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Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante amarcha1. Vários programascinemáticos e motoresdos membros2,3,4, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)6,7,8.

Para a deambulação, várias conexões espinhais dos membros torácicos e pélvicos precisam ser adequadamente conectadas e ativadas ritmicamente, o que requer inputs do cérebro e feedback do sistema somatossensorial 2,9,10. Essas conexões culminam nos geradores de padrão central (CPGs), que se situam em nível cervical e lombar para os membros torácicos e pélvicos, respectivamente 1,9,10. Muitas vezes, após a LM, a ruptura da conectividade neuronal e a formação de uma cicatriz glial inibitória12 limitam a recuperação da função locomotora, com desfechos que variam de paralisia total a função restrita de um grupo de membros, dependendo da gravidade da lesão. Ferramentas para quantificar com precisão a função locomotora após LM são fundamentais para monitorar a recuperação e avaliar os efeitos de tratamentos ou outras intervenções clínicas6.

O ensaio métrico padrão para modelos de contusão de camundongos com LM é a escala Basso de camundongos (BMS)13,14, um escore não paramétrico que considera a estabilidade do tronco, a posição da cauda, o passo plantar e a coordenação membros torácicos-membros posteriores em uma arena de campo aberto. Embora o SNF seja extremamente confiável para a maioria dos casos, ele requer pelo menos dois avaliadores experientes para observar todos os ângulos de movimento dos animais, a fim de explicar a variabilidade natural e reduzir o viés.

Outros ensaios também foram desenvolvidos para avaliar quantitativamente o desempenho motor após LMT. Estes incluem o teste de rotarod, que mede o tempo gasto em um cilindro giratório15; a escada horizontal, que mede o número de grades perdidas e pegas de escada positivas16,17; e o teste de marcha em viga, que mede o tempo que um animal leva e o número de falhas que ele comete ao atravessar uma viga estreita18. Apesar de refletir uma combinação de déficits motores, nenhum desses testes produz informações locomotoras diretas sobre a coordenação entre membros torácicos.

Para analisar de forma específica e mais aprofundada o comportamento de caminhar, outros ensaios foram desenvolvidos para reconstruir ciclos de passos e estratégias de gaiting. Um exemplo é o teste da pegada (pegada), em que as patas pintadas de um animal desenham um padrão sobre uma folha de papel branco19. Embora simples em sua execução, a extração de parâmetros cinemáticos como o comprimento da passada é complicada e imprecisa. Além disso, a falta de parâmetros dinâmicos, como a duração do ciclo do passo ou a coordenação temporizada com as pernas, limita suas aplicações; Na verdade, esses parâmetros dinâmicos só podem ser adquiridos analisando vídeos quadro a quadro de roedores caminhando por uma superfície transparente. Para os estudos de LM, pesquisadores analisaram o comportamento da marcha em vista lateral utilizando esteira, incluindo a reconstrução do ciclo do passo e a mensuração das variações angulares de cada articulação da perna 4,20,21. Embora essa abordagem possa ser extremamenteinformativa6, ela permanece focada em um conjunto específico de membros e carece de características adicionais da marcha, como coordenação.

Para preencher essas lacunas, Hamers e colaboradores desenvolveram um teste quantitativo baseado em um sensor de toque óptico usando reflexão interna total frustrada (fTIR)22. Neste método, a luz se propaga através do vidro através da reflexão interna, torna-se espalhada ao pressionar a pata e, finalmente, é capturada por uma câmera de alta velocidade. Mais recentemente, uma versão open-source desse método, denominada MouseWalker, foi disponibilizada, e essa abordagem combina uma passarela fTIR com um pacote de software de rastreamento e quantificação23. Usando esse método, o usuário pode extrair um grande conjunto de parâmetros quantitativos, incluindo padrões de passo, espacial e de marcha, posicionamento da pegada e coordenação membro anterior-membro posterior, bem como saídas visuais, como padrões de impressão (imitandoo ensaio 6 da pata com tinta) ou fases de apoio em relação ao eixo do corpo. É importante ressaltar que, devido à sua natureza de código aberto, novos parâmetros podem ser extraídos atualizando o pacote de script do MATLAB.

