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Artigo de método

Micro-TC e Análise Morfométrica de Cérebros Neonatais de Camundongos

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DOI:

10.3791/65180

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19 de maio de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve os passos para a obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos combinando microtomografia computadorizada (micro-TC) e um agente de contraste em amostras ex vivo . Descrevemos análises morfométricas básicas para quantificar o tamanho e a forma do cérebro nessas imagens.

Resumo

As neuroimagens são uma ferramenta valiosa para o estudo da morfologia cerebral em experimentos com modelos animais. A ressonância magnética (RM) tornou-se o método padrão para tecidos moles, embora sua baixa resolução espacial represente alguns limites para pequenos animais. Descrevemos um protocolo para obtenção de informações tridimensionais (3D) de alta resolução em crânios e cérebros de neonatos de camundongos por meio de microtomografia computadorizada (micro-TC). O protocolo inclui as etapas necessárias para dissecar as amostras, corar e escanear o cérebro e obter medidas morfométricas de todo o órgão e regiões de interesse (ROIs). A análise de imagens inclui a segmentação de estruturas e a digitalização de coordenadas de pontos. Em suma, este trabalho mostra que a combinação de micro-TC e solução de Lugol como meio de contraste é uma alternativa adequada para a obtenção de imagens do cérebro perinatal de pequenos animais. Esse fluxo de trabalho de imagem tem aplicações em biologia do desenvolvimento, biomedicina e outras ciências interessadas em avaliar o efeito de diversos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento cerebral.

Introdução

A microtomografia computadorizada (micro-TC) é uma ferramenta valiosa para diferentes campos de pesquisa. Em biologia, é especialmente adequado para pesquisa óssea por causa da absorção de raios-X em tecidos mineralizados. Devido a essa característica, diversas questões relacionadasao desenvolvimento ósseo1, metabolismo2, evolução3,4, entre outros tópicos, têm sido abordadas com o auxílio da micro-TC. Em 2008, de Crespigny et al.5 mostraram que imagens de micro-TC de cérebros adultos de camundongos e coelhos poderiam ser obtidas usando iodo como agente de contraste. Este trabalho abriu uma nova aplicação para esta técnica de imagem, uma vez que o iodo permitiu a aquisição de imagens de tecidos moles que, de outra forma, seriam insensíveis aos raios X. Assim, o objetivo geral da combinação de micro-TC e contraste iodado é obter imagens de alta resolução, nas quais os tecidos moles possam ser distinguidos e identificados em nível meso ou macroanatômico.

Esta técnica tem notável potencial para estudos que requerem caracterização fenotípica ex vivo detalhada de pequenos espécimes, como embriões de camundongos, que são amplamente utilizados em planejamentosexperimentais6. O contraste iodado em combinação com imagens de micro-TC tem sido usado para obter quantificações volumétricas de órgãos7 e estruturas tridimensionais (3D) de pontosde referência 8,9. Nos últimos anos, a microtomografia computadorizada de amostras coradas tem sido aplicada para descrever características fenotípicas cerebrais deroedores10, e diferentes aprimoramentos na técnica têm sido propostos. Para cérebros adultos, um protocolo de 48 h de imersão em iodo, com etapa prévia de perfusão com hidrogel, produziu imagens de altaqualidade11. Gignac et al.12 expandiram os limites dessa técnica ao mostrar que cérebros de ratos corados com iodo poderiam ser processados para realizar técnicas histológicas de rotina. Da mesma forma, esses procedimentos demonstram resultados promissores para cérebros embrionários e pré-desmamadosde roedores 8,13,14,15.

Embora a neurociência tenha aplicado amplamente técnicas baseadas em microscópios para avaliar diferentes aspectos estruturais e funcionais do desenvolvimento cerebral, tais estudos são mais adequados para caracterizar populações celulares específicas ou estruturas espacialmente limitadas. Por outro lado, a micro-TC permite a descrição de estruturas inteiras e a aquisição de modelos 3D que preservam informações espaciais relevantes, o que é complementar às técnicas microscópicas. A ressonância magnética (RM) também é uma técnica padrão aplicada para explorar as características estruturais de pequenos animais16,17,18. Entretanto, a micro-TC, com o uso de contraste, apresenta duas vantagens principais para as amostras fixas ex vivo: os microtomógrafos são em grande parte menos dispendiosos e de fácil operação, além de permitirem maior resolução espacial que aRM12.

