Isolamento e Cultura de Macrófagos e Fibroblastos Sinoviais Primários de Tecido de Artrite Murina

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por hiperplasia da sinóvia, levando à destruição^articular1,2. Macrófagos e fibroblastos residentes no tecido estão presentes na sinóvia saudável para manter a homeostase articular. Em pacientes com AR, fibroblastos sinoviais (FSs) proliferam e células imunes, incluindo monócitos, infiltram-se na sinóvia e no fluido articular, processos associados à inflamação ^1,3,4. Macrófagos sinoviais (SMs), que incluem macrófagos residentes e macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, e SFs são aberrantemente ativados e têm papéis importantes na patogênese da AR. Estudos recentes têm sugerido que as interações célula-célula entre SMs e SFs contribuem tanto para a exacerbação quanto para a remissão da AR ^5,6.

Para entender a patogênese da AR, vários modelos de artrite inflamatória em roedores têm sido usados, incluindo artrite de transferência sérica de K/BxN, artrite induzida por colágeno e artrite induzida por anticorpos de colágeno. Ensaios baseados em células são geralmente necessários para esclarecer as funções moleculares na artrite. Portanto, células primárias de modelos animais de artrite foram isoladas. O método para isolar as FS do tecido da artrite murina está bem estabelecido, e essas células têm contribuído para a elucidação de mecanismos moleculares na patogênese da artrite7,8. Por outro lado, macrófagos derivados da medula óssea, macrófagos derivados de monócitos sanguíneos e linhagens celulares de macrófagos têm sido frequentemente utilizados como recursos de macrófagos para estudos de^artrite9,10. Uma vez que os macrófagos podem adquirir funções associadas ao seu microambiente, fontes gerais de macrófagos podem carecer de respostas específicas ao tecido da artrite. Além disso, é difícil obter células sinoviais suficientes por triagem, pois a sinóvia murina é um tecido muito pequeno, mesmo em modelos de artrite. A falta de uso de macrófagos sinoviais para estudos in vitro tem sido uma limitação em estudos de artrite. O estabelecimento de um protocolo para isolar e expandir macrófagos sinoviais seria uma vantagem para a elucidação dos mecanismos patológicos na AR.

No método anterior de isolamento das FS, os SMs eram descartados⁷. Além disso, foi relatado um método para isolar e expandir macrófagos residentes de alguns órgãos¹¹. Portanto, os protocolos existentes foram modificados em combinação. A modificação visa atingir o cultivo primário de SMs e SFs com alta pureza. O objetivo geral deste método é isolar e expandir tanto SMs e SFs do tecido da artrite murina.

Experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Ehime e foram realizados de acordo com as Diretrizes da Universidade de Ehime para Experimentos com Animais (37A1-1*16).

1. Preparação de instrumentos, reagentes e meio de cultura

1. Preparar o meio de cultura da seguinte forma: suplementar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótico-antimicótica (anti-anti).
2. Preparar o meio de digestão da seguinte forma: complementar o meio de cultura com 1 mg/mL de colagenase tipo IV. Ajuste a concentração de colagenase imediatamente antes de usar.
3. Diluir o colágeno tipo I-C até uma concentração de 0,15 mg/mL com solução de HCl 1 mM. Placas de cultura de inundação (diâmetro de 40 ou 60 mm) com a solução de colágeno diluída. Após 6-12 h à temperatura ambiente, retire a solução de colágeno das placas e seque à temperatura ambiente. Os pratos revestidos com colágeno podem ser mantidos em temperatura ambiente por pelo menos 1 semana. Lave as placas pré-revestidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio antes de usar.
4. Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis, como tesouras, pinças com pontas serrilhadas e pinças de ponta fina. Mergulhe em etanol 70% antes do uso.

2. Preparo do tecido de sinovite em camundongos ( Figura 1A)

1. Prepare um rato com artrite inflamatória nas patas traseiras.
   NOTA: Camundongos fêmeas C57BL/6 (18-20 g), 7-8 semanas pós-natal, com artrite induzida por anticorpos colágeno (CAIA) ou artrite de transferência sérica (STA) K/BxN foram utilizados para este protocolo⁸. Isolar SMs de tecido não inchado (ou seja, saudável) pode ser difícil, pois o número de células é insuficiente.
2. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de quetamina e 16 mg/kg de xilazina. Limpe os ratos com etanol 70%.
3. Abra a região peitoral com uma tesoura para expor o coração. Cortar a aurícula direita do coração com uma tesoura e, em seguida, enfiar uma agulha borboleta de 23 G no ventrículo esquerdo através do ápice do coração, seguido por um refluxo de 15-20 mL de PBS estéril usando uma seringa para remover manualmente o sangue periférico (aproximadamente 1 mL/2 s).
4. Decore as patas traseiras cortando a pele com tesoura e puxando a pele com pinça com pontas serrilhadas.
   NOTA: Após esta etapa, recomenda-se o uso de pinças para o manuseio de amostras. Não toque no tecido decorticado com os dedos, para evitar a fixação de pelos murinos.
5. Deslocar as articulações metatarsofalangeanas puxando, seguido de cortar os ligamentos das articulações usando tesoura para remover os dedos.
6. Corte os tendões dos músculos da perna perto do tornozelo usando uma tesoura. Segure o tendão com uma pinça e descasque os músculos proximalmente na perna para expor a tíbia. Remova a fíbula.
7. Deslocar a articulação do joelho puxando, seguido de cortar os ligamentos das articulações usando tesoura para desprender a tíbia com a pata traseira inchada. Manter as amostras em meio de cultura gelado (0,3 mL/^cm2) até o processamento até o passo 3.1.