Aqui, o assembly publicado anteriormente do sistema MouseWalker23 é atualizado. Uma descrição de como configurá-lo é fornecida, com todas as etapas necessárias para obter a melhor qualidade de vídeo, condições de rastreamento e aquisição de parâmetros. Ferramentas adicionais de pós-quantificação também são compartilhadas para aprimorar a análise do conjunto de dados de saída do MouseWalker (MW). Finalmente, a utilidade dessa ferramenta é demonstrada pela obtenção de valores quantificáveis para o desempenho locomotor geral, especificamente ciclos de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, em um contexto de lesão medular (LM).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e diminuir o sofrimento dos animais utilizados no estudo. O script MATLAB e a versão autônoma do software MW são de código aberto e estão disponíveis no GitHub
repositório (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Embora o software MW tenha sido desenvolvido no MATLAB R2012b, ele foi adaptado para rodar no MATLAB R2022b. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho de análise do MW.

1. Configuração do aparelho MouseWalker (MW)

  1. Montar o aparelho de MW conforme descrito anteriormente23, ou adaptar-se às necessidades específicas do planejamento experimental (ver Tabela de Materiais e Figura Suplementar 1 para mais detalhes sobre o setup).
    OBS: A arena de caminhada pode ser ampliada para acomodar animais maiores, como ratos.
  2. Verifique se o plexiglass onde os animais caminham está limpo e livre de riscos. Use um pano de limpeza liso e minimize o uso de solventes orgânicos, como amônia ou etanol, em altas concentrações, que podem danificar o plexiglass (recomenda-se peróxido de hidrogênio a 3%, etanol a 7% ou qualquer desinfetante compatível e apropriado para plexiglass). Se necessário, substitua o plexiglass.
  3. Configure a câmera de alta velocidade com uma lente rápida e uma grande abertura (ou seja, valores menores de F-stop) para capturar uma grande quantidade de luz, pois isso ajuda a gravar os sinais fTIR (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: A lente não deve gerar distorções ópticas, particularmente nas bordas da imagem. As distorções ópticas podem ser testadas gravando um padrão conhecido (por exemplo, listras ou quadrados) e, em seguida, medindo o tamanho dos blocos no ImageJ/FIJI24 (use a ferramenta de linha e clique em Analisar > Medir). Por exemplo, um quadrado de 1 cm deve ter as mesmas dimensões de pixel no centro da imagem e nas bordas. As variações devem ser menores que 5%.
  4. Acenda a faixa de luz LED multicolorida a partir da caixa de luz de fundo.
  5. Acenda a faixa de luz LED branca da caixa de luz da passarela.
    NOTA: Um LED colorido também pode ser usado25 para facilitar a distinção da pegada/corpo/fundo.
  6. Com as luzes da sala apagadas, verifique a intensidade da luz de fundo da caixa e da passarela. Ajuste a intensidade, se necessário, usando um potenciômetro ou plástico semiopaco. Estes devem ser otimizados para que a intensidade do pixel aumente na seguinte ordem: corpo do animal < fundo < pegadas.
    1. Para verificar a intensidade de pixels do corpo/fundo/pegadas do animal, abra a sequência de imagens no ImageJ/FIJI24 e clique em Analisar > Medir. O sinal da pegada não deve estar saturado, pois isso impedirá que os limites da pegada sejam definidos (ou seja, dedos dos pés e coxins dos pés) (Figura 2 Suplementar).
  7. Ajuste o contraste da imagem da passarela no software de gravação de vídeo. O contraste pode ser ajustado de duas maneiras: escurecendo ou aumentando a iluminação na fita de LED ou ajustando a abertura da lente da câmera.
  8. Posicione a lente corretamente para estar na mesma altura e no centro do espelho refletor de 45° e perpendicular (90°) à passarela. Isso gerará uma imagem constantemente proporcional ao longo da passarela esquerda-direita.
    NOTA: Evite alterar a posição da câmera (distância, altura e orientação) nas várias sessões de gravação. Se necessário, marque o piso onde o tripé deve ser colocado. Isso manterá os recursos de imagem.
  9. Foque a lente na superfície do plexiglass. Isso pode ser testado usando um objeto não prejudicial que toque na superfície do plexiglass.
    NOTA: Com valores mais baixos de lente F-stop, a profundidade de campo se tornará menor, tornando o foco mais difícil.
  10. Certifique-se de que todas as configurações permaneçam inalteradas durante o ensaio, pois elas podem alterar a intensidade de pixels dos vídeos gravados.

