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Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

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DOI:

10.3791/65263

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2 de fevereiro de 2024

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1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Neste artigo

Resumo

A infecção articular periprotética (PJI) causada por patógenos perigosos é comum na ortopedia clínica. Os modelos animais existentes não conseguem simular com precisão a situação real da PJI. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo PJI associado ao biofilme de Candida albicans para pesquisar e desenvolver novas terapêuticas para PJI.

Resumo

A infecção articular periprotética (PJI) é uma das infecções comuns causadas por Candida albicans (C. albicans), que preocupa cada vez mais cirurgiões e cientistas. Geralmente, biofilmes que podem proteger C. albicans de antibióticos e depuração imunológica são formados no local da infecção. A cirurgia que envolve a remoção do implante infectado, desbridamento, tratamento antimicrobiano e reimplante é o padrão-ouro para o tratamento da PJI. Assim, o estabelecimento de modelos animais de PJI é de grande importância para a pesquisa e desenvolvimento de novas drogas ou terapêuticas para PJI. Neste estudo, um fio liso de liga de níquel-titânio, um implante amplamente utilizado em clínicas ortopédicas, foi inserido na articulação femoral de um camundongo C57BL/6 antes que o C. albicans fosse inoculado na cavidade articular ao longo do fio. Após 14 dias, biofilmes maduros e espessos foram observados na superfície dos implantes sob microscópio eletrônico de varredura (MEV). Uma trabécula óssea significativamente reduzida foi encontrada na coloração H&E dos espécimes articulares infectados. Em resumo, foi estabelecido um modelo de PJI em camundongo com as vantagens de fácil operação, alta taxa de sucesso, alta repetibilidade e alta correlação clínica. Espera-se que este seja um modelo importante para estudos clínicos de prevenção de PJI relacionada ao biofilme de C. albicans.

Introdução

Candida albicans (C. albicans) reside comensalmente em muitas partes do corpo humano1, sendo também o patógeno oportunista mais comum que causa infecções fúngicas invasivas com risco de vida, especialmente em pacientes imunocomprometidos 2,3. C. albicans pode se transformar entre leveduras e micélios como um fungo polimórfico. O estado micelial apresenta maior virulência, maior adesão e invasão de células e tecidos 4,5. Além disso, C. albicans pode formar biofilmes na superfície de materiais biomédicos, como próteses, cateteres e stents 1,6,7. A densa estrutura tridimensional dos biofilmes restringe a infiltração de antifúngicos, expressa genes resistentes a fármacos e diminui o metabolismo das células fúngicas para resistir à depuração do sistema imune 6,7. Portanto, infecções relacionadas a biofilmes são bastante desafiadoras naclínica8.

Staphylococcus aureus, estafilococos coagulase negativa e enterobacter são os principais patógenos causadores da PJI9. Embora a incidência de PJI fúngica seja relativamente baixa (cerca de 1%)10, o custo do tratamento da PJI fúngica é maior11, o ciclo de tratamento é mais longo11 e a taxa de sucesso do tratamento é menor10 do que a PJI bacteriana. Nos últimos anos, a incidência de PJI fúngica vem aumentando ano a ano10. Candida PJI é responsável por 77%-84% dos PJI fúngicos10,12, e C. albicans é o mais comum em Candida (54%). Portanto, a PJI fúngica precisa ser estudada.

Atualmente, a PJI é tratada via cirurgia de revisão por (1) remoção do implante infectado, (2) desbridamento, (3) tratamento antimicrobiano e (4) reimplante. Após o desbridamento completo, um antibiótico contendo cimento ósseo é colocado, e o paciente é tratado com antibióticos sistemicamente por mais de 6 semanas para controlar efetivamente a infecção antes que um novo implante seja colocado13. No entanto, esse método não pode eliminar completamente patógenos nos tecidos, e infecções recorrentes tratadas com terapia antimicrobiana de longo prazo têm grande probabilidade de se desenvolver em cepas resistentes 14,15,16.

