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Automatização do processamento de brotos cítricos para detecção de patógenos a jusante por meio de engenharia de instrumentos

DOI:

10.3791/65159

⸱

April 21st, 2023

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1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós projetamos, fabricamos e validamos um instrumento que processa rapidamente tecidos de brotos cítricos ricos em floema. Em comparação com os métodos atuais, o extrator de tecido de budwood (BTE) aumentou o rendimento da amostra e diminuiu os custos de mão de obra e equipamentos necessários.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patógenos de citros transmissíveis por enxerto e limitados por floema, como vírus, viróides e bactérias, são responsáveis por epidemias devastadoras e graves perdas econômicas em todo o mundo. Por exemplo, o vírus da tristeza dos citros matou mais de 100 milhões de árvores cítricas em todo o mundo, enquanto o "Candidatus Liberibacter asiaticus" custou à Flórida US$ 9 bilhões. O uso de brotos de citros testados por patógenos para propagação de árvores é fundamental para o manejo desses patógenos. O Programa de Proteção Clonal de Citros (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, usa ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR) para testar milhares de amostras de árvores fontes de brotos cítricos todos os anos para proteger os citros da Califórnia e fornecer unidades de propagação limpas para a National Clean Plant Network. Um gargalo severo na detecção molecular de alto rendimento de vírus e viróides cítricos é a etapa de processamento de tecidos vegetais.

A preparação adequada dos tecidos é crítica para a extração de ácidos nucleicos de qualidade e uso a jusante em ensaios de PCR. O corte, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação de tecidos vegetais a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico consome muito tempo e trabalho e requer equipamentos laboratoriais caros e especializados. Este trabalho apresenta a validação de um instrumento especializado projetado para processar rapidamente tecidos de casca ricos em floema de brotos cítricos, denominado extrator de tecido de madeira de brotação (BTE). O BTE aumenta o rendimento da amostra em 100% em comparação com os métodos atuais. Além disso, diminui a mão de obra e o custo dos equipamentos. Neste trabalho, as amostras de BTE apresentaram um rendimento de DNA (80,25 ng/μL) comparável ao protocolo de corte manual do CCPP (77,84 ng/μL). Este instrumento e o protocolo de processamento rápido de tecidos vegetais podem beneficiar vários laboratórios e programas de diagnóstico de citros na Califórnia e se tornar um sistema modelo para o processamento de tecidos para outras culturas lenhosas perenes em todo o mundo.

Introduction

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Patógenos de citros transmissíveis por enxerto, como viróides, vírus e bactérias, têm causado epidemias devastadoras e sérias perdas econômicas em todas as áreas produtoras de citros do mundo. Os viróides dos citros são fatores limitantes de produção devido às exocortices e caquexias que causam em tipos de citros de importância econômica, como trifoliados, híbridos trifoliados, tangerinas, clementinas e tangerinas 1,2,3. Na Califórnia, esses tipos de citros sensíveis a viróides são a base do crescente e lucrativo mercado de "easy-peelers", seguindo a tendência de mudança na preferência dos consumidores por frutas fáceis de descascar, segmentadas e sem sementes 4,5,6. Assim, os viróides dos citros são regulamentados pelo Departamento de Alimentação e Agricultura da Califórnia (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senado Bill 140", e os laboratórios do Plant Pest Diagnostics Branch da CDFA realizam milhares de testes de viróides dos citros anualmente 7,8,9,10 . O vírus da tristeza dos citros (CTV) foi responsável pela morte de mais de 100 milhões de citros desde o início da epidemia mundial na década de 1930 3,9,10,11. Na Califórnia, isolados do vírus representam uma séria ameaça para a indústria de citros californiana de US$ 3,6 bilhões12,13,14. Consequentemente, a CDFA classifica o CTV como uma praga de planta de classe A regulamentada, e o laboratório da Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) realiza extensas pesquisas de campo e milhares de testes de vírus todos os anos15,16. Estima-se que a bactéria "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) e a doença huanglongbing (HLB) tenham causado cerca de US$ 9 bilhões de danos econômicos à Flórida como resultado de uma redução de 40% da área cultivada com citros, uma diminuição de 57% nas operações de citros e uma perda de quase 8.000 empregos17,18. Na Califórnia, uma hipotética redução de 20% na área cultivada com citros devido ao HLB foi prevista para resultar em mais de 8.200 perdas de empregos e uma redução de mais de meio bilhão de dólares no produto interno bruto do estado. Portanto, o Programa de Prevenção de Pragas e Doenças dos Citros gasta mais de US$ 40 milhões anualmente em pesquisas para testar, detectar e erradicar CLas da Califórnia14,17,19,20.