O objetivo deste trabalho é descrever o procedimento de obtenção de imagens de alta resolução de encéfalos de camundongos neonatais, utilizando microtomografia computadorizada após coloração com solução de Lugol, um meio de contraste iodado. Um protocolo abrangente é apresentado, que começa com etapas preliminares, como coleta de amostras e fixação dos tecidos, e passa pela coloração, aquisição de imagens de micro-TC e processamento padrão. O processamento de imagens inclui a segmentação de um volume 3D da cabeça completa, bem como do cérebro, e a seleção de planos anatômicos específicos para digitalizar coordenadas pontuais que poderiam ser usadas em análises morfométricas. Embora o foco aqui seja o cérebro de camundongos neonatais, estratégias semelhantes podem ser aplicadas a outros tecidos moles. Assim, o protocolo aqui apresentado é flexível o suficiente para ser aplicado, com modificações sutis, a outros tipos de amostras.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

1. Coleta e preparo das amostras

  1. Preparar 500 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
    1. Sob um fluxo de extração em um gabinete, adicione 20 g de pó de PFA a 250 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um copo de vidro de 1 L. Coloque o copo com um ímã sobre uma placa de agitação magnética.
    2. Mexa enquanto aquece. Com um termômetro, verifique constantemente a temperatura da solução para mantê-la abaixo de 60 °C.
    3. Com uma pipeta plástica de Pasteur, adicione gotas de NaOH 1 M à solução para dissolver o PFA. Uma vez dissolvido completamente o pó de PFA, arrefecer a solução à temperatura ambiente (RT).
    4. Ajustar o volume para 500 mL com 1x PBS. Ajuste o pH para 7,2-7,3 adicionando gotas de HCl 1 M com uma pipeta plástica Pasteur.
    5. Usando um filtro de papel e um funil de vidro, filtre a solução em um frasco de vidro de 1 L.
    6. Feche o frasco de vidro, retire-o do armário de fluxo e guarde no frigorífico a -4 °C.
  2. Coletar amostras cerebrais.
    1. Para a obtenção das amostras, sacrificar os recém-nascidos na manhã seguinte ao nascimento, aos 0,5 dias de idade (P 0,5), utilizando tesoura cirúrgica para decapitá-los.
    2. Coloque a tesoura no pescoço do neonato enquanto segura o corpo, e realize um corte único e limpo.
  3. Fixar as amostras em PFA.
    1. Preencher um tubo cônico de 50 mL com 40 mL de AGP a 4%.
    2. Imergir cada cabeça no tubo contendo PFA como agente de fixação. Para esta ação, use uma espátula Paton ou uma colher.
    3. Conservar os tubos cónicos no frigorífico a -4 °C durante 48 h e, em seguida, mudar para 40 ml de PBS 1x com azida sódica a 0,1% como conservante. Manter refrigerado a -4 °C.

2. Coloração da amostra

  1. Preparar a solução de Lugol (3,75% p/v).
    1. Sob um fluxo de extração em um gabinete, em um copo de vidro de 1 L, dissolver 10 g de Kl e 5 g de I2 em 400 mL de água destilada, com mistura constante usando um agitador magnético.
  2. Imergir cada cabeça num tubo cónico de 50 ml contendo 40 ml de solução de Lugol.
    1. Para neonatos com um tamanho corporal aproximado de 1,3 g, deixar as amostras imersas por 15-20 h com mistura constante usando um agitador orbital.
    2. Colocar as amostras num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de agarose a 1% durante 30 minutos antes da digitalização.

3. Micro-TC

NOTA: A microtomografia requer equipamento específico. Existem diferentes opções para esse tipo de scanner, e os detalhes da aquisição dependem das características do equipamento utilizado. O laboratório do Dr. Hallgrímsson conta com algumas alternativas de microtomógrafos. Aqui, o protocolo é baseado no uso de um scanner de mesa básico, que está entre as máquinas de imagem de pequenos animais mais acessíveis usadas por laboratórios em todo o mundo. Se o objetivo da varredura for o crânio, pule as etapas na seção 2 do protocolo e prossiga para a seção 3. Depois de escanear o crânio, o processo de coloração e o escaneamento do cérebro poderiam ser realizados para obter imagens dos mesmos espécimes do cérebro e do crânio.

