O presente estudo fornece um protocolo modificado para isolar macrófagos sinoviais e fibroblastos do tecido da artrite inflamatória murina.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina
Neste artigo
Resumo
Resumo
A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à inflamação crônica das articulações. Macrófagos sinoviais e fibroblastos sinoviais têm papel central na patogênese da artrite reumatoide. É importante compreender as funções de ambas as populações celulares para revelar os mecanismos subjacentes à progressão patológica e remissão na artrite inflamatória. Em geral, as condições experimentais in vitro devem mimetizar ao máximo o ambiente in vivo . Células derivadas de tecidos primários têm sido utilizadas em experimentos caracterizando fibroblastos sinoviais em artrite. Em contraste, em experimentos investigando as funções biológicas de macrófagos em artrite inflamatória, linhagens celulares, macrófagos derivados da medula óssea e macrófagos derivados de monócitos sanguíneos têm sido usados. No entanto, não está claro se tais macrófagos realmente refletem as funções dos macrófagos residentes no tecido. Para a obtenção de macrófagos residentes, protocolos prévios foram modificados para isolar e expandir macrófagos primários e fibroblastos do tecido sinovial em um modelo de artrite inflamatória em camundongos. Essas células sinoviais primárias podem ser úteis para a análise in vitro da artrite inflamatória.
Introdução
A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por hiperplasia da sinóvia, levando à destruiçãoarticular1,2. Macrófagos e fibroblastos residentes no tecido estão presentes na sinóvia saudável para manter a homeostase articular. Em pacientes com AR, fibroblastos sinoviais (FSs) proliferam e células imunes, incluindo monócitos, infiltram-se na sinóvia e no fluido articular, processos associados à inflamação 1,3,4. Macrófagos sinoviais (SMs), que incluem macrófagos residentes e macrófagos derivados de mon....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Ehime e foram realizados de acordo com as Diretrizes da Universidade de Ehime para Experimentos com Animais (37A1-1*16).
1. Preparação de instrumentos, reagentes e meio de cultura
- Preparar o meio de cultura da seguinte forma: suplementar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótico-antimicótica (anti-anti).
- Preparar o meio de digestão da seguinte forma: complementar o meio de cultura com 1 mg/mL de colagenase tipo IV. Ajuste a concentraçã....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Camundongos C57BL/6 fêmeas com 7-8 semanas de idade foram submetidos à artrite induzida por anticorpos de colágeno. Células semelhantes a macrófagos e fibroblastos foram isoladas independentemente do tecido inflamatório da artrite, de acordo com o procedimento descrito acima (Figura 2A,B). Células semelhantes a macrófagos foram utilizadas imediatamente após o passo 5.7. Células semelhantes a fibroblastos foram inicialmente cultivadas para serem subconfluentes após o passo 4........
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este método aqui desenvolvido aprimora técnicas anteriores para isolar tanto as FS de artrite murina quanto os macrófagos residentes de vários órgãos7,11. O método modificado pode isolar macrófagos e fibroblastos da sinóvia inflamatória com alta pureza, sendo simples e reprodutível. Como o método não requer instrumentos complexos, como um classificador de células, qualquer pessoa pode conduzi-lo. Além disso, a presente técnica evita preocupações associadas a outr.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem à equipe da Divisão de Apoio à Pesquisa Médica, do Centro de Apoio à Pesquisa Avançada (ADRES) e aos membros da Divisão de Fisiopatologia Integrativa, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, por sua assistência técnica e apoio útil. Este estudo foi apoiado em parte pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI concede JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (para NS) e JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (para YI); subsídios da Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5.0 g/L Tripsina/5.3 mmol/L solução EDTA | nacalai tesque | 35556-44 | Diluído com |
| Antibiótico HBSS– antimicótico (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Agulha borboleta | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µ m poro, Nylon |
| Cellmatrix Tipo I-C | Nitta gelatina | 637-00773 | Tipo I-C |
| colágeno Tubo Centriguge 15 | TPP | 91014 | Tubo de 15 mL |
| Tubo Centriguge 50 | TPP | 91050 | Tubo de 50 mL |
| Colagenase de C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Tipo IV colagenase |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | SIGAM | 173012 | A inativação do calor foi realizada |
| Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Placa de cultura de tecidos 40 | TPP | 93040 | Para cultura de células |
| Placa de cultura de tecidos 60 | TPP | 92006 | Para pinças de cultura de células |
| KFI | 1-9749-31 | Pinças de ponta fina | |
| Bio Research Center | PRI28-1522 | Ponta serrilhada | |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Estereomicroscópio |
Referências
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
