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Artigo de método

Lesão não invasiva do ligamento cruzado anterior (LCA) induzida por compressão e imagem in vivo da atividade de protease em camundongos

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DOI:

10.3791/65249

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29 de setembro de 2023

 , 
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Neste artigo

Resumo

A lesão não invasiva do LCA é um método confiável e clinicamente relevante para iniciar a osteoartrite pós-traumática (PTOA) em camundongos. Este método de lesão também permite a quantificação in vivo da atividade da protease na articulação em momentos precoces pós-lesão usando sondas de infravermelho próximo ativáveis por protease e imagens de reflectância de fluorescência.

Resumo

Lesões articulares traumáticas, como ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) ou ruptura do menisco, geralmente levam à osteoartrite pós-traumática (ATP) dentro de 10-20 anos após a lesão. A compreensão dos processos biológicos precoces iniciados por lesões articulares (por exemplo, inflamação, metaloproteinases da matriz (MMPs), catepsinas proteases, reabsorção óssea) é crucial para a compreensão da etiologia da PTOA. No entanto, existem poucas opções para a mensuração in vivo desses processos biológicos, e as respostas biológicas precoces podem ser confundidas se técnicas cirúrgicas invasivas ou injeções forem usadas para iniciar a OA. Em nossos estudos de PTOA, usamos sondas ativadas por protease no infravermelho próximo comercialmente disponíveis combinadas com imagem de reflectância de fluorescência (FRI) para quantificar a atividade de protease in vivo após lesão não invasiva induzida por compressão do LCA em camundongos. Este método não invasivo de lesão do LCA recapitula de perto as condições de lesão clinicamente relevantes e é completamente asséptico, uma vez que não envolve a ruptura da pele ou da cápsula articular. A combinação dessas lesões e métodos de imagem nos permite estudar o curso temporal da atividade da protease em múltiplos momentos após uma lesão articular traumática.

Introdução

A osteoartrite é um problema de saúde generalizado que afeta milhões de pessoas nos Estados Unidos1. A osteoartrite pós-traumática (ATP) é um subgrupo da OA que é iniciada por uma lesão articular, como ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA), lesão do menisco ou fratura intra-articular2. A proporção de pacientes com OA sintomática que pode ser classificada como OTP é de pelo menos 12%3, e essa etiologia geralmente afeta uma população mais jovem do que aOA idiopática4. Modelos murinos de OA são ferramentas cruciais para investigar a etiologia da doença e potenciais tratamentos de OA em um prazo muito mais curto (4-12 semanas em modelos de camundongos em comparação com 10-20 anos em humanos). Entretanto, os métodos para iniciar OA em camundongos comumente envolvem técnicas cirúrgicas invasivas como transecção do LCA 5,6, remoção ou desestabilização do menisco medial 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, ou uma combinação dos dois 17,18,19, que não reproduzem condições de lesão clinicamente relevantes. Os modelos cirúrgicos também exacerbam a inflamação na articulação devido à ruptura da cápsula articular, o que poderia acelerar a progressão da OA.

Modelos não invasivos de camundongos com lesão do joelho oferecem a oportunidade de estudar alterações biológicas e biomecânicas em momentos precoces pós-lesão e podem produzir resultados clinicamente mais relevantes20. Nosso laboratório estabeleceu um modelo de lesão não invasiva que utiliza uma única sobrecarga de compressão tibial aplicada externamente para induzir a ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) emcamundongos 21,22,23,24. Este método de lesão não invasiva é capaz de produzir uma lesão articular asséptica sem interromper a pele ou a cápsula articular.

A imagem de reflectância fluorescente (FRI) é um método de imagem óptica que envolve excitar um alvo com luz infravermelha em um comprimento de onda específico e quantificar a luz refletida emitida em outro comprimento de onda. Sondas específicas de protease disponíveis comercialmente podem ser injetadas em modelos animais e FRI pode então ser usado para quantificar a atividade de protease em locais específicos, como a articulação do joelho. Este método tem sido amplamente utilizado para detecção in vivo de atividades biológicas, como inflamação. As sondas utilizadas para esta aplicação são fluorescentemente extintas até encontrarem proteases relevantes. Essas proteases então quebrarão um local de clivagem enzimática nas sondas, após o que produzirão um sinal fluorescente infravermelho próximo. Essas sondas e este método de imagem têm sido extensivamente validados e utilizados em estudos de câncer25,26,27,28 e aterosclerose29,30,31,32, e nosso grupo tem utilizado para estudos do sistema musculoesquelético para mensurar marcadores de inflamação e degradação da matriz23,24,33.