Um elemento-chave do manejo de viróides, vírus e bactérias dos citros é o uso de materiais propagativos testados por patógenos (ou seja, madeira de brota) para a produção de árvores. A brota cítrica testada por patógenos é produzida e mantida dentro de programas quarentenários abrangentes que empregam técnicas avançadas de eliminação e detecção de patógenos10,21. O Citrus Clonal Protection Program (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, testa milhares de amostras de budwood todos os anos de variedades cítricas recém-importadas para o estado e os EUA, bem como árvores de origem de budwood cítrico, para proteger os citros da Califórnia e apoiar as funções da National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Para lidar com o grande volume de testes de citros, ensaios de detecção de patógenos de alto rendimento, confiáveis e custo-efetivos são um componente fundamental para o sucesso de programas como o CCPP 7,10,22.

Embora ensaios de detecção de patógenos de base molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), tenham permitido aumentos significativos no rendimento em laboratórios de diagnóstico de plantas, em nossa experiência, um dos gargalos mais críticos na implementação de protocolos de alto rendimento é a etapa de processamento de amostras de tecido vegetal. Isso é particularmente verdadeiro para os citros porque os protocolos atualmente disponíveis para o processamento de tecidos ricos em floema, como pecíolos foliares e cascas de brotas, são trabalhosos, demorados e requerem equipamentos laboratoriais caros e especializados. Esses protocolos requerem corte manual, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico 8,23,24. Por exemplo, no laboratório de diagnóstico CCPP, o processamento de amostras inclui (i) corte manual (6-9 amostras/h/operador), (ii) liofilização (16-24 h), (iii) pulverização (30-60 s) e (iv) centrifugação (1-2 h). O processo também requer suprimentos especializados (por exemplo, tubos de bloqueio de segurança para serviço pesado, bolas de moagem de aço inoxidável, adaptadores, lâminas, luvas) e várias peças de equipamentos de laboratório caros (por exemplo, freezer ultrabaixo, liofilizador, pulverizador de tecidos, crioestação de nitrogênio líquido, centrífuga refrigerada).

Como em qualquer indústria, a engenharia de equipamentos e a automação de processos são fundamentais para reduzir custos, aumentar o rendimento e fornecer produtos e serviços uniformes e de alta qualidade. A indústria de citros precisa de instrumentos de processamento de tecidos de baixo custo que exijam habilidade mínima para operar e, como tal, sejam fáceis de transferir para laboratórios de diagnóstico e operações de campo para permitir alta capacidade de processamento de amostras para detecção rápida de patógenos a jusante. A Technology Evolving Solutions (TES) e o CCPP desenvolveram (i.e., projetam e fabricam) e validaram (i.e., testados com amostras de citros e comparados com procedimentos laboratoriais padrão) um instrumento de baixo custo (i.e., eliminou a necessidade de equipamentos laboratoriais especializados) para o processamento rápido de tecidos cítricos ricos em floema (i.e., budwood), denominado extrator de tecido de budwood (BTE). Como visto na Figura 1, o BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema do broto cítrico. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa contendo tampão de extração, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional (Figura 1). O sistema BTE também inclui um aplicativo de rastreamento de amostras sem papel e um aplicativo de pesagem integrado, que registram as informações de processamento de amostras em um banco de dados on-line em tempo real.

O sistema BTE aumentou a capacidade de diagnóstico laboratorial do CCPP em mais de 100% e tem consistentemente produzido extratos de tecido cítrico adequados para a purificação de ácidos nucleicos de alta qualidade e a detecção a jusante de patógenos transmissíveis por enxerto de citros usando ensaios de PCR. Mais especificamente, o BTE reduziu o tempo de processamento de tecidos de mais de 24 h para ~3 min por amostra, substituiu instrumentos de laboratório que custavam mais de US$ 60.000 (Figura 2, etapas 2-4) e permitiu o processamento de amostras maiores.

Este artigo apresenta os dados de processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento BTE, extração de ácido nucleico e validação de detecção de patógenos com amostras de brotos cítricos de árvores de origem, incluindo todos os controles positivos e negativos apropriados da Instalação de Quarentena CCPP Rubidoux e da Instalação da Fundação Lindcove, respectivamente. Também apresentamos as mudanças de produtividade e tempo de processamento em comparação com o procedimento laboratorial atual (Figura 2). Além disso, este trabalho fornece um protocolo detalhado e passo a passo para laboratórios de testes de patógenos cítricos e demonstra como o BTE pode apoiar as funções de estoque de viveiro limpo de patógenos, levantamento e programas de erradicação.

figure-introduction-1
Figura 1: Extrator de tecido de budwood. O BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema da madeira de brotos cítricos. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional. Abreviação: BTE = extrator de tecido de budwood. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Comparação passo a passo entre o procedimento convencional de laboratório de corte manual e o processamento de BTE. O processamento de BTE envolve processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento, extração de ácido nucleico e detecção de patógenos. O tempo para cada etapa é indicado entre parênteses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

