Este estudo descreve os passos para a obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos combinando microtomografia computadorizada (micro-TC) e um agente de contraste em amostras ex vivo . Descrevemos análises morfométricas básicas para quantificar o tamanho e a forma do cérebro nessas imagens.
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Artigo de método
Micro-TC e Análise Morfométrica de Cérebros Neonatais de Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As neuroimagens são uma ferramenta valiosa para o estudo da morfologia cerebral em experimentos com modelos animais. A ressonância magnética (RM) tornou-se o método padrão para tecidos moles, embora sua baixa resolução espacial represente alguns limites para pequenos animais. Descrevemos um protocolo para obtenção de informações tridimensionais (3D) de alta resolução em crânios e cérebros de neonatos de camundongos por meio de microtomografia computadorizada (micro-TC). O protocolo inclui as etapas necessárias para dissecar as amostras, corar e escanear o cérebro e obter medidas morfométricas de todo o órgão e regiões de interesse (ROIs). A análise de imagens inclui a segmentação de estruturas e a digitalização de coordenadas de pontos. Em suma, este trabalho mostra que a combinação de micro-TC e solução de Lugol como meio de contraste é uma alternativa adequada para a obtenção de imagens do cérebro perinatal de pequenos animais. Esse fluxo de trabalho de imagem tem aplicações em biologia do desenvolvimento, biomedicina e outras ciências interessadas em avaliar o efeito de diversos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento cerebral.
Introdução
A microtomografia computadorizada (micro-TC) é uma ferramenta valiosa para diferentes campos de pesquisa. Em biologia, é especialmente adequado para pesquisa óssea por causa da absorção de raios-X em tecidos mineralizados. Devido a essa característica, diversas questões relacionadasao desenvolvimento ósseo1, metabolismo2, evolução3,4, entre outros tópicos, têm sido abordadas com o auxílio da micro-TC. Em 2008, de Crespigny et al.5 mostraram que imagens de micro-TC de cérebros adultos de camundongos e coelhos poderiam ....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.
1. Coleta e preparo das amostras
- Preparar 500 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
- Sob um fluxo de extração em um gabinete, adicione 20 g de pó de PFA a 250 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um copo de vidro de 1 L. Coloque o copo com um ímã sobre uma placa de agitação magnética.
- Mexa enquanto aquece. Com um termômetro, verifique constantemente a temperatura da solução para mantê-la abaixo de 60 °C.
- Com uma pipeta plástica de Pasteur, adicione gotas de NaOH 1 M à solução para ....
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Resultados
Aqui, um protocolo básico para obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos é apresentado. As cabeças foram escaneadas após imersão na solução de Lugol. Apesar de seu pequeno tamanho, as principais estruturas anatômicas cerebrais, como bulbos olfatórios, córtex, mesencéfalo, cerebelo e rombencéfalo, podem ser distinguidas (Figura 1).
Diferentes análises podem ser realizadas usando essas imagens como entradas. Um conjunto de pontos de .......
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Discussão
Neste trabalho, um protocolo conciso para varredura de tecidos cerebrais neonatais de camundongos usando micro-CT com um agente de contraste é apresentado. Além disso, inclui procedimentos simples para obter resultados quantitativos e qualitativos. Com base nesses métodos, outras análises alternativas ou complementares podem ser realizadas.
Como mostrado no protocolo, as imagens de micro-TC podem ser analisadas de diferentes maneiras. Em estudos anteriores, nosso grupo estimou a variação de ta.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Wei Liu por sua assistência técnica. Este trabalho é financiado por ANPCyT PICT 2017-2497 e PICT 2018-4113.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| µ CT 35 | Scanco Medical AG | Note que a Scanco não oferece o µ CT 35 mais. Seu menor scanner agora é o µ CT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Tubos cônicos | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Gabinete de fluxo | Esco | AC2-458 | |
| Copo de vidro | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Garrafa de vidro | Simax | CFB017 | |
| Funil de vidro | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipular sob um armário de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | Ao preparar I2KI, manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | Ao preparar I2KI, manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas) |
| Agitação magnética | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipule sob um gabinete de fluxo e use equipamento de proteção individual (máscara, vidro e luvas) |
| Agitador orbital | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldeído | Biopack | 2000959400 | Manipular sob um gabinete de fluxo e usar equipamentos de proteção individual (máscara, vidro e luvas) |
| Espátula Paton | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Pipeta de plástico Pasteur | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | O pacote geomorph para R foi usado no protocolo (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Azida de Sódio | Biopack | 2000163500 | |
| Termômetro | Daigger | 7650 |
Referências
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
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Reimpressões e permissões