Juntas, a lesão articular não invasiva combinada com FRI in vivo e sondas ativáveis por protease fornecem uma capacidade única de rastrear a inflamação e a atividade da protease após uma lesão articular traumática. Essa análise pode ser feita horas ou até minutos após a lesão, e o mesmo animal pode ser avaliado várias vezes para estudar o curso temporal da atividade da protease na articulação. É importante ressaltar que esse método de imagem pode não ser viável quando combinado com modelos cirúrgicos de OA, uma vez que a ruptura da pele e da cápsula articular resulta em um sinal de fluorescência que confundiria o sinal de dentro da articulação.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Davis. Camundongos C57BL/6J machos com 3 meses de idade foram utilizados para o presente estudo.

1. Lesão não invasiva do LCA

OBS: A lesão do LCA produzida por uma carga compressiva aplicada externamente é um método simples e reprodutível que recapitula de perto as condições de lesão do LCA em humanos. Este protocolo foi escrito para um instrumento de estrutura de carga disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais), mas poderia ser adaptado para sistemas similares.

  1. Abra o software compatível com o instrumento de quadro de carga (consulte Tabela de Materiais) e selecione um arquivo de controle existente ou crie um novo arquivo.
  2. Ligue a alimentação do atuador.
  3. No menu de calibração, tare a leitura da força da célula de carga e ajuste o deslocamento do atuador para 0.
  4. Use isoflurano inalatório de 1%-4% em oxigênio para anestesiar os camundongos e garantir que os animais sejam totalmente anestesiados por pinça do dedo do pé e/ou pinça da cauda.
  5. Coloque o mouse em decúbito ventral na plataforma. Posicione a perna verticalmente entre dois dispositivos de carregamento (Figura 1) (ver Tabela de Materiais). Encaixe o pé no recorte do acessório superior e o joelho no copo do acessório inferior.
  6. Ajuste manualmente a altura do acessório inferior para aplicar uma pré-carga de 1-2 N (monitorada em tempo real na tela do computador) e aperte o parafuso ajustado para manter a posição. A pré-carga é necessária para manter a perna na posição correta antes de aplicar a carga de lesão.
  7. Aplique uma única carga compressiva a uma força alvo (~12-15 N) ou deslocamento do alvo (~1,5-2,0 mm).
    NOTA: A aplicação da carga a uma taxa de carregamento mais lenta (~1 mm/s) fornecerá um nível maior de monitoramento e controle em tempo real, mas provavelmente resultará em uma falha de avulsão da ACL. A aplicação de uma taxa de carregamento mais rápida (~200 mm/s) terá maior probabilidade de produzir uma lesão do LCA de substância média22. Se for determinada a ocorrência de uma fratura da tíbia ou outra lesão excessiva, eutanasiar o animal usando um método aprovado pela IACUC antes que o animal se recupere da anestesia.
    1. Defina a taxa de carregamento no arquivo de controle de software e confirme usando os dados de deslocamento de força.
      NOTA: A fratura óssea durante a carga de compressão tibial normalmente não é uma preocupação, uma vez que a força de fratura (~20 N) é consideravelmente maior do que a força de lesão do LCA. No entanto, isso deve ser monitorado com palpação, e exames de imagem (ou seja, radiografia) podem ser usados para confirmar que não ocorreram fraturas tibiais.
  8. A lesão é tipicamente indicada com um som ("click" ou "crunch") e uma liberação de força que é identificável nos gráficos de deslocamento de força (Figura 1C). Se uma taxa de carregamento mais lenta for usada, pare a carga compressiva imediatamente após a lesão para evitar carga adicional e possíveis danos a outros tecidos articulares.
    NOTA: A lesão do LCA geralmente ocorre aos 8-15 N, dependendo da massa corporal34. É importante definir uma força-alvo maior do que a força de lesão do LCA prevista.
  9. Confirmar a lesão do LCA utilizando um teste de gaveta anteroposterior35,36 ou avaliação comparável da instabilidade articular.
  10. Administrar uma dose dependente do peso do animal (por exemplo, 0,05-0,1 mg/kg SC ou IP de buprenorfina, ver Tabela de Materiais) a ratinhos pós-lesão, com duração e dose conforme recomendado e aprovado pela instituição de origem IACUC.
    NOTA: Os AINEs podem alterar a progressão da OTP após a lesão, portanto, não é recomendado que os AINEs sejam usados para o tratamento da dor neste modelo de lesão, a menos que seja um objetivo específico do estudo.