2. Aquisição de vídeo

  1. Certifique-se de que os ratos estejam familiarizados com a sala e o aparelho antes do teste. Guarde pelo menos 1 dia para habituação (dia 0). Para evitar treinamento excessivo, realize o teste de MW em um dia diferente dos outros testes comportamentais (preferencialmente no dia seguinte).
  2. No software de gravação de vídeo, verifique se pelo menos 50 cm da passarela está visível.
  3. Ajuste as configurações de gravação para truncar a região da passarela. Isso reduzirá o tamanho do vídeo e otimizará a aquisição de vídeo.
  4. Tire uma foto ou um pequeno vídeo de uma régua normal antes de cada sessão. O número de pixels por centímetro será usado posteriormente na "janela de configurações" para calibrar os vídeos.
  5. Inicie a aquisição do vídeo e coloque o animal na borda da passarela, segurando a base da cauda para evitar lesões. Certifique-se de que os animais avancem para a borda extrema da plataforma. Execute as gravações de vídeo com pelo menos 100 quadros / s para garantir transições suaves da marcha.
    1. Se necessário, motive os animais a se moverem, batendo suavemente na parede da passarela ou estalando/batendo palmas nos dedos. No entanto, evite cutucadas físicas, pois isso pode afetar os resultados.
    2. Salve os vídeos diretamente como sequências de imagens no formato TIFF (com compactação LZW), JPEG ou PNG. Caso a câmera grave como um arquivo MOV bruto, converta os vídeos em sequências de imagens abrindo o arquivo no ImageJ/FIJI24 e clicando em Arquivo > Salvar como > sequência de imagens (ou usando outro software, como o LosslessCut25).
      OBS: A maioria dos animais inicia a deambulação imediatamente após serem colocados na passarela; Por isso, recomenda-se iniciar a aquisição do vídeo antes da colocação do animal.

3. Preparação dos vídeos para o software de rastreamento MW

  1. Filme bastante completo executado de cada mouse individual. O número de animais a filmar por condição e o número de tiragens completas devem ser decididos de acordo com cada desenho experimental. Uma corrida completa é quando o rato percorre os 50 cm completos da passarela sem paradas prolongadas (neste experimento, três corridas completas foram selecionadas).
    NOTA: Dependendo do software de aquisição de imagens, os vídeos podem precisar ser cortados para o menor ROI. Isso aumentará a velocidade de rastreamento e geração de saída.
  2. No ImageJ/FIJI24, selecione os quadros em que o mouse está na tela clicando em Image > Stack > Tools > Create a substack. O rastreamento no MW requer que a cabeça e a cauda estejam visíveis em todos os quadros. É possível, no entanto, fazer várias subpilhas a partir de uma única gravação de vídeo, que mais tarde representará cada execução.
  3. Salve cada subpilha separadamente em pastas diferentes clicando em Arquivo > Salvar como > sequência de imagens. O software MW mais tarde cria uma subpasta automaticamente em cada diretório toda vez que se começa a analisar uma execução.