  1. Coloque a amostra no suporte de micro-CT.
    1. Colocar a amostra num tubo cónico de 50 ml. Corrija a amostra para evitar movimentos durante a sessão do scanner. Para este fim, algum material de poliuretano pode ser usado para preencher as partes vazias do tubo.
    2. Abra o equipamento e coloque o tubo com a amostra no suporte do micro-CT.
    3. Faça login no painel de controle do micro-CT e registre a amostra a ser digitalizada. Isso gerará automaticamente um número de amostra. Além do número, preencha o campo "Nome". Tanto o nome quanto o número da amostra devem ser registrados em outro lugar (por exemplo, em uma planilha) caso os dados brutos precisem ser recuperados novamente.
    4. Inicie o programa de digitalização. Insira o nome ou o número do exemplo e selecione um arquivo Control , que deve conter os parâmetros de varredura.
  2. Digitalize a amostra.
    1. Na tela do software micro-CT, defina os seguintes parâmetros: tamanho isotrópico do voxel de 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, tempo de integração de 800.000 ms e 500 projeções por 180°.
    2. Defina a região de varredura selecionando Scout View. Quando a imagem de referência for exibida, pressione Linha de referência para definir a região. Mova a linha verde sólida para a borda da amostra e mantenha pressionada a tecla Shift enquanto arrasta o cursor para estender a região de varredura até a outra borda da amostra.
    3. Selecione OK para iniciar a verificação.
  3. Avalie e exporte a varredura.
    1. Abra o Programa de Avaliação do micro-tomógrafo e clique em Selecionar Amostra e Medição. No campo Filtro , digite o nome da amostra, selecione a amostra e selecione o arquivo de medição.
    2. O arquivo será carregado como fatias, cujo número depende da janela de varredura inicial. Clique no botão Carregar tudo , que carregará cada fatia e facilitará o movimento entre as fatias mais tarde.
    3. Selecione Tarefas > Avaliação 3D para inicializar uma caixa de recorte ao redor das fatias. Um prompt de Avaliação 3D aparecerá com vários campos, incluindo Tarefa/Avaliação, VOI (Volume de Interesse), Início X, Y, Z e Dimensão X, Y, Z.
    4. Defina o campo Task > Evaluation 3D para o script apropriado, pois uma variedade de tarefas de avaliação pode ser executada, como reconstrução, segmentação, morfometria (por exemplo, densidade mineral óssea) e conversões ou transferências de arquivos. O script de Avaliação Padrão pode ser usado como um guia.
    5. Depois de selecionar o script, ajuste a caixa VOI na imagem principal. Comece na primeira fatia. Certifique-se de que a caixa contém a anatomia a ser avaliada. Mova o VOI clicando com o botão direito do mouse em um dos pequenos quadrados brancos em direção à borda da caixa e redimensionando o VOI usando o botão do meio do mouse. Como alternativa, ajuste os campos Dimensão numericamente.
    6. Passe pela amostra usando a barra de rolagem abaixo da imagem para garantir que todas as anatomias tenham sido capturadas na caixa VOI. Clique em XY, XZ ou YZ no canto superior esquerdo do software para alterar a orientação.
    7. Selecione Iniciar avaliação. Dependendo do script de Avaliação de Tarefas, isso gerará um arquivo de imagem .aim 3D com um arquivo de cabeçalho .txt correspondente. Além disso, um caminho pode ser especificado no script para FTP (File Transfer Protocol) a imagem para um local específico.