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1. Coleta das amostras de brotos cítricos para envio

  1. Envie à Technology Evolving Solutions uma planilha de informações de árvore para que eles carreguem em seu servidor web (eventualmente, o usuário criará novas árvores).
  2. Use o rastreador TES do aplicativo de telefone para selecionar uma árvore e mantenha uma etiqueta de coleira de comunicação de campo próximo (NFC) no telefone para carregar as informações da árvore na tag.
  3. Insira de três a quatro amostras de broto cítrico no porta-sacos plásticos compatível com BTE e feche com a tampa.
    1. Certifique-se de que o comprimento da gema não exceda 8 pol e não seja inferior a 5 pol.
      1. Se o comprimento for superior a 8 pol, use uma lâmina de barbear descartável estéril ou tesouras de poda descontaminadas com solução de água sanitária a 10% (hipoclorito de sódio a 1%) para torná-la mais curta.
      2. Se o comprimento for inferior a 5 pol, colete uma amostra diferente de madeira de broto para colocar no saco.
    2. Certifique-se de que qualquer crescimento axilar ou espinhos grandes sejam removidos à mão ou usando ferramentas de corte higienizadas com água sanitária a 10% (hipoclorito de sódio a 1%).
      OBS: Esta etapa é importante para que a gema seja mais fácil de manobrar na abertura da câmara.
    3. Certifique-se de que não há amostras de madeira de broto que tenham características curvas. Se o fizerem, retire-os com ferramentas de corte higienizadas a 10% (hipoclorito de sódio a 1%) e coloque nos sacos BTE apenas as porções retas da amostra.
      NOTA: O budwood curvo é muito difícil de manobrar no instrumento, resultando em listras irregulares da casca.
  4. Use o rastreador TES do aplicativo de telefone para escanear a etiqueta de colar NFC da árvore e vinculá-la à tag de clipe NFC na bolsa de amostra.
  5. Preste atenção à espessura da madeira de gema, pois isso determina como o operador irá retirar a casca de madeira de broto rica em floema dentro da câmara BTE.
    1. Se a madeira de gema tiver uma espessura abaixo de 0,20 pol, tenha cuidado ao descascar a madeira de gema, porque os fios de fiação de alta velocidade na câmara pulverizarão toda a madeira de gema até seu núcleo, além da camada de casca e nos tecidos não ricos em floema de madeira e medula.
    2. Selecione brotos mais espessos porque é mais fácil retirar os tecidos da casca, evitando os tecidos de madeira de broto não ricos em floema.
  6. Coloque as amostras em um recipiente de transporte isolado com algumas bolsas de gelo.

2. Configuração no exaustor

OBS: É preferível operar o BTE dentro de um exaustor. Isso reduzirá o risco de contaminação cruzada de tecidos vegetais e contaminação de laboratório.

  1. Desinfetar usando um borrifador de 10% (hipoclorito de sódio a 1%).
    1. Borrife a superfície do capuz e deixe a água sanitária descansar por cerca de 1 min antes de limpá-la com um papel toalha.
    2. Borrife um papel toalha com a solução de água sanitária. Limpe a base TE, os componentes da balança de peso (balança, escudo de ar e torre) e uma caneta marcadora.
  2. Desembrulhe uma seringa definida para o número de amostras a serem processadas e coloque-as dentro de uma caixa de papelão coberta.
  3. Tenha um pacote de cotonetes disponíveis fora do capô, caso sejam necessários.
  4. Prepare a balança de peso.
    1. Remova a torre de peso da balança e mantenha pressionado o botão liga/desliga para ligá-la. Coloque a torre no centro da escala depois que a escala exibir 0.
    2. Deslize a proteção de ar da balança de peso sobre a frente da balança.
  5. Prepare a base do extrator de tecido acionando o interruptor na parte de trás. Certifique-se de que o interruptor no lado esquerdo da caixa está pressionado para baixo na parte superior. Aguarde um LED verde piscando, que indica que a câmara está pronta.

3. Montagem das estações de limpeza (Figura Suplementar S1).

  1. Coloque 1 L de água no limpador ultra-sônico.
  2. Embrulhe dois sacos de lixo por cima do limpador ultrassônico.
  3. Despeje ~5 L de água sanitária a 10% (solução de hipoclorito de sódio a 1%) no limpador ultrassônico.
  4. Encha a banheira de água com água suficiente para submergir uma câmara.
  5. Ligue o compressor de ar e abra a válvula.
  6. Monte um pano de fundo para pegar o líquido enquanto a câmara está secando.