4. Rastreamento

  1. Abra o MATLAB, adicione a pasta que contém o script MW ao diretório de trabalho e execute "MouseWalker.m" na linha de comando principal.
    NOTA: O uso do software MW no MATLAB permite que as mensagens de erro de rastreamento sejam visualizadas no console principal do MATLAB e os dados de saída desejados sejam selecionados (abrindo o arquivo de script principal "MouseEvaluate.m" e alterando as saídas para 1 ou 0: o arquivo excel, gráficos de passo a passo, traços de postura e padrões de marcha).
  2. Carregue a pasta de vídeo como o "Diretório de entrada". Pode-se também escolher a pasta de saída; no entanto, isso não é um requisito, pois o software MW cria uma nova pasta chamada "Resultados" automaticamente dentro do "Diretório de entrada".
  3. Usando as setas "<<", "<", ">>" e ">" verifique se os quadros de vídeo estão todos carregados corretamente dentro do software MW.
  4. Vá para a "janela Configurações", onde todos os parâmetros de calibração e limite estão localizados. Essas configurações podem mudar dependendo da intensidade de pixels do plano de fundo e das pegadas, bem como do tamanho mínimo do corpo e das pegadas, entre outros fatores (veja o exemplo na Figura Suplementar 2). Teste o efeito de alterar alguns parâmetros clicando no botão Visualizar .
    1. Use os diferentes estilos de plotagem, incluindo "corpo + pés + cauda", "somente corpo", "somente pés" e "somente cauda", para ajudar a discriminar partes do corpo após ajustar os parâmetros de limiar.
    2. Aproveite as ferramentas no painel do lado direito para fazer medições do brilho ou tamanho (usando os botões "brilho" e "régua", respectivamente). Todas as configurações podem ser salvas como "padrão", desde que a distância da câmera permaneça a mesma.
  5. Depois de ajustar os parâmetros de limite, verifique se o vídeo está pronto para rastreamento automatizado. Vá para o primeiro quadro e clique em Auto para iniciar o rastreamento. Essa etapa pode ser acompanhada em tempo real e leva alguns minutos, dependendo do tamanho do vídeo e do desempenho do computador.
    1. Se o rastreamento automático rotular incorretamente os recursos do corpo, cancele o rastreamento automático, insira novas configurações e reinicie o processo.
  6. Após a conclusão do rastreamento, verifique se é necessária uma correção manual. Para corrigir, use o painel do meio para selecionar ou desmarcar e indique a localização das pegadas da pata dianteira direita (RF), traseira direita (RH), dianteira esquerda (LF) e traseira esquerda (LH), cabeça, nariz, corpo (dividido em dois segmentos) e cauda (dividido em quatro segmentos). Salve as alterações pressionando o botão Salvar .
    NOTA: Todos os botões e a maioria dos comandos têm um atalho de tecla (consulte o manual associado para obter detalhes23). Para facilitar a rolagem de vídeo e a execução de atalhos de teclado, um controlador de hardware com botões programáveis e uma roda de vaivém como o Contour ShuttlePro V2 podem ser usados.
  7. Clique em Avaliar para gerar os arquivos de saída do vídeo rastreado. Dependendo da saída desejada selecionada (consulte a etapa 4.1), essa etapa pode levar alguns minutos.
  8. Verifique se todos os gráficos de dados de saída estão salvos na pasta "Resultados". Verifique a precisão do rastreamento examinando algumas das saídas gráficas, como os "Traços de postura", onde se pode verificar se todas as posições da pata são consistentes.
    1. Se um erro for identificado, corrija manualmente o rastreamento (se possível; caso contrário, elimine a pasta "Resultados" e execute o rastreamento automático novamente com novas configurações) e clique no comando Avaliar novamente.
  9. Verifique se todas as medidas quantitativas geradas pelo software MW estão salvas em planilha Excel e resumidas em "1. Info_Sheet". Verifique se as opções do Excel para as delimitações de fórmula correspondem ao script. O separador decimal deve ser ",", e os separadores de mil devem ser ";".
  10. Use o script "MouseMultiEvaluate.m" para reunir as medidas de todas as execuções em um novo arquivo para análise.
    1. Para começar, gere um arquivo de .txt contendo os caminhos de pasta para todos os vídeos (por exemplo, "Videofiles.txt"). Certifique-se de que cada linha corresponde a um único vídeo.
    2. Em seguida, escreva "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" na linha de comando. Um arquivo do Excel chamado "ResultSummary.xls" será gerado no diretório de trabalho (veja um exemplo no repositório do GitHub).
      OBS: A Figura 2 representa as saídas gráficas obtidas pelo software MW a partir dos vídeos de um animal gravado.