4. Processamento de imagens

  1. Abra as imagens no software de processamento de imagens.
    NOTA: O processamento de imagens pode ser realizado usando vários softwares. Este protocolo inclui as etapas básicas de um software comercial, que é amplamente aceito na área e possui ferramentas versáteis para processamento básico e avançado. Além disso, existem diferentes formatos aceitáveis para imagens de micro-TC reconstruídas. Esse aspecto geralmente depende do equipamento utilizado para aquisição e de seu software. Aqui, o processamento de imagens é realizado com .bmp imagens. O mesmo procedimento pode ser aplicado para imagens .tiff e outros tipos. Como a aquisição é realizada em um scanner com .aim como formato padrão, uma conversão de .aim para .bmp é apresentada pela primeira vez.
    1. Para abrir arquivos .aim, selecione Arquivo > Abrir Dados e escolha o arquivo. Depois disso, uma janela com o título Seleção de Formato de Arquivo será aberta. Selecione Dados brutos.
    2. Uma janela com o título Parâmetros de dados brutos será aberta. Nesta janela, preencha os parâmetros seguindo as informações no cabeçalho .txt arquivo que é gerado para cada arquivo .aim. Para Tipo de Dados, escolha 16 bits para cabeçalho completo com o número depois que os dados da imagem começarem no deslocamento de bytes. Além disso, defina as dimensões e o tamanho do voxel usando as informações no cabeçalho .txt arquivo. Quando os parâmetros estiverem concluídos, pressione OK.
    3. Se a conversão de .aim para .bmp for necessária, no Painel Principal > na Visualização do Projeto, clique com o botão direito do mouse no objeto .aim e selecione a opção Converter > Converter Tipo de Imagem. Em Propriedades, selecione 8 bits como Tipo de Saída. Selecione Aplicar.
    4. Clique com o botão direito do mouse no novo objeto de 8 bits. Selecione Salvar como. Escolha .bmp e salve.
    5. Para abrir o arquivo .bmp, selecione Arquivo > Abrir Dados e escolha o arquivo. Depois disso, uma janela com os parâmetros da imagem é aberta. Confirme os parâmetros e aceite se estiver correto.
    6. No Painel Principal > Modo de Exibição de Projeto, um novo objeto é criado com o nome dos arquivos .bmp. Clique com o botão direito do mouse neste objeto e selecione a opção Ortho Slice. Em Propriedades, selecione o número da fatia e o plano de orientação a serem vistos.
  2. Obtenha volumes 3D da cabeça completa.
    1. No Painel Principal > Modo de Exibição de Projeto, clique com o botão direito do mouse no objeto de imagem. Selecione a opção Limiar interativo > Criar. Em Propriedades, altere os valores de RGB mínimo e RGB máximo até que a parte da imagem correspondente à cabeça do animal seja selecionada. Selecione Aplicar.
    2. No Painel Principal > Modo de Exibição de Projeto, um objeto com limite é criado. Clique com o botão direito do mouse neste objeto e, em Propriedades, selecione Isosurface. Em Propriedades, escolha um limite para visualizar a superfície e clique em Aplicar. Esse limiar precisa ser escolhido empiricamente, então diferentes valores podem precisar ser examinados.
  3. Digitalizando coordenadas de ponto
    1. As coordenadas de pontos 3D podem ser digitalizadas com base em fatias ou superfícies extraídas. Para a primeira opção, clique com o botão direito do mouse na opção de imagem e selecione Fatia. Em Traduzir, escolha a fatia desejada no plano axial. Se o plano não estiver posicionado corretamente, clique em Opções > Girar em Propriedades para estabelecer a orientação correta.
    2. Para digitalizar pontos de referência, clique com o botão direito do mouse no Painel Principal > Modo de Exibição de Projeto e selecione Criar Objeto > Pontos e Linhas > Pontos de Referência. Clique com o botão direito do mouse no novo Ponto de Referência do Objeto e selecione Modo de Exibição do Ponto de Referência. No Modo de Exibição de Ponto de Referência, modifique o tamanho do ponto em Tamanho. Para adicionar pontos de referência em Propriedades, use a opção Adicionar no Modo de Edição.
      NOTA: Para neonatos, um conjunto de pontos de referência e semipontos ao redor das curvas axiais e sagitais do cérebro foi previamente publicado14.
    3. Primeiro, escolha o plano axial que cruza o ponto mais rostral dos bulbos olfatórios e o ponto mais caudal do córtex.
    4. Selecione os Pontos de referência do objeto e, em Propriedades, selecione Editor de ponto de referência. Usando a seta, clique no local em que o ponto será digitalizado.
    5. No conjunto de pontos propostos, 24 pontos são digitalizados no plano axial selecionado. Digitalize o primeiro no ponto mais caudal do cérebro, na linha média.
    6. Digitalize cinco pontos igualmente distribuídos ao redor da curva (semimarcos) até o próximo marco na intersecção entre o mesencéfalo e o córtex.
    7. Em seguida, digitalize oito pontos (semipontos de referência) ao redor do córtex.