4. Processamento do material para o BTE para a decapagem da casca da brota cítrica

  1. Carregue a câmara na Base BTE.
    1. Preparar a Câmara BTE.
      1. Anexe um saco de amostra vazio à parte de trás da câmara. Use dois O-rings para prender o saco vazio ao bocal traseiro da câmara BTE.
      2. Inspecione a lâmina em busca de sinais de desgaste ou danos, como cortes que se formam na lâmina onde ela continua no plástico ou cortes que se formam na ponta. Certifique-se de que a seta na lâmina esteja alinhada com o símbolo de bloqueio único.
      3. Certifique-se de que a liberação de ar na parte inferior da câmara esteja voltada para o símbolo O . Coloque a tampa transparente sobre a abertura da câmara e deslize a corrediça BTE transparente para a câmara usando a pista à direita da câmara. Empurre a trava na parte inferior da câmara até onde ela puder ir para o slide. Verifique se a tampa do êmbolo está montada na parte superior da corrediça.
    2. Coloque a câmara na base BTE com o bocal da base BTE saliente na parte de trás da câmara. Aguarde até que o LED azul pisque, indicando que o posicionamento foi bem-sucedido.
  2. Carregue a amostra na base do BTE movendo o adesivo branco na etiqueta do clipe NFC para um Z no lado direito da caixa. Mova a tag em um movimento circular lento em Z até que a luz amarela comece a piscar. Fixar a amostra à base BTE e certificar-se de que o saco de amostra não tem furos; Se houver um furo, remarque-o com fita adesiva. Coloque o O-ring sobre o saco de amostra para prendê-lo à frente do bico BTE.
  3. Carregue o conjunto de seringas não utilizado.
    1. Tara o conjunto de seringas. Coloque a seringa não utilizada colocada na torre da balança. Remova o conjunto de seringas quando uma luz vermelha começar a piscar ou a escala exibir 0.
    2. Retire o êmbolo da seringa com o filtro. Certifique-se de que o fluido está na seringa inferior (não filtrante). Coloque o êmbolo de lado sobre um papel toalha ou sobre a torre onde o êmbolo preto não está tocando nenhuma superfície.
    3. Conecte a seringa à porta de saída deslizante pressionando a porta de saída na seringa e girando 90°.
  4. Processar a amostra de madeira de gema.
    ATENÇÃO: O BTE possui partes móveis de alta velocidade. Toda a operação precisa ocorrer dentro de um exaustor. Todos os usuários devem usar óculos de proteção, protetores auriculares e todos os outros equipamentos de proteção individual (EPIs), como luvas e jalecos.
    1. Pressione o botão preto superior para iniciar a máquina. Pressione uma segunda vez para parar o motor a qualquer momento durante o processamento.
      NOTA: A caixa tem sensor de velocidade e temperatura para garantir que funcione corretamente.
    2. Pegue um palito de madeira no saco e coloque-o na parte superior do bico BTE.
    3. Pegue o palito de madeira do outro lado da câmara com a outra mão e lentamente desça na lâmina. Ouça um zumbido suave indicando que o budwood está sendo descascado. Mova lentamente a madeira de botão para frente e para trás enquanto a gira.
      1. Se for ouvido um som alto e agressivo de corte, mova rapidamente o ramo para a parte superior e/ou pressione o botão superior para parar o motor. Para parar o motor, utilize o interruptor do lado direito para concluir o processamento (ver passo 4.4.3.2).
      2. Se nenhum material estiver saindo da saída ao cortar, a câmara tem um entupimento. Desligue o motor, remova a tampa do êmbolo deslizante e use o plástico do cotonete para empurrar o entupimento para fora da saída da máquina. Use o interruptor do lado direito para concluir o processamento: Up = Forward cutting; Meio = Motor desligado; Down = Corte Reverso.
    4. Repita as etapas 4.4.2 e 4.4.3 para as ramificações restantes.
      NOTA: Um indicador geral de que a casca de broto suficiente foi removida é quando 25% da seringa foi preenchida com tecido vegetal. Patógenos transmissíveis por enxertos de citros podem estar distribuídos de forma desigual na árvore. Portanto, três a quatro amostras de madeira de brota são coletadas ao redor da copa dos citros. É importante que cada amostra de madeira de gema no saco de transporte BTE contribua para a amostra final de tecido moído para garantir que uma amostra representativa de árvore completa será testada para agentes patogénicos.
    5. Pressione o botão preto superior para interromper o processamento. Aguarde até que a luz comece a piscar amarela novamente.
  5. Verifique o peso da amostra.
    1. Gire a seringa 90° e puxe-a para baixo para se desprender. Coloque o êmbolo de volta na seringa e coloque a seringa na torre.
    2. Aguarde até que a balança detecte automaticamente a amostra e determine se ela está dentro da faixa de peso adequada (0,25 ± 0,05 g). Se o peso da amostra for demasiado baixo (<0,20 g), repetir o passo 4.4; o LED vermelho começará a piscar. Se o peso da amostra for demasiado elevado (>0,30 g), retirar parte do material da amostra; o LED amarelo começará a piscar mais lentamente. Se a amostra estiver dentro do intervalo, o LED verde começará a piscar.
  6. Homogeneização da amostra de gemas
    1. Retire o êmbolo da seringa com a amostra, empurre o líquido para dentro da seringa com a amostra e adicione novamente o êmbolo. O êmbolo empurra o tampão e a seiva da planta através do filtro de malha (retendo quaisquer pedaços grandes de tecido da casca) e através do tubo de borracha para a seringa vazia.
    2. Misture a amostra empurrando o tampão e a seiva da planta de um para o outro de uma seringa para a outra. Repita ~3x-4x e até que a amostra se torne uma mistura líquida verde homogênea.
    3. Uma vez bem homogeneizada, empurre a amostra de seiva vegetal para dentro da seringa sem o filtro de malha e retire o tubo de borracha e a seringa com o filtro da seringa com a amostra.
    4. Expulsar a amostra de seiva vegetal da seringa para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml e conservar a -20 °C até nova utilização. Use um marcador permanente para rotular a amostra com o número do saco.
      NOTA: A seiva da amostra vegetal da etapa 4.6.5 pode agora ser processada com qualquer um dos ácidos nucleicos, RNA ou ADN disponíveis, métodos de extracção baseados em fenol-clorofórmio, coluna de sílica ou esferas magnéticas 9,25,26,27 para extracção e purificação de ácidos nucleicos (ver passo 7) e detecção a jusante de agentes patogénicos transmissíveis por enxertos de citrinos (ver passo 8).