O estabelecimento de modelos animais de PJI é importante para a pesquisa e desenvolvimento de novas drogas ou terapêuticas para PJI. No desenvolvimento da PJI, grandes espaços mortos são formados ao redor da prótese, levando à formação de hematomas, que bloqueiam ainda mais o suprimento sanguíneo dos tecidos circundantes e prejudicam o efeito dos antibióticos 11,15. Devido à dificuldade em mimetizar o ambiente circundante da prótese, os modelos animais tradicionais não conseguem simular com precisão a real situação da PJI 17,18.

Neste trabalho, um modelo de PJI associado ao biofilme de C. albicans em camundongos foi construído usando um fio de titânio-níquel clinicamente amplamente utilizado para simular implantes articulares19,20. Este modelo de PJI apresenta as vantagens de fácil operação, alta taxa de sucesso, alta repetibilidade e alta correlação clínica. Espera-se que seja um importante modelo para o estudo da prevenção e tratamento da PJI relacionada ao biofilme de C. albicans.

Protocolo

Os animais foram comprados da Universidade Xi'an Jiaotong. Todos os procedimentos de experimentação animal foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional da Universidade Xi'an Jiaotong (número de aprovação: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Os camundongos foram mantidos por uma semana com 5 camundongos por gaiola. Eles tiveram acesso gratuito a comida e água. Os animais foram mantidos em temperatura ambiente (TR; 24 °C ± 1 °C) e ciclo claro/escuro (12 h/12 h) antes da realização do estudo.

1. Preparação do tampão e do equipamento

  1. Cultura celular de C. albicans
    1. Inocular uma colônia monoclonal de C. albicans (SC5314) a partir de um extrato de levedura em meio de placa de peptona dextrose (YPD) com uma alça inoculante em 5 mL de meio líquido YPD (YPD + 50 μg/mL carbenicilina).
    2. Agitar as células de C. albicans subsequentemente a uma velocidade de 220 rpm a 30 °C durante a noite.
    3. Centrifugar a suspensão a 400 x g por 5 min em RT. Ressuspender as células de C. albicans em soro fisiológico normal e diluir a concentração de células para 1 x 106 células/mL ajustando visualmente a turbidez para ser a mesma de um McFarland 0,5.
  2. Preparo de soro fisiológico
    1. Pesar 0,9 g de cloreto de sódio e dissolver em 100 mL de água deionizada para preparar soro fisiológico a 0,9%.
  3. Preparo de instrumentos cirúrgicos
    1. Autoclave (121 °C, 30 min) dos instrumentais cirúrgicos (tesoura, pinça, pinça hemostática, porta-agulhas, agulhas de sutura) e fio de liga titânio-níquel (cerca de 0,5 mm de diâmetro) antes do uso.