    8. Digitalize um novo marco na intersecção entre o córtex e os bulbos olfativos. Em seguida, digitalize quatro pontos (semipontos de referência) ao redor dos bulbos olfativos.
    9. Digitalize um novo marco no ponto mais rostral dos bulbos olfativos na linha média. Em seguida, digitalize dois pontos (semipontos de referência) entre os dois bulbos olfativos.
    10. Digitalize um novo marco no ponto mais caudal dos bulbos olfativos na linha média.
    11. Para pontos sagitais, estabeleça um corte no lado direito do cérebro em um plano parassagital onde o cérebro é mais proeminente caudalmente.
    12. No conjunto de pontos propostos, 33 pontos são digitalizados no plano parassagital selecionado. Digitalize o primeiro na intersecção entre o diencéfalo e o rombencéfalo. Em seguida, digitalize nove pontos (semipontos) no limite ventral do cérebro.
    13. Digitalize um novo marco no ponto mais rostral do bulbo olfativo. Em seguida, digitalize três pontos (semipontos de referência) ao redor dos bulbos olfativos.
    14. Digitalize um novo marco na intersecção entre o bulbo olfativo e o córtex. Em seguida, digitalize três pontos (semipontos de referência) ao redor dos bulbos olfativos.
    15. Digitalize um novo marco na intersecção entre o bulbo olfativo e o córtex. Em seguida, digitalize sete pontos (semipontos de referência) ao redor do córtex.
    16. Digitalize um novo marco na intersecção entre o córtex e o mesencéfalo. Em seguida, digitalize sete pontos (semipontos de referência) ao redor do córtex.
    17. Digitalize um novo marco na intersecção entre o córtex e o mesencéfalo. Em seguida, digitalize seis pontos (semipontos de referência) ao redor do mesencéfalo.
    18. Digitalizar um novo marco na intersecção entre o mesencéfalo e o cerebelo. Em seguida, digitalize dois pontos (semimarcos) ao redor do cerebelo.
    19. Digitalizar um novo marco na intersecção entre o cerebelo e o rombencéfalo.
    20. Salve os pontos digitalizados. Clique com o botão direito do mouse em Pontos de referência do objeto e escolha a opção Salvar dados.
  4. Analise as coordenadas dos pontos.
    NOTA: Uma vez que as coordenadas dos pontos são digitalizadas para um conjunto de espécimes, análises básicas podem ser realizadas usando ferramentas de morfometria geométrica para obter variáveis de tamanho (tamanho do centroide) e forma (coordenadas de forma ou Procrustes). As análises são realizadas em um ambiente de software livre e aberto, especialmente adequado para análises estatísticas.
    1. Usando um bloco de notas, construa um arquivo contendo as coordenadas de todos os espécimes digitalizados. Para isso, siga o formato TPS, conforme descrito em https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
    2. Abra o software estatístico. Selecione Arquivo > Alterar Diretório para escolher o diretório onde o arquivo .tps é salvo.
    3. Selecione Pacotes > Instalar pacotes. Escolha um espelho de guindaste. Procure geomorph e instale-o.
    4. Carregue pacotes digitando no console: library(geomorph) e library(Morpho).
    5. Carregue o conjunto de dados digitando no console: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
    6. Execute a análise generalizada do Procrustes digitando no console: GPA<- gpagen(dataset).
    7. Obtenha o tamanho do centroide digitando no console: CS<-GPA$Csize.
    8. Obtenha coordenadas Procrustes digitando no console: ProcCoord<- GPA$coords.
    9. Plote as coordenadas Procrustes e a forma média digitando no console: plotAllSpecimens(ProcCoord).
  5. Segmentação de ROIs
    NOTA: Para segmentar o cérebro e obter uma reconstrução 3D, identifique manualmente os tecidos cerebrais em cada fatia. O mesmo procedimento pode ser aplicado a ROIs específicas, como os bulbos olfativos, córtex, etc.
    1. Clique com o botão direito do mouse no Painel Principal > na Exibição de Projeto e selecione Criar Objeto > Campo de Rótulo.
    2. Selecionando o objeto Label Field , pressione a opção Editor de segmentação em Properties.
    3. Em Materiais, adicione um novo material e, se desejar, renomeie-o como Cérebro.
    4. Em Seleção, escolha a opção Fatia atual para segmentar o tecido correspondente ao cérebro em cada fatia.
    5. Usando as opções presentes em Ferramentas, selecione o tecido cerebral em cada fatia. Para este caso, a Varinha Mágica e o Pincel são os mais indicados.
    6. Depois que a seleção for feita em cada fatia, pressione Adicionar na seleção.
    7. Quando a seleção em todas as fatias estiver concluída, retorne ao Modo de Exibição do Projeto no Painel Principal e clique com o botão direito do mouse em Campo de Rótulo para selecionar Gerar Superfície e clique em Aplicar.
    8. Uma vez obtida a superfície, exporte-a aplicando Extract Surface.
    9. Para obter o volume das estruturas segmentadas, no Painel Principal > Modo de Exibição de Projeto, selecione o objeto que contém o rótulo, clique com o botão direito do mouse e selecione Medir e Analisar > Fração de Volume. Em seguida, clique em Aplicar.