5. Higienização da câmara removível do BTE

CUIDADO: Se o tampão do conjunto de seringas entrar na câmara ou deslizar, enxágue e siga todas as regras de segurança do laboratório antes da limpeza. O conjunto de seringas contém tiocianato de guanidina. Se o tampão do conjunto de seringas entrar em contato com a água sanitária, ele criará gás cianeto.

  1. Execute as etapas a seguir após o processamento da 10ª amostra na câmara. Observe que o LED verde continuará piscando em vez de passar para o azul piscando.
  2. Desmontar a câmara BTE para limpar todos os possíveis contaminantes; Remova a tampa de plástico transparente, limpe a corrediça da câmara e limpe a porta de entupimento na corrediça da câmara.
  3. Gire a válvula de liberação de ar na parte inferior da câmara para a posição aberta (marca de cadeado aberto). Coloque os componentes da câmara no limpador ultrassónico de configuração (ver passo 3.1). Coloque a tampa sob a câmara para evitar que flutue. Execute o limpador ultra-sônico por 15 min.
    NOTA: O banho de limpeza ultra-sônica (5 L) pode conter até duas câmaras.
  4. Enxaguar os componentes da câmara em banho-maria (passo 3.4) durante, pelo menos, 30 s. Mova os componentes da câmara para a estação de secagem.
    CUIDADO: A secagem causará movimentos rápidos nas partes dentro da câmara, ruídos altos (~85 decibéis [dB]) e possíveis respingos. Todos os usuários devem usar óculos de proteção, protetores auriculares, jalecos e todos os outros EPIs, conforme exigido pelas normas de segurança do laboratório operacional.
  5. Secar a câmara BTE.
    1. Posicione a pistola de ar em linha com o sulco da abertura superior da câmara (onde normalmente estaria a corrediça). Pressione o gatilho da arma para distribuir ar por ~30 s.
      Observação : verifique se a abertura está longe do usuário em direção ao pano de fundo. Isso deve girar o conjunto de lâminas para remover o líquido preso embaixo dela.
    2. Posicione a pistola de ar em direção aos bicos superiores da câmara. Pressione o gatilho da pistola de ar e trace lentamente três círculos completos de cada entrada do bico.
    3. Posicione a pistola de ar no centro do BTE. A partir do ponto mais interno, segure o gatilho para baixo e mova-se até que a pistola de ar aponte para onde o escorregador estaria.
    4. Passe rapidamente o ar por toda a câmara, frente e verso, para tirar a água da superfície do exterior.
  6. Seque a lâmina do BTE.
    1. Posicione a pistola de ar na ranhura do êmbolo da corrediça e pressione o gatilho para ejetar água para fora da saída da corrediça.
    2. Passe uma pistola de ar ao longo da superfície interna da corrediça para secá-la.
    3. Execute uma pistola de ar ao longo do sulco do escorregador para empurrar a água.
    4. Passe rapidamente o ar por todo o exterior para tirar água da superfície.
  7. Seque os componentes.
    1. Segure a tampa do êmbolo deslizante e os O-rings na mão e pressione o gatilho.
    2. Passe uma pistola de ar sobre a superfície interna da tampa.
    3. Coloque os componentes na câmara e deslize para continuar secando ou remontá-los.
      NOTA: Para um ambiente de alto processamento de tecidos com vários BTEs funcionais, pode ser fornecido um sistema de higienização em lote capaz de descontaminar 10 câmaras simultaneamente.

