Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

Summary

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Abstract

A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.

Introduction

A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante a^marcha1. Vários programas^cinemáticos e motores^{dos membros2,3,4}, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)^....

Protocol

Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e diminuir o sofrimento dos animais utilizados no estudo. O script MATLAB e a versão autônoma do software MW são de código aberto e estão disponíveis no GitHub
....

Results

O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM¹⁴. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função e se adapta a uma LM .......

Discussion

Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).

Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma coleção de parâmet.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
45º Espelho
2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 16 cm de altura, 1 de cada lado	Misumi
2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 de cada lado	Misumi
1 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 83 cm de comprimento	Misumi
87 x 23 cm espelho Fornecedor	geral de vidro
Enchimento de papelão preto		de artigos de papelaria em geral	Usamos 2, um com 69 x 6 cm e outro com 69 x 3cm para limitar o reflexo no espelho
Luz de fundo de fundo
109 x 23 cm plexiglass (0,9525 cm de espessura)	Fornecedor
2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm), 20 cm de comprimento, 1 de cada lado	Misumi
fita de LED multicolorida	Fornecedor
geral papel opaco branco para cobrir o plexyglass	Fornecedor
fTIR Base de suporte e postes
2 extrusão de alumínio (4 x 4 cm), 100 cm de altura	Misumi
60 x 30 cm placa de ensaio métrica	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm parafusos	Edmund Optics
Porcas sextavadas M6 e wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura)	Fornecedor		109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura)
109 cm de comprimento Base-U-channel alumínio com 1,6 cm de altura x 1,9 cm de profundidade dobras grossas (para segurar o plexyglass)	Fornecedor
2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm) 20 cm de comprimento, 1 de cada lado	Misumi
Enchimento de papelão preto		de papelaria geral	, usamos 2 enchimentos de cada lado para cobrir os limites do plexyglass, evitando bordas brilhantes
Parafusos M6 12 mm	Edmund Optics
Câmera de alta velocidade (em um tripé)
Blackfly S USB3	FLIR	#BFS-U3-32S4M-C	Esta é uma recomendação. O requisito é gravar pelo menos 100 quadros por segundo
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Sistemas e Instrumentação de Precisão, LLC.	#0400
Lente
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikon	#1929	Esta lente é recomendada, no entanto, outra lente pode ser usada. Certifique-se de que ele contenha uma grande abertura (ou seja, valores menores de F-stop), para capturar sinais fTIR
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5			do Projeto Spyder
Parede de passarela
2 grandes acrílicos rectagulares com 100 x 15 cm			conveniência de bricolagem
2 laterais de acrílico trapeziano com 6-10 de comprimento x 15 cm de altura			conveniência de bricolage
GitHub Materials
Nome da pasta	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script para criar Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Documentos adicionais
Mapa	de calor https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script para criar mapa de calor
Script Matlat	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		script MouseWalker matlab
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script para executar a análise de componentes principais
Gráficos de dados brutos	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script para criar gráficos de dados brutos
Análise Residual	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Código para calcular resíduos de dados brutos