3. Digestão do tecido da sinovite ( Figura 1B)

1. Aspirar o meio de cultura, evitando a amostra, e adicionar meio de cultura fresco (0,3 mL/^cm2). Repita o processo de lavagem três ou quatro vezes.
   OBS: A partir desta etapa, o manuseio das amostras deve ser realizado de forma asséptica em bancada limpa ou armário de segurança.
2. Deslocar todas as juntas das amostras puxando-se com pinça de ponta fina no meio de cultura sob estereomicroscópio (aumento de 10x-20x). Pinças de ponto fino são convenientes nesta etapa. Remova a tíbia e o maior número possível de vasos, tendões e ligamentos. Tenha cuidado para não quebrar os ossos ao se deslocar.
3. Preparar dois tubos de 15 mL por amostra. Transferir os ossos luxados com tecidos moles para o primeiro tubo de 15 mL com pinça. Adicionar 4 mL de meio de digestão por amostra, obtida de ambas as patas traseiras, no tubo.
4. Para coletar células residuais e fragmentos de tecido, transferir o meio em que a amostra foi contida para o segundo tubo de 15 mL. Centrifugar o meio a 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender o pellet com 1 mL de meio de digestão e transferir a solução de fragmento celular e tecido para o primeiro tubo de 15 mL contendo quase todo o tecido (total de 5 mL de meio de digestão/patas traseiras).
5. Digerir a amostra durante 60-120 min a 37 °C com agitação num forno de hibridização.
   NOTA: O momento ideal para digerir as amostras deve ser decidido. O tempo depende do grau de inchaço nos tornozelos e colagenases. Na maioria dos casos, 60-120 min é suficiente. Após 60 min de incubação, coletar uma parte da amostra digerida por pipetagem e observar ao microscópio. Se a digestão for insuficiente, a incubação deve continuar, e a digestão verificada a cada 30 min.
6. Pipetar bem a solução. Filtrar a solução celular através de um filtro celular (poro de 40 μm) para um tubo de 50 ml.
7. Adicionar 10 mL de meio de cultura ao tubo de 50 mL através do filtro celular. Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Após a retirada do sobrenadante, ressuspender com 10 mL de meio de cultura. Repita a centrifugação. Após a retirada do sobrenadante, ressuspender com 2 mL de meio de cultura.

Figura 1: Procedimento de amostragem do tecido da artrite murina e digestão da colagenase . (A) (i) Pata traseira murina com artrite inflamatória. (ii) Remoção da pele da pata traseira. (iii) Luxação das articulações metatarsofalangeanas e remoção dos pododáctilos. (iv) Corte dos tendões do tornozelo. (v) Remoção dos músculos da parte inferior das pernas. (vi) Luxação da articulação do joelho. (B) esquerda; pernas excisadas em meio de cultura. Direita; luxação do tarso e metatarso em meio de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Isolamento dos fibroblastos sinoviais ( Figura 2A)

1. Seme todas as suspensões celulares obtidas de ambos os tornozelos na placa revestida com colágeno.
   NOTA: Se usar tornozelos com inchaço fraco ou moderado para obter as células, uma placa de 40 mm de diâmetro é aplicada. O tamanho da placa revestida de colágeno pode ser alterado para uma placa de 60 mm de diâmetro se ambos os tornozelos tiverem inchaço grave.
2. Adicionar meio de cultura (aproximadamente 222 μL/^cm2). Incubar durante 1 h a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO_2.
3. Recolher células não aderentes utilizando uma pipeta (utilizar no passo 5.1). Lave o prato revestido de colágeno com meio de cultura e colete o meio. Cultivar as células aderentes em meio fresco (Figura 2B,i). A maioria das células que aderem rapidamente à placa revestida de colágeno exibe uma morfologia fibroblastóide (fusiforme).
4. Passagem de células subconfluentes por tratamento com tripsina 0,05% em solução salina balanceada de Hanks (HBSS). Nesse método, a contaminação de outras células é limitada, mesmo que na expansão inicial. Se forem necessárias células semelhantes a fibroblastos mais purificadas, realize a passagem repetida para permitir o aumento da pureza; entretanto, observa-se também a expansão do citoplasma das células em adesão (Figura 2B,ii). Como passagens excessivas afetam a perda de características ingênuas nas células, use células com menos de 5 passagens.