6. Descarte e higienização

  1. Descarte as seringas e tubos de borracha no recipiente de resíduos de guanidina designado.
  2. Descarte qualquer material vegetal no recipiente de resíduos bioperigosos.
  3. Remova a câmara BTE da base BTE.
  4. Desmontar a câmara BTE e proceder à sua descontaminação, conforme descrito na etapa 5.

7. Avaliação do processamento tecidual e da qualidade do RNA purificado dos extratos de brotos de citros BTE

NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas amostras de budwood de 255 citros para comparar o tempo necessário para o processamento do tecido da brota cítrica e a qualidade do RNA purificado a partir de extratos de tecido da casca preparados por BTE (Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) versus aquele preparado seguindo o método de processamento de tecido de budwood de citros aprovado regulamentadamente utilizando descascamento e corte manual, liofilização, pulverização e centrifugação do tecido da casca, conforme descrito por Dang et al.23 (Figura 2, lado esquerdo, passos 1-6).

  1. Procedimento laboratorial atual: Preparar amostras de budwood para processamento de tecidos de acordo com o método aprovado regulamentarmente23.
    1. Realizar descascamento e corte manual do tecido da casca, liofilização, pulverização, centrifugação e transferência da seiva da planta para o tubo de extração de RNA, conforme descrito por Dang et al.23 (Figura 2, lado esquerdo, passos 1-6).
    2. Depois de descascar manualmente as três a quatro amostras de gema de cada árvore testada, colocar toda a gema dentro de um porta-sacos plásticos compatível com BTE e armazenar a 4 °C até ao processamento do BTE (passo 7.2).
  2. Procedimento BTE: Iniciar o processamento do tecido da brota cítrica BTE (secção 4, passos 4.1-4.6; Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6).
    1. Utilizar as amostras de madeira de gema armazenadas dentro dos sacos de transporte BTE do passo 7.1.2.
  3. Extrair e purificar o RNA da seiva vegetal obtida a partir do procedimento laboratorial atual (etapa 7.1.1) e do procedimento BTE (etapa 7.2.2) utilizando o método semi-automatizado baseado em esferas magnéticas aprovado regulamentarmente 8,23,28.
  4. Avaliar a qualidade do RNA medindo sua concentração, pureza e integridade 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Para calcular a concentração, use espectrofotometria e densidade óptica (DO) no comprimento de onda de 260 nm.
    2. Para avaliar a pureza, use uma razão OD espectrofotométrica de 260/280.
    3. Para verificar a integridade, utiliza-se a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) de transcrição reversa (RT) visando o RNAm do gene dos citros NADH desidrogenase24,32.

8. Avaliação da contaminação cruzada e detecção de vírus e viróides dos citros utilizando RNA purificado de extratos de brotos de citros BTE

NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas amostras de brotos de 72 citros não infectados e uma mistura de árvores infectadas com vírus e viróides para avaliar o potencial de contaminação cruzada entre amostras quando processadas por BTE (Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) e a adequação do RNA purificado de extratos de tecido da casca preparados por BTE para ser usado como molde para a detecção RT-qPCR de vírus e viróides dos citros.

