Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A execução de programas motores complexos e de alta coordenação, como caminhada e corrida, é dependente da ativação rítmica dos circuitos espinhal e supra-espinhal. Após uma lesão medular torácica, a comunicação com os circuitos a montante é prejudicada. Isso, por sua vez, leva a uma perda de coordenação, com potencial de recuperação limitado. Assim, para melhor avaliar o grau de recuperação após a administração de fármacos ou terapias, há necessidade de novas ferramentas, mais detalhadas e precisas, para quantificar a marcha, a coordenação dos membros e outros aspectos finos do comportamento locomotor em modelos animais de lesão medular. Vários ensaios foram desenvolvidos ao longo dos anos para avaliar quantitativamente o comportamento de marcha livre em roedores; no entanto, eles geralmente carecem de medidas diretas relacionadas a estratégias de marcha escalonada, padrões de pegadas e coordenação. Para resolver essas deficiências, uma versão atualizada do MouseWalker, que combina uma passarela de reflexão interna total frustrada (fTIR) com software de rastreamento e quantificação, é fornecida. Este sistema de código aberto foi adaptado para extrair várias saídas gráficas e parâmetros cinemáticos, e um conjunto de ferramentas de pós-quantificação pode ser para analisar os dados de saída fornecidos. Este manuscrito também demonstra como esse método, aliado a testes comportamentais já estabelecidos, descreve quantitativamente déficits locomotores após lesão medular.
Introdução
A coordenação efetiva dos quatro membros não é exclusiva dos animais quadrúpedes. A coordenação membro torácico-membro pélvico em humanos continua sendo importante para a realização de diversas tarefas, como natação e alterações da velocidade durante amarcha1. Vários programascinemáticos e motoresdos membros2,3,4, bem como circuitos de feedback proprioceptivo5, são conservados entre humanos e outros mamíferos e devem ser considerados quando se analisam opções terapêuticas para distúrbios motores, como a lesão medular (LM)....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos de manuseamento, cirúrgicos e pós-operatórios foram aprovados pela Comissão Interna Molecular do Instituto de Medicina (ORBEA) e pela Comissão de Ética Animal (DGAV) de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia (Diretiva 2010/63/UE) e a lei portuguesa sobre cuidados com animais (DL 113/2013) sob a licença 0421/000/000/2022. Camundongos fêmeas C57Bl/6J com idade de 9 semanas foram utilizados para o presente estudo. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais e diminuir o sofrimento dos animais utilizados no estudo. O script MATLAB e a versão autônoma do software MW são de código aberto e estão disponíveis no GitHub
....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O sistema padrão de SNF descreve os déficits motores grossos após LM14. Devido à sua natureza subjetiva, outros ensaios quantitativos são geralmente realizados ao lado do SNF para produzir uma avaliação mais detalhada e fina da locomoção. No entanto, esses testes falham em mostrar informações específicas sobre ciclos de passos, padrões de passos e coordenação membro torácico-membro pélvico, o que é extremamente importante para entender como o circuito espinhal mantém a função e se adapta a uma LM .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui, o potencial do método de MouseWalker é demonstrado pela análise do comportamento locomotor após LM. Ele fornece novos insights sobre alterações específicas nos padrões de pisada, pegada e marcha que, de outra forma, seriam perdidas por outros testes padrão. Além de fornecer uma versão atualizada do pacote MW, as ferramentas de análise de dados também são descritas usando os scripts Python fornecidos (consulte a etapa 5).
Como o MW gera um grande conjunto de dados e uma coleção de parâmet.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Laura Tucker e Natasa Loncarevic pelos comentários sobre o manuscrito e pelo apoio dado pelo Serviço de Roedores do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Os autores agradecem o apoio financeiro dos Prémios Santa Casa Neurociências - Prémio Melo e Castro para Investigação em Lesão Medular (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020), e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ao C.S.M. L.S. foi apoiado por um contrato de Investigador Principal Individual do CEEC (2021.02253.CEECIND). A A.F.I. foi apoiada por uma bo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 45º Espelho | |||
| 2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 16 cm de altura, 1 de cada lado | Misumi | ||
| 2 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 de cada lado | Misumi | ||
| 1 extrusão de alumínio (2 x 2 cm), 83 cm de comprimento | Misumi | ||
| 87 x 23 cm espelho Fornecedor | geral de vidro | ||
| Enchimento de papelão preto | de artigos de papelaria em geral | Usamos 2, um com 69 x 6 cm e outro com 69 x 3cm para limitar o reflexo no espelho | |
| Luz de fundo de fundo | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0,9525 cm de espessura) | Fornecedor | ||
| 2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm), 20 cm de comprimento, 1 de cada lado | Misumi | ||
| fita de LED multicolorida | Fornecedor | ||
| geral papel opaco branco para cobrir o plexyglass | Fornecedor | ||
| fTIR Base de suporte e postes | |||
| 2 extrusão de alumínio (4 x 4 cm), 100 cm de altura | Misumi | ||
| 60 x 30 cm placa de ensaio métrica | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm parafusos | Edmund Optics | ||
| Porcas sextavadas M6 e wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura) | Fornecedor | 109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm de espessura) | |
| 109 cm de comprimento Base-U-channel alumínio com 1,6 cm de altura x 1,9 cm de profundidade dobras grossas (para segurar o plexyglass) | Fornecedor | ||
| 2 extrusão lateral de alumínio (4 x 4 cm) 20 cm de comprimento, 1 de cada lado | Misumi | ||
| Enchimento de papelão preto | de papelaria geral | , usamos 2 enchimentos de cada lado para cobrir os limites do plexyglass, evitando bordas brilhantes | |
| Parafusos M6 12 mm | Edmund Optics | ||
| Câmera de alta velocidade (em um tripé) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | Esta é uma recomendação. O requisito é gravar pelo menos 100 quadros por segundo |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Sistemas e Instrumentação de Precisão, LLC. | #0400 | |
| Lente | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | Esta lente é recomendada, no entanto, outra lente pode ser usada. Certifique-se de que ele contenha uma grande abertura (ou seja, valores menores de F-stop), para capturar sinais fTIR |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | do Projeto Spyder | ||
| Parede de passarela | |||
| 2 grandes acrílicos rectagulares com 100 x 15 cm | conveniência de bricolagem | ||
| 2 laterais de acrílico trapeziano com 6-10 de comprimento x 15 cm de altura | conveniência de bricolage | ||
| GitHub Materials | |||
| Nome da pasta | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script para criar Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Documentos adicionais | |
| Mapa | de calor https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script para criar mapa de calor | |
| Script Matlat | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | script MouseWalker matlab | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script para executar a análise de componentes principais | |
| Gráficos de dados brutos | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script para criar gráficos de dados brutos | |
| Análise Residual | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Código para calcular resíduos de dados brutos |
Referências
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