2. Estabelecimento do modelo PJI do rato

  1. Dividir aleatoriamente 30 camundongos C57BL/6 (machos, 15-20 g) em 3 grupos (10 camundongos/grupo), a saber, grupo controle, grupo implante branco (implante de fio de titânio-níquel sem infecção por C. albicans ) e grupo PJI (implante de fio de titânio-níquel com infecção por C. albicans ).
  2. Anestesiar os camundongos com inalação de isoflurano a 1-4% antes de remover os pelos do membro posterior esquerdo e desinfetá-los com iodo. A perda do reflexo de endireitamento e a ausência de resposta à estimulação dos pododáctilos confirmam a profundidade da anestesia. Durante a anestesia, aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e repor o calor durante a cirurgia e a recuperação.
  3. Para os camundongos do grupo controle, não forneça nenhum tratamento. Proporcione-lhes acesso gratuito a água e comida.
  4. Para os camundongos do grupo de implante branco e do grupo PJI, faça uma incisão longitudinal de 5 mm no joelho de cada membro posterior esquerdo com uma lâmina #10 ou uma navalha estéril para expor as articulações.
  5. Faça um orifício de 5 mm de comprimento no canal intramedular femoral inserindo uma agulha estéril (26 G).
  6. Insira um fio liso de liga de níquel-titânio (0,5 mm de diâmetro, 5 mm de comprimento) no orifício antes de ser cortado com tesoura (Figura 1).
  7. Para os camundongos do grupo do implante em branco, adicionar 2 μL de meio YPD ao longo do fio da liga de níquel-titânio gota a gota antes de fechar a ferida camada por camada usando uma sutura de náilon (0,15 mm de diâmetro).
  8. Para os camundongos do grupo PJI, inocular 2 μL de células de C. albicans (1 × 106 células/mL) no espaço articular de camundongos ao longo do fio de liga de níquel-titânio gota a gota antes de fechar a ferida camada por camada usando uma sutura de nylon.
  9. Acomode os ratos com acesso gratuito a água e comida por 14 dias. Administrar meloxicam por injeção subcutânea (4 mg/kg) a cada 24 h por até 3 dias.
  10. Após 14 dias, anestesiar os camundongos com isoflurano a 3% antes de sacrificá-los por deslocamento cervical.

3. Avaliação do modelo PJI

  1. Avaliação de infecções em órgãos importantes
    1. Coletar os rins, fígado e baço dos ratos após a eutanásia.
    2. Adicionar 500 μL de solução salina normal estéril em cada órgão e triturar os tecidos num homogeneizador a 4 °C.
    3. Adicionar 100 μL do homogeneizado preparado na etapa 3.1.2 a uma placa de YPD antes de a espalhar uniformemente com uma haste dobrada.
    4. Colocar as placas YPD invertidas numa incubadora a 37 °C durante 48 horas.
    5. Observe e conte o número de colônias visualmente.
  2. Observação de C. albicans e biofilmes nos implantes
    1. Corte cuidadosamente a pele sobre a articulação dos ratos com uma tesoura antes de recolher o implante com uma pinça.
    2. Manter os implantes imersos em solução de glutaraldeído a 2,5% para fixação a 4 °C por 48 h.
    3. Enxaguar os implantes com PBS estéril três vezes antes de imergir em solução de ácido ósmio a 1% por 3 h.
    4. Enxaguar os implantes com PBS estéril três vezes antes de imergir em soluções de etanol a 50%, 70%, 80%, 90% e 100% por 15 min para desidratação.
    5. Manter os implantes imersos em terc-butanol por 30 min três vezes antes de liofilizar os implantes.
    6. Fixar as amostras de implante no estágio de amostragem, revestir o implante com ouro (revestimento de 10 nm) e observá-lo sob microscópio eletrônico de varredura (MEV) sob alto vácuo e 1,5 kV.
  3. Análise patológica dos tecidos do fêmur
    1. Coletar os tecidos femorais com tesoura após a eutanásia dos camundongos.
    2. Imergir os tecidos do fêmur em solução de paraformaldeído a 4% para fixação a 4 °C por 48 h.
    3. Coloque os tecidos do fêmur em formalina a 10% por 1 semana.
    4. Desidratar os tecidos do fêmur imergindo-os em soluções de etanol a 50%, 70%, 80%, 90% e 100% por 15 min, respectivamente.
    5. Incorporar os tecidos desidratados do fêmur em parafina antes de seccioná-los em amostras de 4 μm usando um micrótomo.
    6. Corar os cortes de fêmur com hematoxilina e eosina, seguindo protocolo padrão antes da análise anatomopatológica21.

Resultados

A transferência das amostras para um meio de placa e a contagem de colônias após incubação noturna é comumente utilizada para avaliar a carga patogênica local próxima à lesão 22,23. Em nosso estudo, a cultura microbiana de amostras de fígado, rim e baço foi negativa, indicando que o modelo neste estudo levou apenas à infecção local e não sistêmica nos camundongos23.