  1. Primeiro processamento de amostra BTE: Realizar um experimento de linha de base com 72 amostras não infectadas.
    1. Preparar três câmaras (A-C) BTE (PASSO 4.1.1).
    2. Preparar todas as amostras de brotos de citrinos não infectadas (1-72) em sacos BTE e preparar um número igual (72) no sistema de recolha de amostras BTE com duas seringas, com um sistema de seringas para cada amostra (passo 2.4).
    3. Separe os sacos de coleta de amostras e as seringas de coleta de amostras em seis lotes (I-VI) de 12 amostras cada.
    4. Iniciar o processamento do tecido de broto cítrico BTE (etapa 4) seguindo a sequência abaixo (etapas 8.1.4.1-8.1.4.6) (Ver Tabela 1, Primeiro Processamento de Amostra BTE).
      1. Para o lote I/amostras 1-12, processar 12 amostras usando a câmara A. Higienizar a câmara A após a amostra 12 (etapa 5).
      2. Para o Lote II/Amostras 13-24, processar 12 amostras usando a câmara B. Sanitizar a câmara B após a amostra 24 (etapa 5).
      3. Para o lote III/amostras 25-36, processar 12 amostras usando a câmara C. Higienizar a câmara C após a amostra 36 (etapa 5).
      4. Para o lote IV/amostras 37-48, processar 12 amostras utilizando a câmara A higienizada (passo 8.1.4.1).
      5. Para o lote V/amostras 49--60, processar 12 amostras utilizando a câmara B higienizada (passo 8.1.4.2).
      6. Para o lote VI/amostras 60-72, processar 12 amostras utilizando a câmara C higienizada (passo 8.1.4.3).
    5. Conservar os sacos BTE com todas as amostras a 4 °C até à utilização no passo 8.2.
    6. Extrair e purificar o RNA das 72 amostras de seiva vegetal geradas nas etapas 8.1.4.1-8.1.4.6 usando o método semi-automatizado baseado em esferas magnéticas aprovado regulamentarmente 8,23,28.
    7. Realizar RT-qPCR para detecção de vírus e viróides dos citros, conforme descrito anteriormente 8,33.
  2. Para o segundo processamento de amostras de BTE, realizar um experimento de contaminação cruzada com 70 amostras não infectadas e duas amostras infectadas misturadas.
    1. Preparar três câmaras (A-C) BTE (PASSO 4.1.1).
    2. Preparar a amostra de brotos de citrinos infectados com mistura (73) em dois sacos de BTE (passo 1.3) para um número total de duas amostras infectadas.
    3. Recolher os sacos BTE com as amostras de brotos de citrinos não infectadas do passo 8.1.5, excepto a amostra 3-Lote I e a amostra 51-Lote V (ver substituição da amostra no ponto 8.2.4), para um número total de 70 amostras não infectadas.
    4. Incluir o primeiro saco BTE com a amostra infectada com a mistura 73 em vez da amostra 3 no lote I e o segundo no lugar da amostra 51 no lote V para um número total de 72 amostras.
    5. Preparar um número igual (72) no sistema de recolha de amostras BTE com duas seringas, com um sistema de seringas duplas para cada amostra (passo 2.4).
    6. Separe os 72 sacos de amostra e seringas de coleta de amostras em seis lotes (I-VI) de 12 amostras cada.
    7. Iniciar o processamento do tecido da brota dos citros BTE (etapa 4), seguindo a mesma sequência das etapas 8.1.4.1-8.1.4.6.
      NOTA: A única diferença é a substituição da Amostra 3 no Lote I e da Amostra 51 no Lote V pela amostra infectada 73 (etapa 8.2.4) (Tabela 1, Segundo Processamento de Amostra BTE).
    8. Extrair e purificar o ARN das 72 amostras de seiva vegetal geradas na etapa 8.2.7 como na etapa 8.1.6.
    9. Realizar RT-qPCR para a detecção de vírus cítricos e viróides, como na etapa 8.1.7.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extração, purificação e qualidade de RNA utilizando tecido cítrico de broto processado por BTE e avaliação do tempo de processamento tecidual
Foram utilizadas amostras de gema de 255 citros representativos para este teste para comparar a qualidade do RNA do BTE versus o procedimento padrão. As amostras foram processadas pelo extrator de tecido de budwood (BTE) (etapas do protocolo 4.1-4.6 e Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) ou preparadas seguindo o método de processamento de tecido d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o advento da doença dos citros do HLB, para reduzir as perdas, a indústria citrícola, as agências reguladoras e os laboratórios de diagnóstico têm sido instados a confiar em métodos de extração de ácido nucleico de alto rendimento combinados com processamento manual de amostras de baixo rendimento e ensaios de detecção de patógenos, como o qPCR34 , para o teste de árvores individuais, em combinação com práticas de manejo de doenças35. A taxa de positividade do HLB na Ca...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem o povo Cahuilla como os Guardiões Tradicionais da Terra na qual o trabalho experimental foi concluído. Somos gratos ao Professor Norman Ellstrand da Universidade da Califórnia, Riverside, por fornecer espaço de laboratório para realizar atividades de pesquisa para este projeto no âmbito da Iniciativa UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Esta pesquisa foi financiada pelo CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (processo nº 18-0001-055-SC). Apoio adicional também foi fornecido pelo projeto CRB 6100; Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do USDA, projeto Hatch 1020106; e o National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) concedido a Georgios Vidalakis.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linha de aparador hexagonal de 0,08"PowerCareFPRO07065necessário para substituir as lâminas.
