Este protocolo descreve a visualização e quantificação de uma proteína específica dentro das células no nível celular para a cianobactéria contendo ficoeritrina, Crocosphaera watsonii.
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Artigo de método
Este protocolo descreve a visualização e quantificação de uma proteína específica dentro das células no nível celular para a cianobactéria contendo ficoeritrina, Crocosphaera watsonii.
Apresenta-se um protocolo para visualização e quantificação de uma proteína específica em células em nível celular para a cianobactéria marinha Crocosphaera watsonii, um produtor primário crucial e fixador de nitrogênio em oceanos oligotróficos. Um dos desafios para fixadores de N2 autotróficos marinhos (diazotróficos) é distinguir os sinais de fluorescência derivados da sonda da autofluorescência. C. watsonii foi selecionada para representar cianobactérias contendo clorofila, ficoeritrina e ficourobilina. O protocolo permite a visualização simples e semiquantitativa de proteínas em C. watsonii em nível de célula única, permitindo a investigação da produção de proteínas sob diferentes condições ambientais para avaliar as atividades metabólicas das cianobactérias alvo. Além disso, os métodos de fixação e permeabilização são otimizados para aumentar os sinais de fluorescência das proteínas-alvo para distingui-los da autofluorescência, especialmente da ficoeritrina e da ficourobilina. O sinal aprimorado pode ser visualizado usando microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo. Além disso, a intensidade de fluorescência foi semiquantificada usando o software Fiji. Esse fluxo de trabalho de análise de célula única permite a avaliação de variações célula a célula do conteúdo específico de proteínas. O protocolo pode ser realizado em qualquer laboratório de ciências da vida, pois requer apenas equipamento padrão e também pode ser facilmente adaptado a outras células cianobacterianas contendo ficoeritrina.
A variação fisiológica de célula para célula (comumente referida como "heterogeneidade") nas atividades metabólicas dentro de microrganismos, incluindo cianobactérias, foi documentada por meio de estudos em culturas de clones 1,2,3,4. Essa heterogeneidade engloba diversas atividades metabólicas, como divisão celular5, assimilação de carbono 6,7,8 e assimilação de nitrogênio....
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1. Cultivo de cianobactérias
2. Preparação de reagentes
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O sinal de fluorescência foi observado a partir de substâncias extracelulares no controle negativo, onde o1º anticorpo não foi utilizado (Figura 1A-C). O sinal de fluorescência do reagente reforçado com tiramida, conjugado à grande subunidade da proteína Rubisco (RbcL), foi detectado com sucesso em C. watsonii sob microscópio de fluorescência usando um filtro DAPI com excitação UV (Figura 1D-F
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Para cianobactérias, o sistema TSA encontrou uso generalizado na hibridização in situ de fluorescência TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), visando rRNA específico. No entanto, sua aplicação para proteínas permanece limitada26. Neste estudo, um procedimento TSA foi aplicado para permitir a imunodetecção de células inteiras da cianobactéria fixadora de N2 C. watsonii, incorporando modificações com base em uma referência anterior.......
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Confirmamos que não há conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Agradecemos ao Dr. Radek Kana e Barbora Šedivá pela assistência na análise microscópica confocal e ao Dr. Roman Sobotka e à Dra. Kateřina Bišová pelos conselhos em imunodetecção e análise de microscopia de fluorescência. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Pesquisa Tcheca GAČR (projeto 20-17627S para OP e TM), o projeto Mobility plus entre a JSPS e a Academia Tcheca de Ciências (JPJSBP 120222502) e JSPS KAKENHI (projeto 23H02301).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acromopeptidase | FUJIFILM | 014-09661 | |
| Alexa Fluor350 | Thermo Scientific | B40952 | Tiramida-350 |
| Alexa Fluor405 | Thermo Scientific | B48254 | Tiramida-405 |
| Alexa Fluor488 Tiramida SuperBoost Kit | Thermo Scientific | B40922 | Cabra anti-coelho IgG |
| Soro bovino albumina | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5804 R | |
| Tubos de centrífuga (15 mL) | VWR | 525-1085 | Para células de colheita |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM880 | Equipado com Airyscan |
| Microscópio de fluorescência | Olympus | BX51 | Filtro DAPI: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm |
| Gelatina | Merk | 4070 | |
| Vidros de cobertura de microscópio de alta precisão para microscópio confocal | Deckglä Fornecedor | 1.5H | |
| Liquid Blocker Regular/Mini | Daido Sangyo Co., Ltd. | Parte 6505 | Para manter as células no vidro deslizante |
| Lisozima | ITW Reagentes | A4972 | |
| Metanol | Carl Roth | 67-56-1 | |
| Fosfato monopotássico | Penta | 12290 | |
| Meio de montagem | Sigma-Aldrich | 345789-20ML | Reagente FluorSave |
| Meio de montagem | Vectashild | H-1300 | |
| Lente objetiva usada no microscópio confocal | Zeiss | Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Vidro de slide revestido de poli-lisina | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
| Cloreto de potássio | Lach-Ner | ||
| (1,5 mL) | Eppendorf | 0030 120.086 | Para tratar células e armazenar produtos químicos |
| Cloreto de sódio | Penta | 16610 | |
| Hidrogenofosfato de sódio | Penta | 15130 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |
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