5. Fluxo de trabalho de análise de dados cinemáticos

  1. Edite a planilha do Excel gerada na etapa 4.10, que contém os dados para processamento usando os scripts Python fornecidos, de acordo com os seguintes pré-requisitos.
    1. No cabeçalho da primeira coluna, especifique a condição experimental. Nomeie cada linha após o nome do grupo/condição (indivíduos dos mesmos grupos devem ter o mesmo nome). O primeiro grupo deve ser o controle ou a linha de base (isso só é obrigatório para a plotagem do mapa de calor, etapa 5.6).
    2. Na segunda coluna, especifique o ID do animal. Isso é obrigatório, embora essa informação não seja usada para geração de parcela.
    3. Na terceira coluna em diante, escolha os parâmetros motores que serão utilizados para a análise. Certifique-se de que a primeira linha seja o nome do parâmetro (esses nomes aparecerão posteriormente nos gráficos).
  2. Abra o Anaconda Navigator e execute Spyder para abrir os scripts Python fornecidos.
    NOTA: Todos os scripts foram desenvolvidos com Python 3.9.13, foram executados com Spyder 5.2.2 no Anaconda Navigator 2.1.4 e estão disponíveis na Tabela de Materiais e no repositório GitHub (onde materiais adicionais são incluídos, como um exemplo de vídeo, um arquivo de exemplo do Excel e um documento de FAQs). É possível executar os scripts fora do Anaconda Navigator; no entanto, esta interface gráfica do usuário é mais amigável.
  3. Use o "Rawdata_PlotGenerator.py" para gerar os gráficos de dados brutos. Isso permitirá a visualização de cada parâmetro em função da velocidade.
    1. Abra "Rawdata_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
    2. Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
    3. Os gráficos de dados brutos aparecerão no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar as parcelas, clique no botão Salvar imagem ou Salvar todas as imagens no console de plotagem.
  4. Use o script "Residuals_DataAnalysis" para calcular os resíduos para análise de dados. Este script irá gerar um arquivo CSV com os cálculos dos resíduos para todos os parâmetros do motor.
    NOTA: Muitos dos parâmetros medidos da marcha extraídos pelo MW variam com a velocidade (por exemplo, velocidade de oscilação, comprimento do passo, duração do apoio, retidão do apoio e índices da marcha). Portanto, recomenda-se realizar um modelo de regressão de melhor ajuste de cada parâmetro individual versus velocidade para o experimento de linha de base e, em seguida, determinar os valores residuais para cada grupo experimental em relação a esse modelo de regressão. Os dados são então expressos como a diferença da linha residual normalizada26.
    1. Abra "Residuals_DataAnalysis.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Reproduzir .
    2. Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
    3. Salve o arquivo CSV na mesma pasta que os dados. É obrigatório que o controle (ou linha de base) seja o primeiro grupo no arquivo do Excel.
  5. Use o script "PCA_PlotGenerator.py" para executar uma análise de componente principal (PCA).
    OBS: Este método de redução de dimensionalidade não supervisionado é utilizado para gerar uma representação mais sucinta27,28,29 dos dados (Figura 3A, B). O script PCA inclui as seguintes etapas. Os dados são primeiramente pré-processados por centralização e escala, após o que o algoritmo PCA calcula a matriz de covariância para determinar as correlações entre as variáveis e calcular os autovetores e autovalores da matriz de covariância para identificar os componentes principais. Os dois ou três primeiros componentes principais são escolhidos para a representação dos dados em gráficos 2D ou 3D, respectivamente. Cada ponto nos gráficos corresponde a um animal e representa uma variável abstrata diferente. Pontos codificados por cores são usados para distinguir os grupos específicos. Como tal, agrupamentos de pontos refletem padrões de marcha semelhantes compartilhados pelos indivíduos correspondentes.
    1. Abra "PCA_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
    2. Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
    3. Verifique se os gráficos PCA 2D e 3D aparecem no console de plotagem (painel superior direito). Cada cor representa um grupo diferente, e a legenda aparece ao lado do gráfico. Para salvar o plot, clique em Salvar imagem no console de plotagem.
  6. Use "Heatmap_PlotGenerator.py" para gerar um mapa de calor. Certifique-se de que o gerador de mapa de calor crie uma tabela mostrando as diferenças estatísticas entre o grupo de linha de base (ou grupo de controle) e os outros grupos para cada parâmetro motor27 (Figura 4). Cada coluna representa um grupo, e cada linha se relaciona a um parâmetro motor específico.
    LEGENDA: A análise estatística foi realizada com ANOVA one-way seguida de post hoc de Tukey (para distribuições normais) ou ANOVA de Kruskal-Wallis seguida de post hoc de Dunn (para distribuições não normais). Outliers foram excluídos da análise. Os valores de p são representados por um código de cores, com tons de vermelho e azul indicando um aumento ou diminuição em relação ao controle (ou linha de base), respectivamente. A tonalidade da cor representa a significância estatística, com cores mais escuras apresentando maior significância e cores mais claras apresentando menor significância. corresponde a P < 0,001; ** corresponde a P < 0,01; e * corresponde a P < 0,05. O branco indica que não há variação.
    1. Abra "Heatmap_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Reproduzir .
    2. Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
    3. Selecione o tipo de dados na segunda janela automática: dados brutos ou dados residuais. Se uma opção não estiver selecionada, os dados residuais serão o padrão.
    4. O mapa de calor aparecerá no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar o plot, clique em Salvar imagem no console de plotagem.
      Observação : é obrigatório que o controle (ou linha de base) é o primeiro grupo no arquivo do Excel.
  7. Use "Boxplots_PlotGenerator.py" para gerar os boxplots. Essa ferramenta permitirá a geração de boxplots que representem a distribuição dos valores para todos os parâmetros motores de cada grupo (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
    Observação : cada caixa contém a mediana como a linha do meio, e as bordas inferior e superior das caixas representam os quartis de 25% e 75%, respectivamente. Os bigodes representam o intervalo do conjunto de dados completo, excluindo outliers. Outliers são definidos como qualquer valor que seja 1,5 vezes o intervalo interquartil abaixo ou acima dos quartis de 25% e 75%, respectivamente.
    1. Abra "Boxplots_PlotGenerator.py" no Spyder e execute o código clicando no botão Play .
    2. Selecione o arquivo do Excel a ser analisado e o nome da planilha na janela automática. Se o nome da folha não foi alterado, escreva "Sheet1".
    3. Selecione o tipo de dados na segunda janela automática: dados brutos ou dados residuais. Se uma opção não estiver selecionada, os dados residuais serão o padrão.
    4. Os boxplots aparecerão no console de plotagem (painel superior direito). Para salvar as parcelas, clique no botão Salvar imagem ou Salvar todas as imagens no console de plotagem.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM14. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função e se adapta a uma LM ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).

Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma coleção de parâmet...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a Laura Tucker e Natasa Loncarevic pelos comentários sobre o manuscrito e pelo apoio dado pelo Serviço de Roedores do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Os autores agradecem o apoio financeiro dos Prémios Santa Casa Neurociências - Prémio Melo e Castro para Investigação em Lesão Medular (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020), e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ao C.S.M. L.S. foi apoiado por um contrato de Investigador Principal Individual do CEEC (2021.02253.CEECIND). A A.F.I. foi apoiada por uma bolsa de doutoramento da FCT (2020.08168.BD). A.M.M. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da FCT (SFRH/BPD/118051/2016). O D.N.S. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH/BD/138636/2018).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
45º Espelho 
2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 16 cm de altura, 1 de cada ladoMisumi
2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 de cada ladoMisumi
1 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 83 cm de comprimentoMisumi
87 x 23 cm espelho Fornecedorgeral de vidro 
Enchimento de papelão preto de artigos de papelaria em geralUsamos 2, um com 69 x 6 cm e outro com 69 x 3cm para limitar o reflexo no espelho
Luz de fundo de fundo
109 x 23 cm plexiglass (0,9525 cm de espessura)Fornecedor
2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm), 20 cm de comprimento, 1 de cada ladoMisumi
fita de LED multicoloridaFornecedor
geral papel opaco branco para cobrir o plexyglassFornecedor
fTIR Base de suporte e postes
2 extrusão de alumínio (4 x 4 cm), 100 cm de alturaMisumi
60 x 30 cm placa de ensaio métricaEdmund Optics #54-641
M6 12 mm parafusosEdmund Optics 
Porcas sextavadas M6 e wahersEdmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura)Fornecedor109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura)
109 cm de comprimento Base-U-channel alumínio com 1,6 cm de altura x 1,9 cm de profundidade dobras grossas (para segurar o plexyglass)Fornecedor
2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm) 20 cm de comprimento, 1 de cada ladoMisumi
Enchimento de papelão preto de papelaria geral, usamos 2 enchimentos de cada lado para cobrir os limites do plexyglass, evitando bordas brilhantes
Parafusos M6 12 mmEdmund Optics 
Câmera de alta velocidade (em um tripé)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CEsta é uma recomendação. O requisito é gravar pelo menos 100 quadros por segundo
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor Sistemas e Instrumentação de Precisão, LLC.#0400
Lente
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Esta lente é recomendada, no entanto, outra lente pode ser usada. Certifique-se de que ele contenha uma grande abertura (ou seja, valores menores de F-stop), para capturar sinais fTIR
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 do Projeto Spyder
Parede de passarela 
2 grandes acrílicos rectagulares com 100 x 15 cmconveniência de bricolagem
2 laterais de acrílico trapeziano com 6-10 de comprimento x 15 cm de alturaconveniência de bricolage
GitHub Materials
Nome da pastaURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsScript para criar Boxplots
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsDocumentos adicionais
Mapade calor https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsScript para criar mapa de calor
Script Matlathttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Scriptscript MouseWalker matlab
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript para executar a análise de componentes principais
Gráficos de dados brutoshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsScript para criar gráficos de dados brutos
Análise Residualhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisCódigo para calcular resíduos de dados brutos
Fornecedor de ferragens em geralde hardware de papelaria geral de ferragens gerais de ferragens geraisFornecedor Colaboradores Qualquer loja de Qualquer loja de

References

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