Compressor de ar de 1 Hp, 8 galCalifornia Air Tools8010Câmaras secas rapidamente após enxaguadas
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLGlobe Scientific111558BArmazene a amostra após bochechar com seringas
Conjunto de seringas de 10 mLTechnology Evolving SolutionsTE006-F1-10A-G1000-E1O material da seringa é cortado. Frasco de 1 L com tampão de tiocianato de guanidina. AVISO - contém tiocianato de guanidina, resíduos perigosos serviço necessário - não misture com alvejante
Régua de 12"Westcott‎ 16012Para medir a linha do aparador antes de cortar
12% de hipoclorito de sódioHasa1041Desinfeta as câmaras após o
processamento-20 C FreezerInsigniaNS-CZ70WH0Armazene a amostra após o processamento
sacos plásticos de 4" x 12"PlymorFP20-4x12-10Sacos para guardar galhos durante o transporte. Anéis O-ring anexam o saco à câmara BTE para selar
Cotonete de Algodão de 6"Puritan806-PCLSwab para remover entupimentos
Tote de Armazenamento de 7 GalõesHDX206152Contém solução de hipoclorito de sódio para desinfetar câmaras e água para enxaguar câmaras Pistola
arJASTIND‎ JTABG103ADireciona o ar para as câmaras em alta pressão
Sharpie Preto  S-19421Marque tubos de 1,5 mL para que você possa identificar a amostra mais tarde
Dispensador de tampa de garrafaMarcaZ627569Dispensador de tampa de garrafa ajustável para dispensar guandina na seringa
BTE ChamberTechnology Evolving SolutionsTE002BB-A05-E1Usado para processar budwood. Inclui O-rings, Slide BTE, êmbolo deslizante, válvula de drenagem, tampa, conjunto de lâminas e ferramenta de remoção de conjunto de lâminas
Sabonete para PratosDawn57445CTSurfectante para melhorar a penetração de hipoclorito de sódio na câmara
Capuz de fumaça com filtro hepaAir ScienceP5-36XT-ACapuz de fumo com filtro hepa (ASTS-030)  para limitar a possível contaminação e proteger contra derramamentos químicos
Recipientede envio de espuma isoladaPolarTech261/J50CContêiner de transporte isolado para enviar amostras no gelo depois de coletadas
JalecoRed KapKP14WH LN 46Jaleco para limitar a possível contaminação e proteger contra derramamentos de produtos químicos
LaptopMicrosoftSurfaceLaptop compatível com Wifi para executar TES GUI. Necessário para a configuração inicial e fornece informações mais detalhadas sobre a base de processamento de tecidos
Telefone compatível com NFC TelefoneSamsungGalaxy S9para baixar e usar o aplicativo de telefone TES
Etiqueta de clipe NFCTecnologia Soluções em evoluçãoTE005-Clip-E1Etiqueta de amostra que pode ser vinculada a árvores. Feito para funcionar com o aplicativo de telefone TES
NFC Collar TagTechnology Evolving SolutionsTE005-Collar-E1Tag que está anexada a uma árvore. Feito para funcionar com o aplicativo de telefone TES
Luvas de NitriloUsa Scientific3915-4400Luvas para limitar a possível contaminação e proteger contra derramamentos químicos
Protetor de Ouvido Redutor de Ruído3M90565-4DC-PSProtege os ouvidos enquanto opera o compressor de ar e a base de processamento de tecidos
Mangueira de Ar de Recuo de PoliuretanoFYPower‎ 510019Acopla pistola de ar ao compressor
Óculos de segurançaSolidworkSW8329-USProtege os olhos contra perigos químicos e físicos
Frasco de sprayJohnBeeB08QM81BJVAlvejante em spray para desconatinar superfícies
Tecnologia de Base Extrator de TecidosSoluções EvolutivasTE001-A-E1Sistema para processar tecido vegetal. Precisa de câmaras BTE ou LTE para funcionar. Inclui cabo de alimentação, adaptador de lâmina e chave allen de 8/32"
Base de Processamento de TecidosTecnologia de Balança de Peso Evolving SolutionsTE003-A05-200g-01-E1Balança de peso de 200 g, resolução de 0,01 que se conecta à base de processamento de tecidos para impor faixas de peso e/ou vincular pesos com a amostra. Inclui balança, cabo de alimentação, cabo de conexão, suporte para seringa de 5ml, escudo de ar da torre 
VermiculitaEasyGoProdutosB07WQDZGRPNecessário para transportar resíduos perigosos (tiocianato de guanidina) usando um serviço de descarte de resíduos perigosos
Cortador de FioBoenfu‎ BOWC-06002-USCortadores de fio para cortar a linha do aparador
de o de

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Tags

Citrus Budwood ProcessingPathogen DetectionBudwood Tissue ExtractorNucleic Acid ExtractionCitrus Virus DetectionHigh Throughput ScreeningPlant Tissue HomogenizationPCR AssaysPhloem Rich TissueMolecular Diagnostics

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