As imagens de MEV dos implantes são mostradas na Figura 2. Nenhum C. albicans aderiu ou colonizou na superfície do fio de liga de níquel-titânio no grupo do implante em branco. Entretanto, biofilme maduro e espesso foi observado na superfície do fio de liga de níquel-titânio no grupo PJI, indicando o sucesso da construção do modelo de PJI relacionado ao biofilme de C. albicans em camundongos 14 dias após a cirurgia23.

A coloração H&E dos tecidos femorais é mostrada na Figura 3. No grupo controle foi observada uma estrutura trabecular óssea clara e completa, enquanto alguns defeitos do tecido trabecular ósseo nos tecidos femorais puderam ser vistos no grupo implante em branco (Figura 3, setas amarelas). No grupo PJI, o número de trabéculas ósseas diminuiu significativamente23. Estes resultados indicam que o modelo de PJI associado ao biofilme de C. albicans em camundongos foi estabelecido com sucesso com uma lesão patológica significativa do tecido do fêmur.

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Figura 1: Procedimento de implantação. O quadrado vermelho no painel esquerdo mostra o local cirúrgico onde o fio liso de liga de níquel-titânio está inserido. O painel à direita mostra uma porção do fêmur (círculo vermelho) com o fio de níquel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da superfície do implante nos grupos branco e PJI. Ampliações de 1000x (barra de escala = 500 μm) e 5000x (barra de escala = 100 μm) são mostradas como imagens representativas. Esse valor foi modificado com permissão de Mo et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Coloração H&E do tecido femoral. Imagens representativas de H&E do implante, modelo de PJI e grupos controle são mostradas na figura. O grupo controle apresenta uma estrutura trabecular óssea clara e completa. O grupo dos implantes em branco apresentava alguns defeitos do tecido trabecular ósseo nos tecidos femorais (setas amarelas). Entretanto, o número de trabéculas ósseas diminuiu no grupo PJI. As ampliações apresentadas são 200x (barra de escala = 150 μm) e 400x (barra de escala = 75 μm). Esse valor foi modificado com permissão de Mo et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A infecção causada pela contaminação do instrumental cirúrgico ou do ambiente cirúrgico durante a cirurgia é a principal causa da maioria das infecções de implantes 24,25,26,27. Portanto, um modelo de PJI relacionado ao biofilme de C. albicans em camundongos foi construído neste estudo. Comparado ao modelo tradicional de PJI, no qual partículas estéreis de aço inoxidável suspensas em solução salina foram usadas como implante, um fio de liga de níquel-titânio, um material de implante comumente usado, foi usado neste estudo para simular o contato entre C. albicans, materiais de implante e o osso, o que é mais semelhante à situação clínica.

O modelo de PJI descrito neste artigo pode perfeitamente simular o ambiente fisiológico de PJI em clínicas. Este modelo só pode ser usado para estudar a infecção durante a implantação, em vez de infecção transmitida pelo sangue posteriormente.

C. albicans pode ser inoculada de duas maneiras. Uma é a inoculação direta de C. albicans no local do implante durante a cirurgia28 e a outra é a cultura dos implantes com C. albicans por um período de tempo para que biofilmes maduros sejam formados na superfície do implante antes do implante cirúrgico29. O primeiro método foi escolhido neste estudo devido ao seu número preciso de inoculação de patógenos, o que resultou em diferenças mínimas entre os grupos e uma avaliação mais objetiva dos tratamentos subsequentes. Além disso, o primeiro método é mais consistente com a situação clínica.

Nesse protocolo, a inserção do implante é de difícil execução. O operador tem que praticar várias vezes para garantir que o implante seja inserido na articulação em vez de subcutâneo ou intramuscular. Além disso, o número de inoculação de C. albicans é vital para a repetibilidade do modelo PJI. C. albicans deve ser cuidadosamente misturado via vórtice para garantir a precisão do número de inoculação. Além disso, C . albicans deve ser adicionado ao longo do fio de liga para simular a via de infecção na situação clínica.

Os biofilmes puderam ser detectados 7 dias após a infecção bacteriana, após o que os biofilmes aumentaram gradualmente e atingiram um platô no 14ºdia 30. Portanto, o sucesso do modelo PJI estabelecido foi inspecionado no14º dia. A colonização de C. albicans e a formação de biofilme na superfície do implante foram inspecionadas por MEV. As lesões teciduais ao redor do implante causadas por infecção local foram avaliadas por análise anatomopatológica após coloração de H&E. Estudos têm demonstrado que a osteólise periprotética é uma característica importante devido à PJI31. Assim, esses indicadores também são vitais na avaliação de métodos terapêuticos para a prevenção e tratamento da PJI32.

A cultura microbiana é comumente usada para detectar infecção microbiana em clínicas e laboratórios. Portanto, neste estudo, foi realizada a cultura microbiana do implante, tecidos ao redor dos implantes, fígado e outros órgãos vitais. Para o implante, foi aplicada ultrassonografia para remover a C. albicans aderida à superfície do fio da liga titânio-níquel. Em seguida, as C. albicans foram enriquecidas por centrifugação antes do cultivo microbiano. Entretanto, foi encontrado resultado negativo, incompatível com o resultado da EPM (Figura 2). O resultado da MEV mostrou que C. albicans aderiu à superfície do fio da liga titânio-níquel. Portanto, o resultado da cultura microbiana foi um falso negativo, o que pode ser atribuído à forte adesão de C. albicans ao fio da liga titânio-níquel; ultra-sônico não conseguiu esfoliar com sucesso o C. albicans do implante. Da mesma forma, a cultura microbiana dos tecidos ao redor de implantes e órgãos vitais também foi negativa. Há duas possíveis razões: (1) O número de C. albicans inoculados neste estudo foi de apenas 2000 UFC, o que pode ser muito pequeno para invadir o tecido circundante e o sistema durante o período experimental; (2) A sensibilidade do método de extração e separação de patógenos dos tecidos é baixa. Um relato publicado anteriormente sugere que a cultura microbiana poderia facilmente mostrar resultados falso-negativos e tratamentos tardios33. A coloração de Grocott-Gomori pode ser utilizada para determinar a formação de hifas no osso e na articulação32. Também pode ser útil aumentar a quantidade de inóculo, prolongar a duração experimental ou manter os camundongos em estado imunossuprimido antes da cirurgia32. No entanto, deve-se notar que a infecção de longo prazo pode levar a infecção profunda ou mesmo infecção sistêmica. Assim, o período experimental deve ser planejado de acordo com a finalidade específica.

Em resumo, este estudo criou um modelo bem-sucedido de PJI associado ao biofilme de C. albicans , que pode ser de grande importância para a pesquisa da prevenção e tratamento da PIJ associada ao biofilme de C. albicans .

Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros ou relações pessoais concorrentes conhecidos que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Somos gratos pelo apoio financeiro da Fundação de Ciências Naturais da Província de Shaanxi (número de concessão 2021SF-118) e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (números de concessão 81973409, 82204631).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 ° Refrigerador CElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
ÁgarPequim Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Balanças analíticasShimadzuATX124
Autoclaves EsterilizadorSANYOMLS-3750
CarbenicilinaAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon microscópio óptico vertical NikonEclipse Ts2-FL
GlicoseMacklin 
Anel de inoculaçãoThermo Scientific251586
IsofluranoRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldeídoBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Máquina de anestesia multicanal para pequenos animais RWD R550RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubadora de TemperaturaShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Gerador de água ultrapuraHeal ForceNW20VF
Máquina de ultrassomDo-ChromDS10260D
Extrato de leveduraThermo Scientific  OxóideLP0021B
D823520

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