2. Preparação animal para imagens de FRI

NOTA: Para imagens ópticas, a pele de animais (particularmente a pele escura) é altamente eficaz em bloquear, absorver e espalhar a luz, portanto, a pele deve ser removida o máximo possível da área ao redor das articulações do joelho antes da imagem. Um creme depilatório é tipicamente mais eficaz para a remoção de pelos do que cortadores. Ratos nus ou sem pelos não exigem remoção de pelos. No entanto, a remoção de pelos é necessária para as cepas de camundongos mais comumente usadas (por exemplo, C57BL/6). Se possível, alimente camundongos com alimentos purificados de baixa fluorescência antes da obtenção de imagens. A ração padrão do rato contém clorofila, que auto-fluoresce com um comprimento de onda de cerca de 700 nm e pode afetar a recolha de dados do sistema FRI de infravermelho próximo.

  1. Anestesiar camundongos com isoflurano inalatório a 1%-4% em oxigênio. Mantenha os ratos em uma almofada de aquecimento tanto quanto possível e aplique pomada ocular para evitar a irritação dos olhos.
  2. Use um cotonete para aplicar creme depilatório (ver Tabela de Materiais) na face anterior (craniana) das pernas dos ratos ao redor da articulação do joelho.
  3. Deixe o creme descansar por ~1 min, em seguida, use lenços umedecidos para remover o creme e o pelo da perna. Repita se necessário.
  4. Uma vez que as articulações do joelho estão totalmente expostas sem nenhum pelo cobrindo a área, limpe as pernas com lenços umedecidos com álcool para remover qualquer creme depilatório restante.
    NOTA: O creme depilatório pode ser usado nos mesmos ratos várias vezes ao longo de um estudo, mas essas aplicações devem ter pelo menos uma semana de intervalo para evitar irritação desnecessária da pele.

3. Preparação da solução de sonda

  1. Se necessário, diluir a sonda ativada por fluorescência de acordo com as instruções do fabricante em solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS). Um frasco para injetáveis da sonda comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) normalmente contém 20 nmol em 0,15 ml de 1x PBS. Para diluir a solução no frasco para injetáveis, adicione 1,35 ml de 1x PBS para fazer 20 nmol em 1,5 ml de 1x PBS.
    NOTA: Após a diluição, um frasco para injetáveis pode ser utilizado para obter imagens de dez ratinhos quando se injeta 0,15 ml por rato.
  2. Vórtice a solução com uma velocidade mínima (~2000 rpm) por 30 s para garantir que a sonda seja dissolvida em solução e, em seguida, centrifugar brevemente para garantir que todo o líquido esteja fora da tampa.
    NOTA: A solução pode ser armazenada a 2-8 °C em um local protegido contra a luz por até 12 meses.

4. Injeção retro-orbital

NOTA: Consulte Yardeni e col. sobre os detalhes desse procedimento37.

  1. Use 1%-4% de isoflurano inalado em oxigênio para anestesiar camundongos e coloque o camundongo de lado com o focinho em um cone nasal.
  2. Use ~29 g de seringas de insulina para injeção de solução de sonda (preparada na etapa 3).
  3. Mantenha a seringa coberta antes de usar para evitar a exposição à luz.
  4. Ao administrar a injeção:
    1. Injete no interior do olho (carúncula lacrimal) e certifique-se de que o bisel da seringa está inclinado em direção ao olho. Para pessoas destras, recomenda-se injetar no olho direito do rato com o animal virado para a direita.
    2. Com a mão que não injeta, puxe suavemente a pele ao redor do olho para estabilizar a cabeça e fazer com que o olho se projete.
    3. Incline a seringa paralelamente ao corpo do rato.
    4. Passe suavemente a seringa pelo olho até encontrar resistência rígida; não tente passar deste ponto.
    5. Injete lentamente a solução da sonda no seio retro-orbital e, em seguida, puxe lentamente a agulha para fora da cavidade ocular. Se nenhuma solução sair com a agulha, a injeção é bem-sucedida.
    6. Aplique soro fisiológico ou pomada ocular no olho injetado.
      NOTA: Com base na documentação fornecida com as sondas de imagem, o tempo de imagem ideal é tipicamente entre 1 e 2 dias após a injeção da solução de sonda. Se possível, recomenda-se fazer uma triagem inicial para determinar o tempo ideal de imagem para cada aplicação específica. Os ratos metabolizarão a sonda injetada dentro de aproximadamente 7 dias, após os quais uma nova dose de solução de sonda precisará ser injetada se pontos de tempo adicionais forem desejados.

5. Imagem de reflectância de fluorescência

NOTA: Os procedimentos nesta seção são específicos para um sistema de imagem óptica disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Imagens semelhantes podem ser realizadas com sistemas comparáveis.

