Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Karina Garcia; André Alves; Teresa M. Ribeiro-Rodrigues; Flávio Reis; Sofia Viana

doi:10.3791/65206

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

7.7K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/65206

⸱

2 de junho de 2023

Karina Garcia¹^,²^,³^,⁴ , André Alves¹^,²^,³ , Teresa M. Ribeiro-Rodrigues¹^,²^,³ , Flávio Reis¹^,²^,³ , Sofia Viana¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, ²Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, ³Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), ⁴Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.

Resumo

As gotículas lipídicas (DLs) são organelas especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e desempenham um papel muito importante na supressão da lipotoxicidade e na prevenção da disfunção causada pelos ácidos graxos livres (AGs). O fígado, dado seu papel crítico no metabolismo da gordura do corpo, é persistentemente ameaçado pelo acúmulo intracelular de DLs na forma de esteatose hepática microvesicular e macrovesicular. A caracterização histológica dos LDs é tipicamente baseada em corantes diazo lipossolúveis, como a coloração Oil Red O (ORO), mas uma série de desvantagens consistentemente dificulta o uso dessa análise com espécimes hepáticos. Mais recentemente, os fluoróforos lipofílicos 493/503 tornaram-se populares para visualizar e localizar DLs devido à sua rápida captação e acúmulo no núcleo de gotículas lipídicas neutras. Embora a maioria das aplicações seja bem descrita em culturas celulares, há menos evidências demonstrando o uso confiável de sondas de fluoróforo lipofílico como uma ferramenta de imagem de DL em amostras de tecido. Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em dipirrometeno de boro (BODIPY) 493/503 para a avaliação de DLs em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática induzida por dieta hiperlipídica (DHL). Este protocolo abrange preparo de amostras de fígado, secção tecidual, coloração BODIPY 493/503, aquisição de imagens e análise de dados. Demonstramos um aumento do número, intensidade, razão de área e diâmetro das DLs hepáticas após a alimentação com DH. Usando projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar o conteúdo total de lipídios neutros no núcleo LD, que apareceu como gotículas quase esféricas. Além disso, com o fluoróforo BODIPY 493/503, conseguimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermediárias (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovesículas (d > 9 μm), permitindo a discriminação bem sucedida da esteatose microvesicular e macrovesicular. Em geral, este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL hepática e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos.

Introdução

As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica ^1,2,3.

A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentraçõ....