Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Resumo

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos são uma ferramenta chave para o estudo da complexa biologia de macrófagos teciduais. Como células primárias, elas modelam a fisiologia de macrófagos in vivo mais de perto do que linhagens celulares de macrófagos imortalizadas e podem ser derivadas de camundongos já portadores de alterações genéticas definidas. No entanto, a interrupção da função gênica em BMDMs permanece tecnicamente desafiadora. Aqui, fornecemos um protocolo para edição eficiente do genoma CRISPR/Cas9 em BMDMs, que permite a introdução de pequenas inserções e deleções (indels) que resultam em mutações frameshift que interrompem a função do gene. O protocolo descreve como sintetizar RNAs de guia único (sgRNA-Cas9) e formar complexos de ribonucleoproteínas (RNPs) purificados de sgRNA-Cas9 que podem ser liberados por eletroporação. Ele também fornece um método eficiente para monitorar a eficiência da edição usando o sequenciamento de rotina do Sanger e um programa de análise on-line disponível gratuitamente. O protocolo pode ser realizado em até 1 semana e não requer a construção de plasmídeos; normalmente resulta em 85% a 95% de eficiência de edição.

Introdução

Os macrófagos são células imunes inatas que desempenham papéis críticos no reparo tecidual e na imunidade ^1,2. Linhagens celulares de macrófagos imortalizadas, como células RAW 264.7 de camundongos ou células THP-1 humanas, têm várias características benéficas, incluindo crescimento robusto e facilidade de ruptura gênica por meio da entrega de vetores para interferência de RNA ou CRISPR/Cas9 ^3,4. Entretanto, a transformação oncogênica altera drasticamente sua fisiologia, o que resulta na ativação aberrante de algumas vias e respostas silenciadas de

Protocolo

1. Projeto do sgRNA

Observação : esta etapa descreve a seleção das sequências de destino e o design dos sgRNAs. É útil projetar guias que estão no primeiro grande éxon de codificação, para que qualquer proteína traduzida seja interrompida no início do quadro de leitura aberto. Também é útil selecionar sequências de destino que estejam dentro do mesmo exon, pois isso agilizará a análise da eficiência de edição (etapa 6). Os exemplos de edição do genoma fornecidos com este protocolo usaram sgRNAs visando o primeiro exon do gene Src e o gene Cblb , bem como no locus Rosa26 não-codificante do genoma do ....

Resultados

O molde IVT é um produto de PCR de 127 pb (Figura 1B). O produto da TIV de comprimento total é um RNA de 98 nt, que migra de forma semelhante a um fragmento de DNA de fita dupla de 70 pb (Figura 1C).

Após a eletroporação, as células deveriam estar >90% viáveis, com contagem total de células de >70% do número inicial de células. O pool resultante de células mutantes deve ter um conjunto diversificado de indels, começando perto do.......

Discussão

A edição do genoma usando complexos Cas9-sgRNA eletroporados permite a interrupção efetiva da função gênica em BMDMs. A eficiência de edição varia de acordo com a sequência alvo e o gene. Normalmente, quatro a cinco sgRNAs são geralmente rastreados para identificar um que é altamente ativo. Alguns loci têm menor eficiência de edição, provavelmente devido à estrutura da cromatina. Nesses casos, várias modificações podem ser feitas para aumentar a eficiência da edição. A co-entrega de dois sgRNAs ativos para o mesmo éxon r.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha Celular 3T3-MCSF	Presente de Russell Vance	não aplicável
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer	IDT	1075915
Ampure XP Reagent Beads	Beckman Coulter	A63880
Fosfatase alcalina intestinal de bezerro	NEB	M0525S
DNase	NEB	M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 e 0,5mM MgCl2)	Thermo Fisher	14040-133
DPBS -Ca/Mg	Thermo Fisher	14190-144
ExoI	NEB	M0293S
Soro de bezerro fetal (FCS)	Corning	35-015-CV
Herculase DNA polimerase e tampão	Agilent	600677
HiScribe T7 Kit de síntese de RNA de alto rendimento	NEB	Tubos cônicos E2040S
LoBind 15 mL	Eppendorf	30122216
LoBind Eppendorf tubos 2 mL	Eppendorf	22431102
NEBuffer r2.1	NEB	B6002S
Sistema de Transfecção Neon	Thermo Fisher	MPK5000, MPP100, MPS100
Sistema de Transfecção Neon 10 uL Pontas	Thermo Fisher	MPK1025 ou MPK1096
PBS + 1mM EDTA	Lonza	BE02017F
Proteinase K	Thermo Fisher	EO0491
rCutSmart Buffer para ExoI	NEB	B6004S
Ribolock	Thermo Fisher	EO0384
Corante de carregamento de RNA	NEB	B0363S
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
S. pyogenes Cas9-NLS	University of California Macro Lab	não aplicável	Disponível para investigadores não UC por meio de  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, IDT de 3ª geração modificado		1081059
SAP	NEB	M0371S