  1. Anestesiar camundongos com isoflurano inalatório a 1%-4% em oxigênio e colocar o animal em decúbito dorsal no sistema de imagem com o focinho em um cone nasal.
  2. Posicione o mouse com as pernas estendidas para que os joelhos fiquem levemente apontados no ar (pode ser necessário adescer os pés). É fundamental que um posicionamento consistente seja usado para todos os animais.
  3. Abra o software compatível (consulte Tabela de Materiais) no computador do sistema de geração de imagens; o "Painel de Controle de Aquisição" aparecerá.
  4. Para aquecer o sistema, clique em Inicializar e aguarde até que a luz de temperatura fique verde.
  5. Clique em Imaging Wizard e certifique-se de que a janela "Imaging Wizard" será exibida.
  6. Clique em Par de Filtros e verifique se a configuração está em 'Epi-Illumination' e pressione Avançar.
  7. Para selecionar as configurações corretas de excitação/emissão, encontre a sonda de interesse na lista suspensa. Se não for possível encontrar a sonda correta, localize o Nome 'Input Ex/Em' e digite manualmente o valor de Pico de Excitação e Pico de Emissão com base na propriedade da sonda a ser usada (por exemplo, para Pico de Excitação, digite 675, e para Pico de Emissão, insira 720). Clique em Avançar.
  8. Escolha Mouse para "Imaging Subject". Em "Parâmetros de exposição", verifique se as configurações automáticas estão marcadas e se as opções Fluorescente e Fotografia estão selecionadas. Selecione D-22,6 cm na lista de verificação de "Campo de visão". Pressione Avançar.
  9. A configuração da imagem pode ser vista e modificada no painel direito do "Painel de Controle de Aquisição". Verifique se todas as configurações estão corretas e pressione o botão Adquirir sequência . Depois que a imagem aparecer, confirme se a imagem teve exposição adequada. Caso contrário, altere a configuração de tempo de exposição e clique em Adquirir sequência novamente.
  10. Para analisar a imagem, posicione um círculo de região de interesse (ROI) com tamanho consistente sobre cada articulação do joelho na imagem em preto e branco (isso evita o posicionamento tendencioso com base em áreas de sinal fluorescente).
  11. Calcule a eficiência radiante total e/ou a eficiência radiante média para cada articulação do joelho. Se a eficiência radiante também for calculada nas pernas contralaterais, normalize os dados dividindo a medida da eficiência radiante da perna lesada pela medida da eficiência radiante da perna contralateral.
    NOTA: Se uma região de interesse com área consistente for usada para todos os joelhos, tanto a eficiência radiante total quanto a eficiência radiante média produzirão resultados semelhantes. O uso de eficiência radiante média é recomendado se forem usadas regiões de interesse com tamanhos diferentes. A normalização dos dados de eficiência radiante da articulação lesada com os dados do joelho contralateral não lesado fornecerá um controle interno para levar em conta quaisquer diferenças na quantidade de sonda injetada e na eficiência de entrega entre diferentes animais.

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Resultados

Após a aplicação de uma única força compressiva (1 mm/s até a lesão) na perna de camundongos machos C57BL/6J com 3 meses de idade, a lesão do LCA foi consistentemente induzida em todos os camundongos. A força compressiva média na lesão do joelho foi de aproximadamente 10 N (Figura 1).

A análise de IRF mostrou atividade proteásica significativamente maior nas articulações lesadas de camundongos submetidos à lesão não invasiva do LCA aos 7 dias após a lesão (

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Discussão

Esse protocolo estabeleceu e descreveu rigorosamente um método reprodutível e não invasivo para indução de lesão do LCA em camundongos20,21,24,33. Este método simples e eficiente de lesão pode ser realizado em apenas alguns minutos, o que facilita estudos de alto rendimento da PTOA. Este método de lesão também recapitula de perto as condições de lesão relevantes para a lesão do LCA humano. Os m...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele, parte dos Institutos Nacionais de Saúde, sob o Prêmio Número R01 AR075013.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x Tecido Salino Tampolado com FosfatoProtechPBS01-32Rou equivalente
Sistemade Ar Vaporizador de isoflurano com câmara de indução e cone de nariz
Buprenorfinapós-lesão 
Creme DepilatórioVeetB001KYPZ4Gou equivalente
AcessóriosAcessório de joelho, tornozelo e plataforma feitos sob medida
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262Também pode usar sistema de imagem óptica comparável
KimwipesKimberly-Clark Corporation06-666ou software Living
Image equivalente da Perkin Elmer
MaterialsTA InstrumentsElectroforce 3200 ou equivalente
ProSense680Perkin ElmerNEV10003Também pode usar outras sondas, como OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Seringa Estéril com AgulhaSpectrum Chemical Mfg. Corp.550-82231-CSSeringa Covidien 1 mL TB com 28 G x 1/2 pol. Agulha, Estéril ou equivalente
Célula de carga uniaxialTA Instruments20 N capacidade
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc.SI-0236ou
software WinTest equivalente Instrumentoscompatíveis com Electroforce 3200
de Anestesia Analgésico deSistemas de teste TA

Referências

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