-4.6 para até mais dois pistilos, colocando os septos de ponta a ponta.
5. Dissecção do estigma
- Coloque os pistilos doadores de estigma polinizados em fita adesiva dupla face fresca montada em uma lâmina de vidro, de modo que a junção do ovário fique fora da borda da fita (Figura 2, passo 6).
- Use uma lâmina de barbear fresca para cortar o estilo para baixo e levante-o para manter o estigma preso à lâmina (Figura 2, passo 6).
NOTA: Corte na borda da fita para o corte mais limpo. - Remova o estigma da lâmina com uma agulha de seringa de insulina e coloque-a a aproximadamente 250-300 μm dos óvulos (Figura 2, passos 7-8).
OBS: O estilo deve ser orientado horizontalmente de lado; caso contrário, a maioria dos tubos polínicos crescerá sob o septo. Uma pequena poça de líquido na entrada do estilo deve aparecer depois de ter ficado deitado no meio por 1 min; Isso é um bom sinal, pois os tubos polínicos terão uma saída suave do estilo. - Repita os passos 5.1-5.3 para até 12 estigmas, colocando dois de cada lado de cada septo. Procure uma pequena piscina de líquido se formando ao redor da micrópila dos óvulos; isso auxilia na acessibilidade e direcionamento dos tubos polínicos para os sacos embrionários (Figura 2, passo 9).
OBS: Limite o tempo que o prato fica aberto para evitar que o meio e os óvulos sequem.
6. Exames por imagem
Figura 3: Esquema de imagem do septo septal SIV. (A) Configuração completa do SIV cum septum com 12 estigmas polinizados e 3 septos, visto através de um estereoscópio. (B) Imagens mescladas do encaixe completo do septo SIV visto em A 5 h após a incubação usando uma objetiva de 10x, com as cinco áreas de visão geral (~1 mm cada) marcadas para aquisição em múltiplos estágios. As caixas verdes mostram os óvulos que receberam tubos polínicos sofrendo uma explosão explosiva nos sinergídeos. (C) Visão mais detalhada da área de visão geral 2 em diferentes momentos. Aproximadamente 3 h após a incubação na câmara de umidade do microscópio, os tubos polínicos devem chegar perto das micrópilas e, até 6 h de imagem, a maioria dos óvulos deve ter recebido adequadamente os tubos polínicos (quadrados verdes); Esses óvulos então sofrem explosão do tubo polínico explosivo (asterisco). Barras de escala = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Feita a dissecção e pronta para ser fotografada, deixe incubar em uma câmara de umidade no microscópio mantida a 92% de umidade relativa e 21 °C.
NOTA: Se nenhuma câmara de umidade estiver disponível para o microscópio, forrar as bordas externas da tampa e do prato com um pequeno volume de água ajudará a manter um alto nível de umidade no prato. - Coloque as amostras em foco sob campo de brilho a uma intensidade de luz baixa e, em seguida, mude para luz fluorescente, marcando as áreas da amostra na visão geral do palco a ser fotografada.
OBS: Em aumento de 10x, cerca de cinco áreas podem ser marcadas para um total de três septos (Figura 3). Limitar o tempo utilizado para marcar as áreas de visão geral para minimizar a fototoxicidade ou o aquecimento da amostra pela luz fluorescente. - Comece a criar imagens usando um esquema de aquisição de vários estágios com uma função de foco automático no início de cada área de visão geral. Como os tubos polínicos emergirão do estilo ~1 h após incubar a amostra, atrasar a aquisição em 2 h ou até que os tubos polínicos tenham atingido a micrópila. Certifique-se de que o foco automático esteja definido com um intervalo de 100 μm (7 μm de passos grandes e 1 μm de passos finos) para manter os óvulos em foco à medida que os septos se movem ligeiramente e afundam com o tempo.
- Interromper a aquisição da imagem ~9 h após iniciar a incubação da amostra, pois a essa altura, a maioria dos óvulos já deveria ter atraído e recebido um tubo polínico.
NOTA: Se um baixo número de óvulos atrair tubos polínicos, a observação cuidadosa do prato sob um estereoscópio é útil para determinar como a orientação do óvulo ou do estilo pode ser melhorada da próxima vez.
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Resultados
Para avaliar o tempo de degeneração nuclear no sinérgico receptivo com relação à ruptura do tubo polínico em Arabidopsis , bem como para observar se o sinérgico esquerdo ou direito está predestinado a se tornar o sinérgico receptivo, o método SIV cum septum descrito aqui foi empregado usando um marcador nuclear gametófito feminino empilhado com um marcador citosólico sinérgico (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) como doador de septo e marcador gametófito masculino (pLAT52:R-GECO)
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Discussão
Este manuscrito apresenta um protocolo eficiente para obtenção de imagens de recepção de tubo polínico e dupla fertilização em Arabidopsis. O método aprimorado, SIV cum septum, aumenta consideravelmente a porcentagem e o número total de eventos bem-sucedidos de recepção do tubo polínico que são observáveis por sessão de imagem. Os resultados representativos mostrados aqui demonstram uma sessão de imagem com 41 eventos bem-sucedidos de recepção do tubo polínico e 10 óvulos mostrando defeitos de recepção ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Sara Simonini e Stefano Bencivenga pela doação do construto pFG:roGFP2-ORP1-NLS e a Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter e Celia Baroux por seus conselhos sobre microscopia. Agradecemos gentilmente os conselhos de Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima e todos os outros na Conferência Internacional sobre Reprodução Sexual de Plantas 2022 que mostraram interesse em um protocolo sobre SIV cum septum. Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique e subsídios da Fundação Nacional de Ciência da Suíça para a U.G.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâmina de vidro de 1 mm | Epredia | ||
| prato com fundo de vidro de 35 mm (14 mm de po) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Cloreto de Cálcio | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Centro de Estoque de Arabidopsis de Nottingham (NASC) | estigma doador | |
| Dissecting Scope | Olympus | Agulha de insulina SZX2-ILLT | |
| (0,3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | septo | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | |
| Sulfato de Magnésio | Merck | 5886 | |
| Cloreto de Potássio | Roth | 6781.1 | |
| Lâmina de barbear | Beldura | 7026797 | |
| Scotch | Scotch | 768720 | Menos espesso e bom para dissecção de estigma |
| Cloreto de Sódio | Reagentes Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW | A2211,1000 | |
| Tesa fita dupla face | Tesa | 05681-00018 | Muito pegajoso e bom para dissecção do septo |
| Temperatura de gelificação ultra baixa agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Referências
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7(2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645(2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722(2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
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Reimpressões e permissões