5. Isolamento de macrófagos sinoviais ( Figura 2A)

1. Semeando todas as células não aderentes do passo 4.4 em placas (diâmetro de 40 ou 60 mm) que não tenham sido revestidas com colágeno.
   NOTA: As células não aderentes incluem macrófagos, outros linfócitos e fibroblastos residuais do tecido da sinovite.
2. Cultivar as células a granel por 1 dia a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO₂.
3. Para remover linfócitos não aderentes, aspirar o meio de cultura e, em seguida, adicionar meio de cultura fresco. Repita esse processo duas ou três vezes (Figura 2B,iii).
4. Cultivar as células a granel aderentes por 1-2 semanas em meio de cultura, com trocas de meio a cada 2 dias, mantendo a confluência (Figura 2B,iv).
   NOTA: O número de SMs aumenta lentamente em condições de co-cultura com SFs. Assim, o período de co-cultura deve ser ajustado conforme necessário.
5. Lave com PBS ou HBSS duas vezes. Tratar com tripsina a 0,05% em HBSS (aproximadamente 55 μL/^cm2) durante 3 minutos a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO₂. Os fibroblastos se desprendem facilmente da placa de cultura pelo tratamento com tripsina, e os macrófagos exibem resistência ao tratamento com tripsina. Use esta propriedade para a seleção de macrófagos sinoviais.
6. Adicionar suavemente o meio de cultura (aproximadamente 222 μL/^cm2) a 0,05% de tripsina em HBSS. Após esta etapa, não despeje o meio diretamente sobre as células.
7. Para remover as células destacadas, aspirar o meio de cultura e, em seguida, adicionar o meio de cultura fresco suavemente. Repita esse processo duas ou três vezes. Manter as células remanescentes na placa em meio de cultura fresco até o uso (Figura 2B,v).
   NOTA: Após o tratamento com tripsina, as células aderentes exibem características morfológicas semelhantes a macrófagos.

Figura 2: Separação das frações ricas em macrófagos e fibroblastos do tecido inflamatório da artrite. (A) Esquema do procedimento para separar células ricas em macrófagos e fibroblastos do tecido da artrite. (B) Imagens representativas de contraste de fase das etapas do procedimento, (i) a (v) na Figura 2A. A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Camundongos C57BL/6 fêmeas com 7-8 semanas de idade foram submetidos à artrite induzida por anticorpos de colágeno. Células semelhantes a macrófagos e fibroblastos foram isoladas independentemente do tecido inflamatório da artrite, de acordo com o procedimento descrito acima (Figura 2A,B). Células semelhantes a macrófagos foram utilizadas imediatamente após o passo 5.7. Células semelhantes a fibroblastos foram inicialmente cultivadas para serem subconfluentes após o passo 4.4 e, em seguida, passadas para uma nova placa de cultura seguida de uso. Para avaliar se os SMs e SFs foram isolados com sucesso, os seguintes experimentos foram realizados.

Para avaliar a pureza das células isoladas, a expressão de RNAm de vários marcadores celulares foi analisada por RT-qPCR. Cd68, Emr1, Itgam e Csf1r foram usados como marcadores pan-macrófagos, e Cdh11, Col6a1, Csf1 e Vcam1 foram usados como marcadores SF. Rplp0 foi utilizado como gene de referência 6,8. Todos os genes marcadores foram normalizados pela expressão de Rplp0. Ambos os marcadores do tipo celular foram analisados nas células semelhantes a macrófagos, e as células semelhantes a fibroblastos foram obtidas do tecido da artrite. Marcadores de FS foram expressos em células semelhantes a fibroblastos e marcadores pan-macrófagos foram expressos em células semelhantes a macrófagos, sugerindo que frações ricas em macrófagos e fibroblastos foram isoladas do tecido da sinovite, respectivamente (Figura 3A,B).

Para estabelecer a pureza dos macrófagos, marcadores proteicos de superfície para macrófagos e outros tipos celulares foram analisados por citometria de fluxo. F4/80 e CD11b foram utilizados para marcadores de macrófagos, Ly6G para marcador de neutrófilos e CD3 para marcador de células T6. A estratégia de gating foi utilizada como mostrado anteriormente6. Mais de 90% das células expressaram CD45, CD11b e F4/80, enquanto a expressão de Ly6G e CD3 foi inferior a 1% (Figura 4).

Figura 3: Expressão de RNAm de marcadores específicos do tipo celular. (A) expressão de marcadores pan-macrófagos (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) em macrófagos sinoviais (SMs) e fibroblastos sinoviais (SFs) por RT-qPCR (n = 4). (B) Níveis de expressão dos marcadores SF (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) em SMs e SFs (n = 4). Os dados são apresentados como médias ± DP.** indica p < 0,01 por um teste t não pareado. Os dados foram obtidos a partir de quatro experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Expressão de proteínas de superfície celular específicas do tipo celular. Histogramas representativos obtidos em análises por citometria de fluxo de marcadores de superfície leucocitária (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) em macrófagos sinoviais (SMs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.