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Resultados

Aqui, um protocolo básico para obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos é apresentado. As cabeças foram escaneadas após imersão na solução de Lugol. Apesar de seu pequeno tamanho, as principais estruturas anatômicas cerebrais, como bulbos olfatórios, córtex, mesencéfalo, cerebelo e rombencéfalo, podem ser distinguidas (Figura 1).

Diferentes análises podem ser realizadas usando essas imagens como entradas. Um conjunto de pontos de ...

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Discussão

Neste trabalho, um protocolo conciso para varredura de tecidos cerebrais neonatais de camundongos usando micro-CT com um agente de contraste é apresentado. Além disso, inclui procedimentos simples para obter resultados quantitativos e qualitativos. Com base nesses métodos, outras análises alternativas ou complementares podem ser realizadas.

Como mostrado no protocolo, as imagens de micro-TC podem ser analisadas de diferentes maneiras. Em estudos anteriores, nosso grupo estimou a variação de ta...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Wei Liu por sua assistência técnica. Este trabalho é financiado por ANPCyT PICT 2017-2497 e PICT 2018-4113.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
  µ CT 35Scanco Medical AGNote que a Scanco não oferece o    µ CT 35 mais. Seu menor scanner agora é o  µ CT 45
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MiceBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Tubos cônicosDaiggerCH-CI4610-1856
Gabinete de fluxoEscoAC2-458 
Copo de vidro GlasscoGL-229.202.10
Garrafa de vidroSimaxCFB017
Funil de vidroHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Manipular sob um armário de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas)
I2Cicarelli804211Ao preparar I2KI, manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas)
KICicarelliPA131542.1210Ao preparar I2KI, manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas)
Agitação magnéticaArcano4925
NaOHCicarelli1580110Manipule sob um gabinete de fluxo e use equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas)
Agitador orbitalBiomintBM021
Paraformaldeído Biopack2000959400Manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamentos de proteção individual (máscara, vidro e luvas)
Espátula PatonGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Pipeta de plástico PasteurDaigger9153
RR ProjectO pacote geomorph para R foi usado no protocolo (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors Belmed
Azida de SódioBiopack2000163500
TermômetroDaigger7650

Referências

  1. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  2. Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660(2021).
  3. Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
  4. Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
  5. de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  6. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  7. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  8. Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227(2016).
  9. Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
  10. Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
  11. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  12. Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
  13. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  14. Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
  15. Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184(2022).
  16. Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
  17. Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615(2018).
  18. Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
  19. Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  21. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  22. Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781(2021).

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